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f 转到水稻和胡萝h 中。p c r 及斑点杂交检测证明了k g f 基因已经整合到植株的基因组中：反转录p c r 及w e s t e r nb o t t i n g 检测证明了k g f 基因在转化植株中表达。本实验中，获得了 人k g f 的转基因植物，为将来k g f 转基因植物的应用和开发奠定了工作基础。 关键词：角质细胞生长因子：重叠延伸p c r ：植物反应器；植物基因工程 人角质细胞生长因子转化胡萝h 和水稻初探 a b s t r a c t o n eo ft h eh o t t e s ts t u d yi np l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n gi st h a tu s i n g t h ep l a n tb i o r e a c t o rt op r o d u c tt h eu s e f u lm e d i c i n eo ra n t i b o d y c o m p a r e d w i t ht h em i c r o b el i k efc o l 工p l a n ta sab i o r e a c t o ri se d i b l e ，c o s t l o w ，n e e d e dn op u r i f i c a t i o n ，a n dh a v et h ee x a c tm o d i f i c a t i o na n dp r o c e s s k e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o r ，w h i c hi sc o m p o s e d w i t h1 9 4a m i n oa c i da n dh a s t h r e ee x t r o n sa n dt w oi n t r o n s ，i so n eo ft h ec e l lm i t o g e n a c t i v a t e d f a c t o r s k g fa c t sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h eg r o w t ha n dr e n e wo fe p i d e r m a l c e l l i tc a na c c e l e r a t et h eb l a d d e r 、n e p h r i d i u m 、i n t e s t i n e sa n dc o r n e a l e p i d e r m a lw o u n dh e a l i n g a l s o ，i t c a na l l e v i a t et h ec h e m o t h e r a p ya n d i r r a d i a t i o ni n d u c e di n j u r e s o m er e s e a r c h e sa b o u tt h ee x p r e s s i o no fk g f h a v eb e e nr e p o r t e d w h e r e a si ti sf e wr e p o r t e dt h a tt oe x p r e s sk g fw i t h p l a n tb i o r e a c t o r s oi t i sn e c e s s a r yt ou s et h ep l a n t ，s u c ha sr i c ea n d c a r o t a ，t oe x p r e s st h ek g f f i r s t l yw es y n t h e s i z e dt h ep o l y n u c l e o t i d et h e no b t a i n e de x t r o nl o f h u m a nk g fb yt h ep r o l o n g a t i o na n dp c ru s i n gt h ep 0 1 y n u c l e o t i d e s e c o n d l y u s i n gh u m a nl u n gd n aa st e m p l a t e ，w ea m p l i f i e de x t r o n2a n de x t r o n3o f k g f ，t h e nc o n j o i n e dt h r e e e x t r o n s b yo v e r l a p e x t e n s i o np c r t h i r d l y c a m v 