（生物医学工程专业论文）胆固醇生物传感器的研究.pdf

a b s t r a c t c h o l e s t e r o le x i s t i n gi no u rb l o o d ，w h i c hi st h em o s ti m p o r t a n ts t e r o i d i nh u m a n b o d va n db ec a l l e dt o t a l c h o l e s t e r o la saw h o l e ，c o n s i s t so fc h o l e s t e r o l e s t e ra n d d i s s o c i a t i v ec h o l e s t e r 0 1 n o r m a lh u m a n b l o o ds e r u mc o n t a i n s1 2 0 - - 2 6 0 m g d l p 图2 - 2 酶电极的工作过程 如图2 2 所示，基础电极的外部活性表面为0 ，它与个很薄的酶层o l 紧密相 接。固定化酶层的外表面暴露在被测液中，后者通常是处于充分搅拌下，以尽量 减小其浓度梯度。如果酶层基质的机械强度较差，则在其外侧再加一个能透过底 物和辅助试剂的薄膜l l 。底物在被测过程中一般需经历如下步骤：( 1 ) 底物s 由溶液相传输至电极表面l ；( 2 ) s 在酶层与溶液相间进行分配；( 3 ) s 在酶 层中传输与反应；( 4 ) 产物p 传输至基础电极上被检测。显然，影响上述步骤的 2 0 ，渤夕，六：炉 胆固醇生物传感器的研究硕士学位论文 任何因素都有可能引起响应特性的变化。在理想的情况下，如产物在基础电极上 响应很快，外部保护膜l l 相当的薄，本体溶液又经过充分混合，则酶层中的反 应和扩散是过程的控制步骤，酶反应遵循m i c h a e l i s m e n t e n 动力学。酶层中( 0 k m ：i - - n f k e l( 2 8 ) 即底物浓度较小时，酶电极产生的稳态电流强度与底物浓度呈正比，此属于一级 反应。但当底物浓度较大时，酶电极产生的稳态电流强度则与底物浓度无关，此 为零级反应。 2 2 丝网印刷碳电极全血总胆固醇生物传感器的构造 为设计微型胆固醇生物传感器，在选择电极材料时，我们需要考虑以下几个 问题：电极材料是否能够作为合适的生物固定化基底? 是否有成熟的工艺可以将 这种电极材料制作成微型电极并实现批量生产? 所制作出来的电极的性价比如 何? 电极的稳定性如何? 2 1 洳； 土 酶电极的机理是在反应电极上固定一层酶膜，由于酶分子是蛋白质，因此在 固定化、储存等方面对微环境的要求比较苛刻。虽然从电极响应上来看，金属材 料电极比其它材料电极具有优势，但从酶固定化的角度上看，金属却远不如碳电 极。首先面对的问题是蛋白分子在金属表面无法吸附，因此酶无法固定在金属电 极上，现在解决这个问题的方法是在固定化前对金属电极表面进行预处理，在电 极上接一些基团，如羟基、羧基等，通过这些基团与酶分子上的氨基结合将酶固 定在电极上。另外还有研究人员通过导电聚合物将酶固定在金属电极上，这些方 法面临的最大问题是电极制作过程太复杂，而且重现性差。而碳电极可以很好地 克服这些问题。由于碳颗粒的多孔性使其具有优异的吸附性，可以容易、稳定地 将酶分子吸附在表面，同时还吸附一定的水分，保证酶在固定后能够在比较长的 时间内保持活性。 基于以上的考虑，我们采用丝网印刷技术来制备微电极。丝网印刷技术 ( s c r e e n - p r i n t e dt e c h n o l o g y ) 制作电化学传感器的换能元件是目前制备一次性使 用电化学传感器电极的主要方法【1 4 】。丝网印刷以丝网印版作模具，所制作传 感器电极的大小和形状可以改变，易于微型化和集成化。印刷电极条的油墨主要 有银油墨和碳油墨两大类。银油墨用来印刷电极条的基轨，以提高导电性；碳油 墨铺在银轨上，以阻止银与溶液接触，并在上面连接生物分子。碳油墨是一种导 电碳浆，既具有碳的多孔性和生物相容性又具有比较好的导电性，同时碳浆可以 方便、快速地印制在绝缘基底上，是目前制造电极型传感器的流行电极材料，另 外导电碳浆非常廉价，这也保证使用它制作的传感器的价格非常便宜，可以制成 用户都能承受的一次性传感器。 图2 3 是丝网印刷胆固醇微电极的基本结构。整个电极条的尺寸是 3 5 m m x l o m m ，由绝缘层形成的反应区域为2 m m x 2 m m ，其中有由导电碳浆印刷成的一 个工作电极和一个对电极，在反应区域中固定化酶和其他试剂。 8 6 3 项目要求所研制的胆固醇传感器必须能够在血液样品为2 微升的情况下 快速准确地检测胆固醇的浓度，要在短时间内样品均匀分布在整个反应区域比较 困难，为达到这个要求，需要采用微腔结构，样品可以通过微腔的毛细作用，快 速地被吸入微腔，从而达到均匀分布的目的。微腔结构是在电极条的基础上，增 加一层具有一定厚度的腔体层，再在腔体层上覆盖一层亲水层，三层部分通过胶 翌! ：兰兰塑璧圭些些竺丝查 堡圭丝坚 ；自；=；=；=；#；iii一一压粘成一个完整的微腔传感器试纸条。检测样品时，将试纸条的入口端浸入样品， 血液或胆固醇溶液就通过样品入口进入到电极反应区的腔体内，与电极上固定的 酶和其它相关试剂进行反应，然后通过仪器记录电极上的响应电流，最终得到胆 固醇的浓度。 图2 - 3 胆固酵微电极的结构 2 3 实验 2 3 1 实验原理 使用电流型酶电极检测胆圃醇，其原理如下式： 酯化胆固醇( e e ) + h 2 0 卫旦堕堕氅，游离胆固醇( c h ) + 脂肪酸( 2 9 ) 游离胆固醇( c h ) + 0 。塑竖墅骘 a4 - - 胆甾烯酮十h 2 0 z ( 2 1 0 ) m + 2 f e ( c 叭a 一十2 h 十立丛塑睦_ 2 f e ( c n ) 6 。一+ 2 h 2 0( 2 1 1 ) f e ( c n ) 。r + e + f e ( c n ) 。 4 一( 2 1 2 ) 血液中胆固醇以两种形式存在：酯化的胆固醇和游离态的胆固醇。酯化的胆 固醇在胆固醇酯酶的作用下水解，生成游离胆固醇，游离胆固醇在胆固醇氧化酶 ( c o d ) 的作用下与氧气发生氧化还原反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化 物酶( p o d ) 的作用下将亚铁氰化钾中的2 价铁离子氧化为3 价铁离子，并在电极 表面发生电子传递，产生电流。电流的大小与被测样品中胆固醇的浓度成正比关 系。 前三个反应是在酶的作用下发生的生物催化反应，后一个反应是电极反应。 由于h ：啦在碳电极上难于直接氧化，所以采用亚铁氰化钾作为电子介体来促进氧 化还原反应中的电子流动，以增加传感器的响应电流，同时使反应在更低的电位 下进行。当反应处于最佳p h 条件下，酶量充足时，电极反应是整个反应的控制步 骤，这时应该充分考虑电子介体的种类、氧化还原状态、用量以及其他影响反应 的条件。 2 3 2 试剂和仪器 试剂：胆固醇氧化酶( c o d ，2 0 u m g ，冻干粉) 、胆固醇酯酶( c e ，1 0 0 u r a g ， 冻干粉) 购自t o y o b o ；辣根过氧化物酶( h r p p o d ，r z ，3 ，冻干粉) 购自上 海雪满生物科技有限公司；羟甲基纤维素( c m c ) 购自上海化学试剂公司；铁氰化 钾、亚铁氰化钾购自上海试剂一厂，分析纯；胆固醇粉末购自上海实生生物公司， 二茂铁购自华北地区特种化学试剂开发中心，分析纯。 仪器：c h l 6 0 0 a 电化学分析仪工作站( 上海辰华仪器公司) 。这是一种通用电 化学测量系统，内含快速数字信号发生器、高速数据采集系统等，由外部计算机 控制，在窗口操作系统下工作，操作方便，具有很强的功能，集成了几乎所有常 用的电化学测量技术。本章主要运用其中的电流一时间曲线分析法( a m p e r o m e t r i c i - tc u r v e ) 来检测响应电流随时间的变化曲线。 2 3 3 实验过程 胆圃醇标准溶液的配置 胆固醇粉末难溶于水，因而配制胆固醇标准溶液比较困难。根据些参考文 献和实验的摸索，我们总结出一种较好的配制方法。首先在烧杯中加入5 m l 异丙 醇和5 m l t r i t o n x - 1 0 0 ，称取胆固醇粉末2 0 0 m g 溶于混合物中，搅拌并缓慢加热。 胆固醇完全溶解后移至5 0 m l 容量瓶中，用p h 7 0 的磷酸盐缓冲液冲洗烧杯并定 容。振荡后静置一段时间待其混合均匀。这样制得的胆固醇溶液浓度为4 0 0 m g d l 。 根据实验需要，该溶液可用磷酸盐缓冲液稀释至各所需浓度。在低温条件下存储 可能会有少量胆固醇析出，般来说浓度越高胆固醇越容易析出，但是缓慢加热 会使其重新溶解。用这种方法配置的胆固醇溶液放置一周后与新配置的胆圊醇溶 液相比，性质稳定，效果一样，可以继续使用。如果需要配制总胆固醇溶液，可 在配好的游离胆固醇溶液中加入市售的高密度酯蛋白和低密度酯蛋白，配置合适 浓度的总胆固醇溶液。 t r i t o nx - 1 0 0 和异丙醇是胆固醇的有效溶剂。但是，表面活性剂和胆固醇的 比例应该在胆圃醇的溶解和表面活性剂对酶活性的干扰之间求得一个平衡。过量 的t r i t o n x - 1 0 0 会对酶产生抑制作用，t r i t o n x 一1 0 0 的含量在5 1 0 之间可以得 到最佳效果。而异丙醇对灵敏度也有影响，当异丙醇浓度增大传感器的灵敏度会 降低。这可能是由于溶液相关介电常数的减小导致电解质电离减少引起的【5 】。 酶层的制作 首先在碳电极上涂布一层一定浓度的羟甲基纤维素( c m c ) 溶液，干燥后形成 一薄层亲水c m c 层。将适量胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶、羟甲基纤维素、海 藻糖和亚铁氰化钾溶解在0 1 mp h 7 0 的磷酸盐缓冲液中，配制胆固醇氧化酶溶 液，搅拌均匀，静置。