3 5 s k g f n o sw a so b t a i n e da f t e rl i g a t i o nk g fw i t hc a m v 3 5 sa n dn o s f i n a l l yp b l l 3 0 1 k g fw a sc o n s t r u c t e da f t e ri n s e r t i n gc a w 3 5 s k g f n o si n t o p b l l 3 0 1 i nt h i ss t u d y ，w ei n t r o d u c e d h u m a nl ( g fg e n ei n t or i c ea n dc a r o t a m e d i a t e db ya g r o b a c t o r i u m i ti sp r o v e dt h a tk g fg e n eh a si n s e r t e d i n t o t h ep l a n tg e n o m eb yt h ep c ra n ds o u t h e r nd o tb o t t i n gd e t e c t i o n ：i ti sa l s o p r o v e dt h a tt h ep l a n te x p r e s st h ek g fb yr t p c ra n dw e s t e r nb o t ti n g d e t e c t i o n t h r o u g h t o u rs t u d y ，w eo b t a i n e dt h ep l a n tt h a te x p r e s st h e k g f i tc a nb et h eg r o u n d w o r kf o rt h ea p p l i c a t i o na n de x p l o i t a t i o no fk g f t r a n s g e n ep l a n t 关键词：k e r a t i n o e y t eg r o w t hf a c t o r ：o v e r l a p e x t e n s i o np c r ；p l a n t 2 垒堕塑塑生堡里三箜些塑蔓! 塑查受塑堡 b i o r e a c t o r ：p l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n g 3 人角质细胞生长因子转化胡萝h 和水稻初探 l 、前言 1 、1 植物反应器概述 1 、l 、l 植物反应器的定义及其优点 植物生物反应器，就是利用植物这个系统，包括植物细胞、组织器官，以及整 株植物为工厂来生产具有商业价值的生物制品包括疫苗、抗体、药用蛋白等。广 义上讲，不仅仅指经基因工程改造的植物细胞、组织器官以及整株植物，也包括天 然的植物“1 。如在1 9 8 9 年，a n d r e wh i a t t 等人将鼠的杂交瘤细胞中提取m r n a 转入 烟草中，并检测到免疫球蛋白的表达。1 。在1 9 9 2 年m a s o n 等人则将乙肝表面抗原 基因在烟草中表达，显微镜观察下的表达蛋白颗粒与人血清和酵母表达的乙肝表 面抗原颗粒具有相同的结构，预示着植物中表达的蛋白同样可以作为疫苗。1 。这 些例子即是以植物为反应器生产药用蛋白的较早研究。 由于植物自身的特点决定了植物作为反应器具有以下几个方面的优点： ( 1 ) 真核表达系统翻译后正确的修饰、加工：目前，利用基因重组技术生产 外源蛋白主要是以大肠杆菌为代表的原核生物。由于大肠杆菌表达系统属于原核 生物表达系统，不能进行糖基化、正确折叠等蛋白翻译后加工步骤，使许多真核 基因无法利用该系统生产。蛋白质表面的糖链能够影响蛋白的药物动力学作用 ( 反应速率和清除部位) 、生物活性( 糖基结合和蛋白构型) 、稳定性，对蛋白酶 的易感性、水溶性、凝集性、免疫原性，剂量需求和产品效能( 产出、稳定性和 设备利用) 等。蛋白翻译后的正确折叠是蛋白发挥功能的前提。已有研究指出如 蛋白不正确折叠，将导致蛋白功能的丧失，从而引发相应的疾病。如帕金森症 ( p a r k i n s o n ) 和阿尔默海茨症( a l z h e i m e r ) 的神经细胞损伤与蛋白能否正确折 叠相关。而以植物为反应器生产外源蛋白能进行糖基化，正确折叠，是一种较为 优秀的真核表达系统。 ( 2 ) 生产成本低：传统的蛋白的生产，都是应用基因工程技术在哺乳动物细 胞、酵母细胞或原核细胞中表达。在此细胞中表达目的蛋白都需要较为昂贵的细 胞培养基，同时所需的反应设备，发酵设备也较为昂贵。而植物是自养生物，只 需给予一定的光、热、温度和养料，便可以大量的生产。光、热、温度和养料自 然天成，可谓“一文不值”，如此就决定了以植物反应器生产疫苗、抗体、药用 蛋白等生物制品的成本将大大的低于用传统的哺乳动物细胞、酵母细胞或原核细 4 人角质细胞生长因子转化胡萝h 和水稻初探 胞生产的成本。