取制好的胆固醇氧化酶溶液2 1 ，滴加在已制作好的亲水 层上，5 5 干燥5 分钟后取出，形成氧化酶层。将适量胆固醇酯酶、羟甲基纤维 素溶解在0 1 m p h 7 0 的磷酸盐缓冲液中，配制胆固醇酯酶溶液，搅拌均匀，静置。 取制好的胆固醇酯酶溶液2 u 1 滴加在氧化酶层上，5 54 c 干燥5 分钟后取出，即完成 了酶层的制作。 在以上的制作步骤中，c m c 层由于吸收酶液中的水分而瞬时膨胀，在后继干 燥步骤中，一部分c m c 与酶液混合，由于酶液中c m c 的存在，使得大部分的c m c 保留在c m c 层中而不混合，仅仅引起膨胀。因为滴加后不需搅拌，所以c m c 层和 酶层的混合并不完全，电极表面仅仅被c m c 覆盖，这样可以消除电极表面与酶和 电子介体的电位元接触，可以避免蛋白质或电子介体等吸附在电极表面而带来的 干扰。这种结构也可以阻止表面活性剂t r i t o n x 一1 0 0 到达电极表面，因而可以 消除电极系统的恶化。 测试 测试采用两电极系统，将待测样品溶液2 u 1 滴加到制作好的胆固醇微电极反 应区域中，待样品分布均匀后在工作电极与对电极之间施加3 0 0 m v 直流电压，1 8 0 秒后记录响应电流。 所有实验( 除特别说明) 均在室温( 2 5 。c ) 下进行，均采用最优化的条件。当在 王蜥芦，z 掌 胆固醇生物传感器的研究硕士学位论文 进行电极响应影响因素分析时，只有其中一个条件改变，其余条件均保持不变。 出于实验方便考虑，传感器性能测试采用血液，酶层中包含c e 和c o d ；而优化实 验则采用游离胆固醇溶液，酶层中只包含c o d 。 2 4 酶电极影响因素的分析和优化 2 4 1电子介体对反应体系的影响 酶法胆固醇检测的基本原理如式( 2 1 0 ) , n ( 2 1 1 ) 所示，通过检测消耗的氧气量 或产生的过氧化氢量来间接地检测胆固醇的含量。根据第二代生物传感器的基本 原理，我们希望能通过铁氰化钾等电子介体来代替氧分子参与胆固醇氧化酶和底 物的氧化还原反应，希望能在电极表面发生如下反应： 酯化胆固醇( c e ) + h 2 0 熙幽壁堕+游离胆固醇( c h ) + 脂肪酸( 2 9 ) 游离胆固醇+ c o d ( f a d ) c o d ( f a d h ：) “f e ( c n ) 。r 4 一胆甾烯酮+ c o d ( f a d h ：) ( 2 1 3 ) c o d ( f a d ) 十f e ( c n ) e r ( 2 1 4 ) 不同浓度的胆固醇在这种反应体系下的响应i - - t 曲线如图2 - 4 所示。 o m m i 2 0 0 , 4 0 0 m m l l o o m g m l 上i m e s e e 图2 4 铁氰化钾反应体系的电流响应 从图中可以看出，反应的底电流比各种浓度的胆固醇溶液的响应电流都大， 而且无法得到明显的浓度梯度，可见铁氰化钾的电子传递效应对该反应体系并不 明显，无法分辨胆固醇的微小变化。分析其原因，我们认为可能是在该反应体系 中，电子介体没有有效地与酶发生电子交换。从胆固醇氧化酶的三维结构观察， 它的活性中心隐藏得比较深，而且被糖蛋白所包围，导致电子介体无法有效靠近 u童：零乏#u 其活性中心，最终无法将电子从活性中心传递出来。也就是说，在胆固醇氧化酶 体系中电子介体无法与氧竞争，最终生成绝大多数产物都是h ：o z ，而h z o z 在碳电 极上很难被氧化还原，所以响应电流非常小，且与底物浓度无相关性。 为了得到明显的浓度梯度，我们使用了胆固醇氧化酶一过氧化物酶体系，胆 固醇底物被氧化后生成h ：0 。，h z 0 。是小分子物质，而且氧化性很强，很容易与亚 铁氰化钾发生氧化还原反应，可以避免电子介体与酶活性中心反应时空间位阻效 应的影响，所以响应电流比较大，而且很容易达至4 稳态电流。在这种体系下，我 们获得了非常明显的浓度梯度，其电流响应如图2 5 所示，对比结果如图2 - 6 所 示。 2 薹 0 。3 羚 n ： t i m e s e c 图2 - 5 亚铁氰化钾反应体系的电流响应 4 0 0 r a g a l l 3 0 0 m g d j 2 0 0 r a g a l l 1 0 0 r a g a l l o v a 鐾，d l 05 01 0 0 1 5 02 0 02 5 03 0 0 3 5 04 0 04 5 0 胆固醇浓度( m d 1 ) 图2 - 6 两种反应体系的电流响应曲线的对比 ( 1 ) 一一胆周醇氧化酶，过氧化物酶，k 4 f e ( c ) 。 ( 2 ) 胆圊醇氧化酶，k 毋e ( c n ) 。 2 7 。 童i量-i，u ，浙夕罩六：掌 胆固醇生物传感器的研究硕士学位论文 由上图可以直观地看出，选用亚铁氰化钾作为电子介体效果较好。而亚铁氰 化钾的浓度对响应电流也有影响，其浓度有最优化值，浓度太低响应太小，太高 则对反应有定的抑制，需要在实验中摸索其晟适浓度。我们改变亚铁氰化钾的 量来配制酶液( 0 1 2 5 m l 缓冲液) ，用2 0 0 r a g t i t 胆固醇溶液做底物检测其响应电 流，寻找亚铁氰化钾的最佳用量。实验曲线如图2 7 所示。 2 5 响 2 应 电1 5 流 i 1 ( u a 0 - 5 ) 0 05 0 1 0 01 5 02 0 02 5 0 亚铁氰化钾用量( m g ) 图2 = 7 亚铁氰化钾用量对响应电流的影响 由上图可见，亚铁氰化钾的量为7 5 m g 时( o 1 2 5 m l 缓冲液) 达到最佳响应， 所以在配制酶液时，亚铁氰化钾的浓度为6 0 0 m g f l m l 。 2 4 2 酶量的优化 酶量对响应有较大的影响。在酶量较小时，酶电极响应随酶量的增加而迅速 提高，但当酶量增加至一定程度时，电流达到最大值并呈现下降的趋势，且响应 时间大大延长，这是因为形成的固定化酶膜的厚度与所加入的酶量有关。酶量过 大时，生成的酶膜过厚而导致响应时间延长，符合m e l l 和m a l o y 关于酶反应最 大速度与有关因素之间关系的讨论： v m a x = k 3 e 。= v d k m d 2 式中e 。为酶膜中酶的浓度，d 为底物扩散系数，k m 为米氏常数，可见酶反应最 大速度主要决定于酶量，但酶膜厚度d 显著影响反应速度，只有当酶膜足够薄时 才可能获得最大的反应速度，为此在进行酶固定化时所取的酶量需要进行选择。 本实验中胆固醇酯酶的浓度为1 6 0 m g m 1 ，胆固醇氧化酶的浓度为2 8 0 m g m l ，过 ，浙夕罩六：掌 胆固醇生物传感器的研究硕士学位论文 氧化物酶的浓度为1 4 4 m g m i 。 2 4 3 缓冲液p h 值的优化 任何酶都具有最适p h 值，但将酶固定化后其最适p h 值可能会改变，因而选 择配置酶液时缓冲液的适当p h 值以使酶的活力尽可能得发挥非常重要。实验中 采用不同p h 值的缓冲液配制酶液并检测其响应电流，由此选择最适p h 值。 实验中缓冲液的p h 梯度从5 0 到1 0 0 ，其中p h 5 0 的缓冲液用柠檬酸一柠 檬酸钠缓冲液；6 0 到8 o 的用磷酸盐缓冲液：9 0 的用t r i s 一盐酸缓冲液；1 0 0 的用碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液。酶液配制中仅缓冲液改变，其它成分、比例及测 定条件均保持不变。底物用2 0 0 m g d l 胆固醇溶液。 响应电流随缓冲液p h 值的变化曲线如图2 8 所示。 从图中可以看到：缓冲液的p h 值在7 0 到9 0 的范围内有较好的响应电流 值，考虑到人体血液的p h 值呈微碱性，所以通常配制酶液时选用p h 值7 0 的 磷酸盐缓冲液效果较为理想。 置 v 避 脚 目 蜃 0 5 0 4567891 01 1 p h 图2 - 8 缓冲液p h 对响应电流的影响 2 4 4 温度条件的优化 酶的催化活力受温度影响较大，所以电极制作和测试必须考虑温度的作用。 从温血动物组织中提取出来的酶，最适温度一般在3 5 c 至4 0 4 c 之间。在达到最 适温度以前，提高温度会增加酶的反应速度。大致温度每升高i o c ，酶促反应 速度增加1 一2 倍。但是温度过于提高，酶会迅速变性，减少活力，反应速度会 ，浙夕罩六：掌 胆固醇生物传感器的研究硕士学位论文 明显下降。酶反应的最适温度就是这两种过程平衡的结果。由于我们研制的胆固 醇传感器是在一般条件下使用，选择测试温度为1 5 3 0 。c ，实验样本浓度为 2 0 0 m g a l l 。实验曲线如图2 9 所示。从实验结果看出，传感器在这个温度范围内， 特别是室温2 5 。c 左右，受温度影响不大，这主要是由于每个电极上酶是过量的， 虽然酶的活力受到了影响，但是，其整体催化能力相对底物而言是足够的。 1 6 7 1 6 5 雩1 6 3 = 避1 6 1 廿 型1 5 9 善 1 5 7 1 5 5 1 0 温度( ) 图2 - 9 温度对响应电流的影响 2 4 5 工作电位的优化 工作电位对传感器响应电流的影响如图2 1 0 所示，实验样本浓度为 2 0 0 m g d l 。当工作电位从1 0 0 m v 增大到3 0 0 m y 时，灵敏度显著增加，这是由于电 子介体被氧化的驱动力增加造成的。工作电位超过3 0 0 m y 时，电流强度增加已经 不明显了，而过高的工作电位加大了血液中抗坏血酸、尿酸等在电极上的直接氧 化，不利于提高传感器的选择性。为了获得最大的灵敏度和抗干扰能力，选择 3 0 0 m y 作为工作电位较为理想。 2 4 6 亲水聚合物c m c 浓度的优化 我们在电极和酶层之间通常先涂布一层亲水聚合物c m c ，在氧化酶和酯酶的 配制中也加入了一些c m c 。亲水聚合物具有较好的吸水性，有利于酶液在电极表 面分布均匀，使反应顺利进行并具有较好的重复性。同时，它具有纤维素的性质， 所以还具有过滤作用，可以避免干扰物质在电极表面的直接氧化【1 5 】。