再者，传统的生产工艺需要纯化。纯化所需的仪器、试剂和人力 将极大的提高了其生产成本，而决大多数的植物可以直接使用，并不存在纯化的 需要。这又对植物反应器生产的“廉价成本”再填一笔。“3 据估算，在2 5 0 平方米 的温室中利用苜蓿生产i g g 的成本约为5 0 0 6 0 0 $ g ，与之相比从杂交瘤中提取 抗体的成本为5 0 0 0 美元屈”1 。 ( 3 ) 生产工艺简单：植物的下游生产既是农业的大面积种植过程，而此过程 人类有着千年的历史经验。相对于细菌的细胞培养和哺乳动物的细胞培养，种植 植物是“轻而易举”之事。传统的基因工程技术生产生物制品需要在特定的仪器、 工厂中进行，而以植物反应器生产生物制品只需一定的自然环境便可进行生产。 这种自然天成的“生产车间”无疑是植物反应器生产技术的又一大亮点。 ( 4 ) 存储、使用简单方便：当今世界发达国家已经获得各种疾病的疫苗及治 疗药品，并大范围的进行接种预防、治疗，而在贫穷落后国家疫苗的接种还是 项奢侈的卫生项目。传统的疫苗、药物等生物制品需要冷冻运输。及相关医务人 员进行注射接种等，这大大的提高了药物在贫穷国家使用的困难性。植物反应器 生产药物制品则可以解决此问题。植物可以大面积的种植，而且产物储存于种子、 叶子、果实、块茎或块根中，运输过程无需冷冻储存，使用则决大多数可以直接 吃食抑或直接药敷。例如乙肝疫苗的生产、接种，h u g hs m a s o n i 作组在经过 多年的研究将乙肝表面抗原在烟草、马铃薯中表达，并用于老鼠的喂食免疫实验。 试验中将含有5 5 1 1g t , 肝表面抗原的马铃薯以1 0ug 的霍乱毒素为佐剂对老鼠 进行喂食，每周一次进行3 次免疫，3 周后可以在老鼠的血清中检测到乙肝抗体”1 。 c a r o l0 t a c k e t 等人则将产肠毒素的l t b 位点氨基酸序列在玉米中表达，并让9 名志愿者每人每次吃食2 1g 玉米材料( 共含有1m gl t - b ) ，每周一次，共三次。 而后的血清检测中，9 个中有7 个发现抗l t bi g g ，同时9 个种有4 个发现i g a ”。 这些研究将使得不久的将来存储、使用方便的植物药物得以大范围的使用。 ( 5 ) 使用安全：当前的重组蛋白生产系统主要包括原核细胞和真核细胞两大 类，这两类表达系统在重组蛋白产量、产品的可靠性和安全性等方面各有优缺 点。尽管细菌表达系统产量高，但细菌本身是人类的病原体，它生产的蛋白必须 经过严格的纯化才能应用。虽然动物细胞表达系统的应用可以解决生物活性问题， 但动物培养细胞可能污染的动物病毒对人类健康也可能造成潜在危害。与此不同， 人角质细胞生长因子转化胡萝h 和水稻初探 植物是人类的主要食品来源，植物中的寄生微生物或植物病毒不感染人类，对 于工程植物体可以通过栽培、育种等途径对其生长释放及产物进行控制。因此， 植物生产系统是较为安全的生产系统。1 9 9 7 年，c h o n g 等人在植物中表达了人乳 b c a s e i n 蛋白0 1 ，并且蛋白的活性与天然蛋白相似，使用安全。在j u lj a nk 一c m a 等人在植物生产抗体的口服实验中，6 0 个病人在口服植物生产的抗 s t r o p t o c o c e u s m u t s n si g a 抗体后没有出现过敏反应。并且发现其效果好于小 鼠产生的抗体。这有助于消除对植物抗体作为人类药物可能存在免疫原性和致敏 性等问题的忧虑。同时人类食物中普遍存在植物糖蛋白，因此对多数人而言，植物 抗体、药用蛋白和植物疫苗等的应用不会存在危险。 1 、1 、2 植物反应器的研究现状及应用前景 由于植物具有以上的优点，所以早在2 0 世纪8 0 年代末就提出了分子农业的 概念，从此分子农业便成为转基因植物领域的一大研究热点。目前，转植物反应 器的研究已经取得了一定的成果。主要集中在以下几个方面的研究：植物抗体、 植物疫苗和利用植物生产药用蛋白。 1 ) 植物抗体 抗体( a n t i b o d y ) 是生物体液中的一系列球蛋白，称为免疫球蛋白 ( i 衄u n o g l o b u l i n ，i g ) 。它们可介导动物的体液免疫反应，在植物体内表达编码 抗体或抗体片段( 如f a b 片段和f v 片段) ，获得的产物就称为植物抗体“”。1 9 8 9 年h i a t ta 等人将小鼠杂交瘤细胞中的m r n a 反转录得到的c d n a 转化烟草叶片并 分化出转化苗。在转化的植株中检测到抗体表达。并且转化植株中产生的抗体与 杂交瘤细胞产生抗体的抗原抗体识别位点是一样的。这表明了在烟草中表达抗体 是很有用且高效的0 1 。而后在1 9 9 5 年m aju ，h i a t ta 等人又在烟草中表达了4 种哺乳动物抗体，并证实这四种抗体可以识别天然细菌的表面抗原位点。杂交瘤 技术需要两种不同的细胞进行杂交才能得到单克隆抗体，而利用植物作为反应器 生产单克隆抗体则只需要单种细胞就可以进行，无需杂交过程。而且植物反应器 适宜大规模的生产，这是杂交瘤技术所不能达到的“。利用植物表达抗体最大的 优点就是廉价。一般的单克隆抗体的生产是利用杂交瘤技术，此技术前期工作技 人角质细胞生长因子转化胡萝卜和水稻初探 术含量要求较高，生产过程无菌操作要求严格，而且无法进行很大规模的生产。 而植物自身的特点克服了杂交瘤技术上述的缺点，从而大大低降低单克隆抗体生 产成本及提高了单克隆抗体的生产产量。 2 ) 植物疫苗 1 9 7 8 年是生物医学科学史上具有里程碑意义的一年，人类发明了应用疫苗 接种预防天花的新技术。在接下来的两个世纪中，疫苗的研制和应用取得了长足 的发展。目前，疫苗已成为人类成功有效的预防疾病的手段之一。 传统的疫苗包括减毒活病原疫苗和灭活病原疫苗。减毒活病原疫苗是指通过 病原物的连续继代，毒性大大衰减，使其对宿主动物丧失致病能力但能使宿主产 生免疫应答而制备的疫苗。减毒疫苗具有剂量小、保护时间长、效果好、价格低 等多种优点。但是这种疫苗研制周期长，要使病毒繁殖很多代，有时甚至需要上 百代；减毒疫苗是对一种动物的减毒，并不能保证对其他动物的减毒：经传代后 毒力可能恢复：一些病原微生物难于减毒。灭活病原疫苗是指以含病原的材料通 过物理或化学的方法处理，使其丧失感染性或毒性而保持有良好的免疫原性而制 备的疫苗。灭活疫苗比减毒疫苗安全且制备周期短。但灭活疫苗存在一些局限性： 效果差且来源受限制，化学灭活疫苗的制备需要组织大量病毒；需要大量设备； 灭活疫苗产生的抗病原免疫幅度比活病毒感染动物产生的抗体要弱。 基因工程疫苗包括重组亚单位疫苗、基因缺失疫苗及核酸疫苗等。重组亚单 位疫苗是将激发机体免疫反应的病原体基因定位并克隆出相应基因，重组到其他 的生物体内，在一定的表达系统中表达出具有免疫原性的产物，而制备出专一性 强，安全的基因工程疫苗。基因缺失疫苗是指应用基因操作，将病原或病毒中的 致病性有关的基因序列除去或失活，使之成为无毒株或弱毒株，但仍保持免疫原 性而制各的疫苗。核酸疫苗由t a n g 等人“2 1 首先提出。他们将表达人生长激素基 因的质粒d n a 导入小鼠表皮细胞，在小鼠血液中检测导了特异的抗体，并且在给 予加强剂量质粒后可使免疫反应增强。 植物疫苗指的是通过转基因方法将外源抗原决定簇基因转入植物细胞中，以 植物细胞、组织或植株为生产反应器，生产具有免疫原性的蛋白。1 9 9 0 年，c u r t i s s $ f l c a r d i n e a u 以专利形式发表“3 1 了第一篇有关植物转基因疫苗的报道，他们在烟 7 人角质细胞生长因子转化胡萝卜和水稻初探 草中表达了占烟草总蛋8 0 0 2 的变异链球菌表面蛋白( s p a a ) ，从此开始了植 物疫苗的研究。 3 ) 植物表达药用蛋白 除了可以用于生产抗原、抗体，植物还可用来生产细胞因子、酶及生物活性 肽既药用蛋白等。v e r w o e r d 等将黑曲霉的肌醇六磷酸酶( 即植酸酶) 基因转入烟 草，在成熟种子中植酸酶占总可溶性蛋白的1 “。w i t h e r 等利用转基因玉米生产 重组的b 一葡萄苷酸酶( g u s ) ，表达水平高达种子总可溶性蛋白的0 7 ，且生物活 性与天然的的g u s 相同“。h o o d 等在转基因玉米中成功表达了重组抗生物素蛋 白，其表达量占总可溶性蛋白的2 ，与从鸡蛋清中提取的相比具有相同的功效而 成本却大大降低了，现已成为s i g m a a l d r i c h 的商品“”。 1 、2 角质细胞生长因子概述 1 、2 、1 角质细胞生长因子的特性 角质细胞生长因子( k e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o r ，k g f ) 是1 9 8 9 年由r u b i n 等首先从m 4 2 6 人胚胎肺成纤维细胞的生长培养液中分离出来的。k g f 是一种酸、 热不稳定的促细胞分裂因子，分子量约为2 8k d a 。k g f 是由间充质来源的细胞产 生的，通过旁分泌途径特异地作用于上皮细胞。 k g f 具有很强的促上皮细胞分裂的功能。在静止的b a l b m k 表皮角质细胞中加 入k g f ，细胞的d n a 合成的活性可以达至0 5 0 0 倍的提高。与先前的促细胞有丝分裂 因子不同，k g f 并不能促纤维原细胞和内表皮细胞有丝分裂，说明了k g f 具有靶细 胞特异性。氨基酸序列分析表明：在k g f 蛋白末端的氨基酸序列与其他的促细胞 分裂因子存在较大的差异。这些特性预示着k g f 在人类的胚胎发育过程中表皮的 分化起着重要的作用“”。 k g f 属于成纤维细胞生长因子( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，f g f ) 家族。目 前已经知道这一家族有1 8 个成员。