但亲水 聚合物的浓度对响应电流的大小有一定的影响，浓度适当时，有利于反应物分布 均匀，相当于增加了反应的有效面积；当浓度进一步增大时，由于反应腔的限制， ，浙夕罩六：掌 胆固醇生物传感器的研究硕士学位论文 有效反应面积不可能继续增大，但其致密结构和增加的厚度会阻碍电子传递，使 响应电流减小，其关系曲线如图2 - 1 1 所示a o 避 甘 埋 蜃 百 蠕 脚 趟 墨 o1o o 2 0 03 0 04 0 05 0 06 0 0 工作电位( m v ) 图2 一1 0 工作电位对响应电流的影响 05 01 0 01 5 02 0 02 5 03 0 0 c m c 浓度( m g m 1 ) 图2 - 1 1c m c 浓度对响应电流的影响 2 4 7 酶保活剂对传感器寿命的优化 胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶固定在碳电极上后，由于它们在实验环境下容易 失活，因此在没有酶保活剂保护时，其活性下降比较明显，无法长期储存，使其 使用范围受到很大限制。为了克服这个问题，我们在配置的酯酶和氧化酶溶液中 添加一定量的海藻糖作为酶保活剂。 海藻糖是由两分子葡萄糖键接的非还原性双糖。研究表明，生物体能在酷热、 干旱、高渗和重金属离子等不良环境中生存，与体内合成高浓度海藻糖密切相关。 8 6 4 2 1 8 6 4 2 o 1 1 1 1 0 0 0 0 4 5 3 5 2 5 1 5 0 3 2 l o ，浙夕，六：妒 胆固醇生物传感器的研究硕士学位论文 目前，虽然有比较多的实验证明海藻糖在酶的固定化过程中确实有保护酶活性的 作用，但海藻糖的稳定机制尚不清楚。人们用很多理论模型来解释海藻糖的稳定 机制，比较流行的理论是“水替代”理论：生物分子中的蛋白质、糖和脂质等均 被一层水膜包围着，这层薄的水膜是维护其结构与功能必不可少的。干燥时水膜 失去，将导致这些大分子物质发生不可逆变性。如果在干燥过程中加入一定量的 海藻糖，则海藻糖可在生物分子失水部位与这些分子形成氢键，取代失水部位使 其在缺水条件下仍能保持原结构，而不丧失活性【1 6 ，1 7 】。 我们在酶液中分别添加不同量海藻糖，使其在酶液中的浓度分别为o r n g m l 、 1 6 m g m l 、3 2 m g m l 、6 0 m g m l ，按前述步骤制成胆固醇传感器，存储3 个月，检 测发现当海藻糖在酶液中的浓度为1 6 r a g h a l 时，对酶活性的保持作用最明显， 再增加海藻糖的浓度，检测电流值会下降，其原因可能是因为过多的海藻糖包围 在酶分子的周围导致酶的活性中心不易与底物接触，反应灵敏度降低，从而降低 反应电流。 制得的胆固醇生物传感器在室温干燥条件下保存3 个月，响应电流可以保持 在9 5 ，没有明显的衰减，符合实用化要求。 2 5 丝网印刷碳电极全血总胆固醇生物传感器的性能 2 5 1 临床实验 先用标准血清进行定标实验，标准血清浓度分别为1 0 6 m g d l ，1 6 3 m g d l ， 2 1 3 m g d l ，2 4 8 m g d l ，2 9 9 m g d l ，3 4 3 m g d l ，4 0 3 m g d l ，每个样品测5 次后取其 平均值，标定曲线如图2 一1 2 所示。 3 盆2 _ 5 0 2 蠢1 5 着 蛋0 5 1 0 02 0 03 0 04 0 0 胆固酵浓度( m g d 1 ) 图2 一1 2 胆固醇传感器的标定曲线 5 0 0 3 2 。 可以看出，测量胆固醇的线性范围达到1 0 0 - - 4 0 0 m g d l ( 2 6 一l o 3 r a m ) ，几 乎包括了人血的所有正常和异常值范围。 选取3 1 份病人血样进行l 临床试验，加于所研制的传感器上，测得响应e 邑流， 根据标定曲线计算得到浓度值，将其与o l y m p u sa u i 0 0 0 全自动生化分析仪的 测量结果进行比较。对结果进行相关统计分析，设常规方法测定结果为x ，所研 制的传感器测定结果为y ，比较结果如下： n = 3 1 ，斜率= o 9 1 0 5 ，r = o 9 4 3 0 上述结果表明，本传感器与医院胆固醇氧化酶法- - t r i n d e r 反应法测定结果 的相关性良好，即准确度与大型生化仪器分析结果相近或相当。 2 5 2 干扰实验 胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶对反应具有较好的特异性，胆固醇氧化酶对底物 的特异性主要是针对具有3 b 羟基胆固醇的整个支链以及不饱和的甾体。血液中 具有类似结构的物质含量很少，可以忽略不计。所以该电极检测全血胆固醇具有 较好的专一性。但血液中易于氧化的抗坏血酸和尿酸等，可能会在电极上发生反 应，对测定产生干扰。它们的正常含量分别是4 - 7 m g d l 和0 4 0 5 9 m g d l 。 