它们是一个有约1 2 0 个氨基酸的蛋白家族，有 3 0 一6 0 的氨基酸序列的相似性“”。人k g f 基因位于第1 5 号染色体上，基因含有 三个外显子和两个内含子“”。f i n c hpw 等人于1 9 8 9 年对k g f 编码序列进行了测序， 并将序列公布于g e n b a n k 。1 。 人角质细胞生长因子转化胡萝 和水稻初探 l 、2 、2k g f 的生物学作用 1 ) k g f 在生长发育中的作用 m a s o n 等1 9 9 4 在8 5 天胚胎的发育中小鼠心脏中检沁 k g f 的转录，而且 一直持续到受精后的1 1 天。这意味着k g f 在哺乳动物的生长发育中起着重要的作 用。在哺乳动物的组织、器官形成过程中，问充质细胞与上皮细胞的相互作用是 不可缺少的。k g f 的闻充质来源提示它可能在这个过程中具有重要作用。如皮肤、 呼吸道、胃肠道、尿殖系统、羊膜等的形态发生都跟k g f 密切相关。 k g f 在肺表皮细胞的生长、分化和成型及肺的分支形成中起着重要的作用。 利用反转录p c r 技术，在1 4 和1 6 天的老鼠胚胎中检测到k g f 及其受体的m r n a ， 并且在肺的形态形成过程中检测到大量k g f 及其受体的m r n a 。进一步的研究表 明2 5 或5 0n g m lk g f 明显的抑制了肺组织末端分支的形成，同时也明显地抑制 了末端表皮细胞形成囊泡细胞。而加入k g f 抗体进行免疫共沉淀后，这种抑制效 果大为地降低1 。而后，研究又发现k g f 能够促进肺部表皮细胞的增生，和提高 表面活性蛋白地表达。“。同时，它还诱导了肺部高度分化细胞各个分界区地形成 。”。这些研究都说明了k g f 在肺的发生、分化和生长起着重要的作用。动物的精 囊发生过程中，可以检测到k g f 的表达，并介导着雄性激素诱导精囊的形成。精 囊的形成、功能及行状的维持是通过雄性激素来维持的。然而，雄性激素是通过 生长因子间接地起作用地。雄性激素于间叶细胞上的受体结合后，信号通过旁分 泌因子将信号传到上皮细胞，促精囊的形成。k g f 这时担当了旁分泌因子的角色。 在新生的小鼠精囊中，通过反转录p c r 及n o t h e r n 杂交可以检测到k g fm r n a 的 表达。新生的精囊在器官培养液中能够进行正常的生长及分化。当在培养液中加 入k g f 单克隆抗体，可以明显的抑制精囊的生长及分支结构的形成。在不含有雄 性激素的培养液中加入适量的k g f ，可以使精囊得到一定的生长回复。“。同 样，a l e s s a n d r ad eb e l l i s 在前列腺中检测到k g f 及其受体的表达，k g f 在前列 腺的分化形成中起着重要的介导作用脚1 。 2 ) k g f 的损伤修复功能及减少放化疗的损伤 由于k g f 的促上皮有丝分裂、增生作用，及其靶细胞的特异性早已证明“”“2 ” 9 人角质细胞生长因子转化胡萝h 和水稻初探 因而在治病医疗上引起了科研工作者的极大兴趣。科研工作者在大量的工作研究 后证实了k g f 在肠胃的损伤修复中起着重要的作用。肠胃的上皮细胞在营养吸收， 电解转运中起着重要的作用，同时它还是肠胃的保护组织1 。当外层的上皮细胞 损伤后，将由下层的外皮干细胞分化来修复。而当下层的表皮干细胞损伤后便会 引发炎症性肠病脚。这时k g f 的旁分泌能促肠上皮干细胞生长，从而使肠胃下层 表皮干细胞的损伤得以修复。1 9 9 6 年，f i n c hp w ，p r i c o l ov 首先在发炎症性肠 病中检测到k g fm r n a 含量的增加，提出在此病中k g f 的损伤修复起重要作用。 h o u s l e y 等人在小鼠的肠胃损伤模型中发现，重组的k g f 能明显促进肝、肠胃的 表皮细胞增生。同时f i n c h 等人对肠胃损伤修复中，内源性k g f 产生的位置进行 研究。他们从发炎的肠组织中分离出3 株未发炎的上皮淋巴细胞和2 株发炎的上皮 淋巴细胞，同时分离出受感染的和未感染的固有层淋巴细胞。在对这5 种细胞进 行k g fm r n a 分析时，发现除在受感染的3 个上皮淋巴细胞中发现少量的k g fm r n a 外，其他几种细胞都没有k g f i i n a 存在。同时在肠的成纤维细胞中可以检测到大 量的m r n a 的存在。说明了在发炎性的肠病中，k 6 f 由固有层的成纤维细胞、或平 滑肌细胞产生，并作用于肠上表皮细胞。1 。 同样k g f 也可以促进角膜上皮细胞的增生，及损伤的修复。角膜中k 6 f 主要由 角膜基质成纤维细胞产生，在人角膜上皮细胞以及内皮细胞中均有k g fm r n a 的表 达，并具有k g f r 。k g f r 大多分布在角膜上皮细胞上呲m 1 。k g f 依赖激活角膜 上皮细胞中的r a s 2 m a p 激酶途径发挥作用嘲3 促进角膜上皮细胞与内皮细胞的分 裂、增殖。