配制该范围的抗坏血酸和尿酸进行实验，从结果可以看出，不同浓度的尿酸 或抗坏血酸在电极上的响应电流几乎相等，所以不同病人血液中不同的尿酸或抗 坏血酸浓度对血液胆固醇的检测不会造成干扰。其存在只是使底电流增大，这个 影响可以在后续电路中去除。 2 5 3 重复性实验 取三个浓度的血样进行测试，每个浓度测三次，每次测试用一个试纸条，计 算均值和方差。结果如表2 1 。可以看出，该传感器具有较好的重复性，基本达 到实用化的水平。 表2 - 1 胆固酵传感器的重复性实验 2 6 小结 本章内容主要涉及基于国家8 6 3 项目的微型胆固醇生物传感器的研制。我们 探讨了酶电极的构造，通过大量的实验来选择了合适的反应体系，进行了反应体 系中相关因素的优化，并进行了临床检验。我们的研究成果具有制造简便，适合 大批量生产；使用方便，操作简单；测量快速准确；一次性，适合家庭使用的优 点，而且具有较宽的测量范围、较好的线性、重复性和测量精度。从实验室和医 院的使用情况看，传感器的响应均能满足临床要求，因此具有非常广阔的应用前 景。但是这种胆固醇传感器仍然还是处于实验阶段，到产业化大批量生产和实际 应用还需要做很多的工作。今后还需要在提高检测灵敏度和分辨率，延长储存时 间，缩短响应时间，提高重复性等方面进行进一步的研究和探索。 常见的生物传感器一般只包含一种酶，但我们研制的胆固醇传感器则固定有 三种酶。在传感器上固定的酶的种类越多，酶与酶之间的相互作用和影响就越复 杂，传感器的响应就越差。这种多酶传感器无法用简单的酶动力学过程来描述， 它的结果的产生也是一个比较复杂的过程，有些问题我们至今也无法解释清楚。 我们未来需要迸一步研究多酶生物传感器的响应机理和工作过程，希望通过改变 实验方法和条件来完善多酶系统，以期获得更好的结果。 在后面的章节中，我们对8 6 3 项目的研究成果进行了拓展，考虑采用一些新 材料和新方法来构造胆固醇生物传感器，以期获得更优良的响应特性和便利的制 备工艺。 3 4 ，淅夕，六掌 胆固醇生物传感器的研究 硕士学位论文 第三章碳纳米管修饰碳电极的胆固醇生物传感器 3 。l 碳纳米管简介 自从1 9 9 1 年日本i i j i m a 教授在高分辨率透射电镜下发现碳纳米管以来 【1 8 】，由于其特殊的结构和独特的物理、化学、电学特性以及潜在的应用前景 面倍受人们关注。碳的另一种同素异形体石墨是传感器领域应用较广泛的电 极材料，但是在石墨电极上难以直接固定生物分子，而且石墨电极的电子传递效 率不高。近年来，随着对碳纳米管性质研究的深入，越来越多的人将碳纳米管应 用于传感器领域，将其作为种新型的电极材料，取得了理想的效果。 碳纳米管又称巴基管，属于富勒碳系，是一种纳米尺度的具有完整分子结构 的新型碳材料。它是由碳六元环构成的类石墨平面卷曲而成的纳米级中空管，其 中每个碳原子通过s 矿杂化与周围3 个碳原子发生完全键合，各单层管的顶端有 五边形或七边形参与封闭。碳纳米管的径向尺寸为纳米量级，轴向尺寸为微米量 级，具有较大的长径比。碳纳米管有单壁和多壁之分，单壁碳纳米管 ( s i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e ，s w n t ) 【z g 由一层石墨片卷曲而成，管径 一般为1 - - 6 n m ；多壁碳纳米管( m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e ，m w n t ) 【1 8 1 由多层柱状碳管同轴套构而成，层数在2 5 0 之间不等，层与层间距约为0 3 4 n m 。 图3 一l 是单壁碳纳米管的结构模型。图3 2 是碳纳米管的高分辨电子显微镜照片。 碳纳米管的尺寸处在以原子、分子为代表的微观物体和宏观物体交界的过渡区 域，使它既非典型的微观系统也非典型的宏观系统，因而具有表面效应、体积效 应、量子效应和宏观量子隧道效应四大效应。 图3 1 单壁碳纳米管的结构模型 ，浙夕$ z 鲈 胆固醇生物彳毒感器的研究 硕士学位论文 图3 2 碳纳米管的高分辨电子显微镜照片 从左到右为s w n t ，m w n t ( 包含2 层、3 层、4 层、5 层石墨片层) 碳纳米管的主要制备方法有电弧放电法【1 8 】、催化裂解法1 2 0 和激光蒸 发法。其中电弧放电法是在惰性气体气氛中，两根相距几毫米的石墨电极在强电 流作用下产生电弧放电，消耗阳极，在阴极表面产生碳纳米管。催化裂解法是采 用过渡金属作催化剂，在7 0 0 1 6 0 0 k 的条件下，通过碳氢化合物的分解得到碳 纳米管，其机理为：高温下碳氢化合物在催化剂微粒表面热分解出碳原子，碳原 子在金属微粒中扩散，最终在催化荆微粒另一面释放出，形成碳纳米管。催化裂 解法因制备的碳纳米管纯度高、尺寸分布均匀且有望实现规模生产而为人们广泛 研究，并取得了很大进展。激光蒸发法采用激光刻蚀高温炉中的石墨靶子，碳纳 米管就存在于惰性气体夹带的石墨蒸发产物中。碳纳米管的形成过程是游离态的 碳原子或碳原子团发生重新排布的过程。