s o t o z o n o 等。”通过实验发现k g f 可以通过旁分泌途径作用于角膜上皮 细胞，促进其分裂和增殖。用3 h - 胸腺嘧啶核苷( 3 h t d r ) 掺入及液体闪烁技术，观 察角质细胞生长因子( k g f ) 对体外培养的人角膜上皮细胞d n a 合成的影响，并计 算细胞倍增时间。结果显示1 1 0 0n g m lk g f 有明显促进人角膜上皮细胞d n a 合 成的作用，且呈剂量依赖性。1 0n g m lk g f 明显缩短了细胞倍增时间。得出结论 外源性k g f 对体外培养的人角膜上皮细胞有明显的促增生作用。表明k g f 具有应用 于临床，促角膜上皮损伤修复的可能性“1 。 k g f 不仅可以修复肠胃、角膜上皮细胞损伤，它还可以减轻、缩短癌症放化 疗带来伤害。动物实验模型表明了重组的k g f 可以促上皮细胞组织的细胞分裂能 力，而且可以保护其不受毒性物质的伤害。k g f 的这些功能都是由于其能保护上 1 0 人角质细胞生长因子转化胡萝h 和水稻初探 皮细胞免受伤害的结果。这些包括促进细胞的增殖、迁移、分化、生存，d n a 的 修复和各种保护酶的激活。”。在临床实验中，k g f 可以减轻放化疗引起的放射性 口腔炎。在临床3 期的实验中，癌症病人在进行放化疗之前进行外周血干细胞移 植后，可以发现移植产生的k g f 减轻和缩短了放射性口腔炎的影响1 。 1 、2 、3 重组角质细胞生长因子的研究现状 自1 9 8 9 年r u b i n 等人发现k g f 后，科研工作者利用基因工程技术将k g f 在多种 细胞中表达。1 9 9 3 年，d i n ar o n 等人将k g f 连于p e t 8 c 表达载体转化菌株b l 2 1 ，从 而在原核细胞中表达了k g f 。检测重组k g f ( r k g f ) 活性的试验中，他们在培养的 b a l b m k 细胞中加以r k g f ，同时对照组中加入r k g f 活性抑制剂肝磷脂。实验结果， 加有r k g f 的b a l b m k 细胞的增长速度明显加快，而加有肝磷脂的对照组，细胞的 增长速度明显变慢呐1 。这说明了原核中重组表达的k g f 一样具有生物学活性。游 力等人同样在大肠杆菌中表达了k g f ，并且表达量达到菌体蛋白的1 0 左右“”。 傅成波等人利用c o s 7 细胞表达角质细胞生长因子并检测其活性。利用脂质体把 k g f 基因转入c o s 7 细胞中，再用w e s t e r n 印迹和e l i s a 方法检测k g f 蛋白的表达，然 后用m t t 法检测其活性。结果表明k g f 基因在c o s 7 中得到了表达，并对小鼠肠上皮 细胞( i e c - 6 ) 具有刺激增殖作用“。然而有关k g f 在植物中地表达研究却鲜有报 道，因而以植物为反应器生产k g f 将是k g f 体外表达的又一新途径。 因为植物反应器具有翻译后正确的修饰、加工，生产成本低，不需要纯化， 可以直接食用优点和角质细胞生长因子的损伤修复功能，所以在植物中表达人角 质细胞生长因子将具有很大的经济及药用价值。相信在不久的将来，转化角质细 胞生长因子水稻的萃取精华、转化角质细胞生长因子的美容胡萝h 、芦荟等将会 在美容、药用市场上广受亲睐。 人角质细胞生长因子转化胡萝h 和水稻初探 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 动物、植物材料 水稻( o r y z as a t i v a ) 材料：粳稻品种日本晴幼胚由上海农科所提供 胡萝h 材料：购于菜市场 人肺组织块：由福建省肿瘤医院惠赠 2 1 2 菌株和质粒 1 ) 菌株 大肠杆菌菌株：大肠j m l 0 1 由本实验室保存 农杆菌株：农杆菌e h a l 0 5 由本实验室保存 2 ) 质粒 p m d l 8 一t 载体：购于大连宝生物生物技术有限公司 p b p f q7 载体：由本实验室保存 p b l l 3 0 1 载体：由实验室保存 2 1 3 主要化学试剂及仪器 1 ) 主要化学试剂 d i g 碰曲p r i m e rd n al a b e f i n ga n dd e t e c t i o ns t a r t e rk i ti i购于r o c h e 公司 d n am a k e rd l 2o o o购于大连宝生物生物工程有限公司 e c o ri 、b a m hi 、脚i 等限制性内切酶和t 4 d n a 购于大连宝生物生物工程有限公司 连接酶 去磷酸化酶c l a p购于p r o m e g a 公司 胶( 小量) 回收试剂盒 h y g r o m y c i n ( 潮霉素b ) r n a s e a t a q d n a 聚合酶 c e f o t a x i m es o d i u m ( 头孢霉素) x g l u e ( g u s 