制备s w n t 时，必须添加一定数量的催 化剂，如过渡元素( n i 、c o 、f e 等) ，或者镧系元素( n d 、l a 、y 等) ，这是制备 s w n t 与m w n t 的主要差异。催化剂在s w n t 的生长过程中，能够降低弯曲应力， 促进碳原子排列整齐并且阻止s w n t 两端的富勒烯分子的形成。得到的碳纳米管 的直径分布主要取决于制备方法、催化剂的种类、生长温度等反应条件。 碳纳米管根据其结构的不同具有金属或半导体的性质1 2 1 】，作为电极使用 时，其优良的导电性能够很好地促进电活性物质的电子传递。将碳纳米管微电极 用于探测生物电化学反应和氧的电催化，发现在反应速率及可逆性方面其性能明 显优于其它碳电极。碳纳米管化学性质稳定且不溶于一般的有机溶剂，使得其化 学改性变得较为困难。但当碳纳米管发生断裂时，其断口碳原子却具有化学活性， 竹夕，- 六掌 胆固醇生物传感器的研究 硕士学位论文 容易被氧化成羧基或其它基团。带有羧基的碳纳米管可以通过一系列的化学反应 使之表匿接上各种结构的基团或大分子，得到可溶性碳纳米管 2 2 1 ，从而开辟 碳纳米管的化学研究领域。清华大学的王正元等人 2 3 】用红外光谱研究了硝酸 处理对多壁碳纳米管表面羧基的影响，发现煮沸的硝酸一方面能使碳纳米管细 化，另一方面使碳纳米管断口处碳原子由于不饱和状态而活性提高，可以形成羧 基或者羟基。从红外光谱看，煮沸处理2 h ，可有效地产生羧基，长时间的处理 并不能大量增加羧基的数量，反而可能会使羧基进一步变成c o 。，并可能产生其 他复杂的基团。图3 - 3 表示了碳纳米管经硝酸处理前后，以及连接上葡萄糖氧化 酶( g o d ) 的结构示意图。 图3 - 3 碳纳米管经硝酸处理前的结构( a ) ，硝酸处理后的结构 ( b ) ，葡萄糖氧化酶连接在碳纳米管上( c ) 3 2 碳纳米管在生物传感器中的应用 3 2 i 利用碳纳米管改善生物分子的氧化还原可逆性 将多壁碳纳米管悬浊液滴加于处理后的玻碳电极表面，待溶剂挥发后形成多 壁碳纳米管修饰电极。在p h 6 3 的磷酸缓冲液中( 0 i m ) 进行循环伏安扫描，多壁 碳纳米管修饰电极有一对氧化还原峰，且峰电流与扫描速率成正比，表明这是一 对表面波a 随着底液的p h 值增加峰电位会发生负移，说明电极反应有质子参加。 峰电位的变化值与p h 值之间存在一直线关系且该直线方程的斜率为6 4 m v 口h ， 表明参加电极反应的质子数与电子数相同。与单壁碳纳米管修饰电极相同，这一 表面波来自于碳纳米管表面羧基的氧化还原，并且是一个4 电子4 质子的电极反 。3 7 应过程。其电极反应式表示如下： 还原过程： m w n t c o o h + 4 e + 4 盯j ，槲n t c h 。一o h + h 2 0 ( 3 1 ) 氧化过程： m w n t c h ：一o h + h 2 0 一4 e ，m w n t c o o p t + 4 h + ( 3 2 ) 将碳纳米管修饰电极和玻碳电极分别在0 1 m 的亚铁氰化钾溶液中作循环伏 安扫描。亚铁氰化钾铁氰化钾电对是接近理想状态的准可逆电对，对于一个具 有理想表面状态的电极来说，它的峰电位差( e p ) 接近5 9 m v ( 2 5 。c ) 。经过仔细 处理后的玻碳电极的e p 为8 7 m v ，而碳纳米管修饰电极的e p 仅为6 4 m v 。表明 碳纳米管修饰电极的表面结构更接近于理想状态。 赵广超等人 2 4 1 研究了多巴胺在不同电极上的循环伏安曲线。多巴胺在玻 碳电极上表现出一对准可逆的氧化还原峰，其峰电位差e p 为6 7 m v ，而在碳纳 米管修饰电极上，其峰电位差仅为3 1 m v ，更接近于理想状态下2 电子反应的峰 电位差值2 9 5 m v ( 2 5 。c ) ，同时碳纳米管修饰电极上不同扫描速率时峰电流与扫 速的平方根成正比，峰电位与扫速无关，阴、阳极峰电流之比接近于l 。这些特 征揭示了多巴胺在碳纳米管修饰电极上经历了一个受扩散控制的2 电子电极反 应过程。与玻碳电极相比较，多巴胺在碳纳米管修饰电极上的可逆性变好，峰电 流也大大增加。b r i t t o 等人 2 5 j 也报道了利用溴仿作固定剂的碳纳米管修饰 电极，将多巴胺电化学反应的峰电位差改善到了3 0 m v 。陈朝平等人【2 6 】利用 多壁碳纳米管修饰电极将对苯二酚的峰电位差从2 8 5 m v 降低到了3 8 m v ，同时峰 电流显著增大。这些都体现了碳纳米管对生物分子的电催化作用，显示了其作为 生物传感器的应用潜能。 3 。2 2 利用碳纳米管降低氧化还原反应的过电位 m u s a m e h 等人【2 7 】用碳纳米管修饰玻碳电极，明显地降低了n a d h 的氧化 过电位，显示了显著的电催化活性。也有关于碳纳米管修饰电极降低尿酸、抗坏 血酸和过氧化氢氧化过电位的报道。过氧化氢对于发展基于氧化酶的生物传感器 具有重要的意义，r u b i a n e s 等人 2 8 1 研究了石墨电极和碳纳米管修饰电极在 1 0 1 0 1 m 过氧化氢中的循环伏安曲线。