染液) 购于上海华舜生物有限公司 购自b o e h r i n g e rm a n n h e i m 公司 购自s i g m a 公司 购白上海s a n g o n 公司 购自华北制药股份有限公司 购自s i g m a 公司 人角质细胞生长因子转化胡萝 和水稻初探 p h y t a g e l ( 精密琼脂粉) 各种植物激素 各种抗生素 其它 3 ，5 - d i m e t h o x y - - 4 - h y d r o x y - a c e t o p h e n o n e ( 乙酰丁香酮) k g f 抗体 b r a d f o r d 蛋自质定量检测试剂 2 ) 主要仪器 d s h 系列超净工作台 d k - s 2 4 型电热恒温水浴锅 t g l 一1 6 1 3 型台式离心机 t - g r a d i e n tp c r 仪 w 7 0 2 2 j 型微波炉 b p 3 1 0 s 型电子天平 s h z 1 l i 循环水式多用真空泵 s h 乙8 2 型恒温振荡器 d y y - i i i5 型电泳仪；3 1 a 型电泳槽 d h g - 9 0 7 0 a 型电热恒温鼓风干燥箱 购自北京鼎国生物技术发展中心 购自北京欣经科生物技术公司 赂自珠海联邦制药厂有限公司中山分厂 进口或国产分析纯试剂 购自a r c o d r i c h c h e m 公司 武汉博士德生物工程有限公司 上海生工生物工程技术服务有限公司 上海淀山湖净化设备厂 上海精宏实验设备有限公司 上海安亭科学仪器厂 德国b i o m e t r a 公司 顺德美的微波炉制造有限公司 德国s a r t o r i u s 公司 郑州长城工贸有限公司 上海淀山湖净化设备厂 北京六一仪器厂 上海精宏实验设备有限公司 2 2 方法 2 2 1 肺组织块的d n a 提取 取5 0 0m g 的肺组织块，置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状。将粉末放入 4m l 离心管中，加入2m l 的1 0 s d s 和1 0ul 的2 0m g m l 蛋白酶k ，置5 5 水浴过夜。用等体积的酚氯仿= l ：1 ( v ：v ) 抽提两次，再用酚氯仿异戊醇 = 2 4 ：2 3 ：i ( v ：v ：v ) 及氯仿异戊醇= 2 3 ：i ( v ：v ) 各抽提一次。吸取上层水相，加两倍 体积预冷的无水乙醇，1 5 0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，弃上清。加入2 0 0 1 tl 的t e 缓冲液，d n a 质量通过琼脂糖凝胶电泳分析确认后，一2 0 保存。 人角质细胞生长因子转化胡萝h 和水稻初探 2 2 2 重叠延伸法p c r 扩增m 1 1 ) k g f 基因外显子1 的获得： 根据g e n b a n k 尸, 有k g f 夕f 显予1 的核苷酸序列，设计6 段单链寡核苷酸( 由上 海博亚生物公司合成) ： 1 号引物5 - g a t t t c c a t g a t a t t g t a a t t a t t c t t c a 一3 i 5 。g g c 盟丛鳗t c t a g a a t g t g c a a t g a c a t g a c t c c a g a g c a a a t g g c t a c a a a t g t g a a 一3 5 - t c c a t g t a a t c a t a a c t t c t t g t g t g t c g c t c a g g g c t g g a a c a g t t c a c a t t t g t a g c 一3 7 i 5 - a t g a t t a c a t g g a a g g a g g g g a t a t a a g a g t g a g a a g a c t c t t c t g t c g a a c a c a g t g g 一3 5 - g g g t c c c t t t t a c t t t g c c t c t t t t a t c g a t c c t c a g g t a c c a c t g t g t t c g a c a g 一3 v5 - c a a a g t a a a a g g g a c c c a a g a g a t g a a g a a t a a t t a c a a t a t c a t g g a a a t c a g g a c 一3 。将以上6 段寡核苷酸各0 5pl ( 1 um o l l ) 、t a gd n ap o l y m e r a s e0 2ul ( 5u “l ) 、d n t p0 3ul ( 1 0r e t o o l l ) 、1 0 x p c r 缓冲液2ul 、双蒸水1 4 。5ul ，建 2 0 “l 体系进行一次链延伸，产生延伸反应产物。延伸条件：9 4 5m i n ，1 0m i n 内缓慢降至5 0 ，5 0 5m i n ，7 2 5m i n 。根据g e n b a n k 尸, 有的k g f 基因序 列设计两端的一对引物：1 号引物( 序列如上) 和( 2 ) 5 引物 5 。g g c g g a t c c t c t a g a a t g g c 竹g c a a t g a c a t g a c t c c a 3 。以延伸反应产物为模板，以 ( 2 ) 5 吲物及1 号引物进行p c r 扩增获得外显子l 。9 4 预变性5m i n ，循环条 件：9 4 5m i n ，9 4 3 0s e c ，4 5 1m i n ，7 2 3 0s e c ，3 6 个循环，而后 7 2 1 0m i n 牢b 齐。用胶回收试剂盒回收。外显子1 核苷酸获得过程如图1 所 示： l鬟嚣帮 v 土链筵伸 n 量? 务蠢外盛 黧燃黧篇黑鬻篇篇篇黑篙鬻謦攀篙豢慧燃黑燃黑然黧篇鬻子1 lp c a 妒 增 _ i j l ， 盏篙茹= 茹拦卷鲞篓兰盎= 篙= = = 慧大援矮湿 i 1 1 4 人角质细胞生长因子转化萌萝 和水稻初探 图1 ：外显子1 核苷酸获得图示 f i g 。ld i a g r a mo ft h eg a i no fe x t r o n1 2 ) k 6 f 基因外显子2 、外显子3 的获得： 根据g e n b a n k 已有的k g f 核苷酸序列设计外显子2 两端的引物( 由上海博亚生 物公司合成) ： 2 号弓i 物：5 l g a a g a a t a 戌1 1 a c a a l 删a t g g a a a r c a - 3 3 号引物：5 - t g c a l 卫卫t r c t 眦a t a g a g n 3 7 根据g e n b a n k 已有的k 6 f 核苷酸序列设计夕卜显子3 两端的引物( 由上海博亚生物公 司合成) ： 4 号引物5 二c 汀g c a a a g a a a g a a r g c a ：r g a a 一3 3 ( 3 ) 弓弘渤5 乙丝坠笪! ! t t aa g l l p i t t g c c a t a g ( h a g - 3 以人d n a 为模板，2 号、3 号为引物p c r 扩增出外显子2 ，4 号、3 ( 3 ) 为引 物p c r 扩增出外显子3 。9 4 预变性1 0 m i n ，循环条件都为：9 4 4 5s e c ，3 7 4 5s e c ，7 2 4 5s e c ，4 7 个循环，而后7 2 1 0 l i n 补齐。p c r 扩增产物 分别经胶回收试剂盒回收。 3 ) k g f 全长的获得： 将以上的三段外显子回收产物各取5 且l 、1 0 p ( ：媛冲液2ul 、t a gd n a p o l y m c r a s c0 2 ul ( 5 u pl ) 、d n t p0 3ul ( 1 0m m o l l ) 、双蒸水2 5pl ， 建2 0ul 链延伸反应体系，进行一次链延伸( 延伸条件同上) 。以此反应产物为 模板，( 2 ) 5 、3 ( 3 ) 为引物进行p c r 扩增。9 4 预变性3m i n ，循环条件：9 4 3 0s e c ，5 5 5 0 s e c ，7 2 5 0s e c ，3 5 个循环，后7 2 1 0 i i i i n 补齐，回收 。k g f 全长获得过程如图2 所示： 人角质细胞生长因子转化胡萝h 和水稻初探 嘲。锄。辫e 2 2 = 理i l ；| 鍪磷萼。鼍芝焉手4 。4 率$ 爱r - ，= ；i = 卜显子墓内含e 手蕾外显手客 内禽霄惫井显乎3 | 延伸翱艇咿上一：p e 一上p c r 扩增 羚爱斡 孙娃等誊 簸最曩镱 ( ，_ 嘲 篙茹矽 。冁 i 嘧z 苎 嬲秘蜘鼍学鳓嘞磷嗡 叫。” j 一一 嘲g 争夤鹂疼 戮 图2k g f 序列获得图示 f i g 2d i a g r a mo f t h eg a i no fk g f 2 2 3p c r 及酶切胶回收( 参考胶回收( 小量) 试剂盒说明书，上海华舜生物 工程有限公司) 2 2 4n n a 酶切及d 姒片断连接( 参见各试剂说明书) 2 2 5 去磷酸化反应( 参见试剂说明书) 2 2 6 质粒d n a 提取“” 1 ) 挑单菌落，接种于2m ll b ( 含k a n5 0ug m l ) 液体培养基中，3 7 振荡培养过夜。 2 ) 取1m l 菌液于1 5 le p 管中，1 2 0 0 0r m i n 离心2m i n ，弃上清。 3 ) 加入1 0 0ul 溶液i ( 见附录) ，旋涡混合器振荡使沉淀完全悬浮。 4 ) 加入2 0 0 “l 溶液i i ( 见附录) ，轻轻翻转几下