在修饰电极上氧化反应开始于3 0 0 m y 左 右，而还原反应开始于2 0 0 m v 左右，与石墨电极相比，过氧化氢的氧化过电位降 渐夕善幺鲈 胆同醇生物传感器的研究 硕七学位论文 低了3 0 0 m v ，还原过电位降低了约4 0 0 m y ，同时，碳纳米管修饰电极的响应电流 增大，灵敏度比石墨电极提高了5 0 倍。很多酶生物传感器是利用氧化酶将底物 氧化，同时产生过氧化氢，通过在电极表面检测过氧化氢的量来达到生物检测的 目的。碳纳米管修饰电极对过氧化氢的氧化还原表现出优异的电催化效果，这就 有可能将碳纳米管修饰电极用于开发酶生物传感器。基于以上特性，已经将葡萄 糖氧化酶( g o d ) 固定在碳纳米管修饰电极上制成葡萄糖生物传感器1 ：2 7 】。众所 周知，g o d 在氧气的作用下催化葡萄糖的氧化反应，而氧气被转化为过氧化氢。 实验显示，碳纳米管一g o d 修饰电极响应速度更快( 1 0 s ) 而且灵敏度是石墨一g o d 电极的4 3 倍。 3 2 3 利用碳纳米管固定化酶 碳纳米管特殊的中空管状结构具有较大的比表面积，经酸处理后的碳纳米管 具有更多的活性位点，其上的羧基容易与蛋白质上的氨基结合，因而将碳纳米管 用于酶分子的固定可以增加固定的分子数量，从而增强反应信号。碳纳米管对生 物分子活性中心的电子传递具有促进作用，能够提高酶分子的相对活性。同浓度 下，碳纳米管修饰电极的比表面积大，离子扩散阻碍相对石墨电极小，电子传递 更快，电流水平更高。d a v i s 等人1 ：2 9 1 的早期工作将细胞色素c 固定在碳纳米 管上，并保持了其活性。他们的后继研究1 ：3 0 】将p 一内酰胺酶固定在碳纳米管 上，并用高分辨率发射电子显微镜进行了观察。结果表明一部分酶是由于与碳纳 米管内表面有强烈的相互作用而被固定，还观察到了单个蛋白质分子，它的二聚 体、四聚体以及更高级的聚合体被固定在碳管中。比较固定化后的b 一内酰胺酶 和游离酶对青霉素的水解性能，固定化酶保持了显著的催化活性。x i ny u 等人 【3 1 】将辣根过氧化物酶通过氨基和碳管末端羧基的结合共价联结在垂直定向生 长的单壁碳纳米管阵列上，结果表明碳纳米管能够在外部电路和酶的氧化还原活 性中心之间进行电子传递，循环伏安曲线显示，氧化还原峰电位( v s s c e ) 是 0 2 5 v ，峰电流随扫速线性增加，这些都表明酶活性得以较好保持，该电极对过 氧化氢有灵敏的响应。 3 2 4 利用碳纳米管进行直接电子传递 电流型酶传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型。它所要解决的中 丝! ：兰童塑矍皇坠矍登塑塑室 坠兰丝奎 心问题就是使反应能够在恒电位下快速进行，将电子从反应中心转移到电极表 面，形成响应电流。解决生物活性中心与电极表面间的电子转移问题是电流型生 物传感器成功的关键。第一代电流型酶传感器是以氧为电子传递介体的，具有背 景电流大、响应特性差、易受环境中氧浓度的影响、干扰大等缺点。第二代电流 型酶传感器用一些非生理的氧化还原媒介体代替氧，加强了酶与电极间的电子传 输，起到了酶与电极间的电子开闭器作用，加速了电极反应，降低了环境干扰， 克服了第一代电流型传感器的上述缺点，但其中的氧化还原媒介体容易流失。现 在正在研究利用酶与电极之间的直接电子传递来构建第三代酶传感器，它不仅可 以帮助我们理解氧化还原行为的内在规律，还可用于开发出无介体型生物传感 器。y u a n m iz h a o 等人 a 2 1 研究了辣根过氧化物酶在碳纳米管修饰电极上的 直接电化学行为。他们认为碳纳米管可以直接电子传递，一方面是因为碳纳米管 的表面缺陷导致了较高的表面活性，有利于酶和碳管之间的电子传递；另一方面， 碳纳米管独特的纳米结构起到了“分子导线”的作用，促进了电子在酶的氧化还 原中心和电极表面的传递。a n t h o n yg u i s e p p i - e l i e 等人【3 3 】研究了葡萄糖氧 化酶在单壁碳纳米管上的直接电予传递，提出了以下假说。在g o d 的吸附过程中， 由于单壁碳纳米管的纳米级拓扑结构以及和酶具有相似的长度尺寸，允许酶吸附 且不会改变其整体的生物学形状和功能，并且碳纳米管靠近酶的活性中心，在其 电子隧道距离以内。这种情况和用一根长的尖锐的针刺入气球，而球并未破裂类 似。针一旦刺入了球的外皮，就能与球的内部发生相互作用。同样，一些单壁碳 纳米管能够刺穿包裹在g o d 外面的糖蛋白外壳，达到氧化还原活性中心，进行直 接电予传递，而这在普通电极表面是难以做到的。s g w a n g 等人【3 4 1 用自组 装多壁碳纳米管修饰金电极，并在碳管上固定g o d ，实现了电子的直接传递，在 0 6 5 v 和0 4 5 v 的电位下响应电流比玻碳电极有明显增大。图3 4 表示了这个生 物传感器的结构示意图。 ，浙夕$ z 鲈 胆固醇生物彳毒感器的研究 硕士学位论文 图3 - 4 多壁碳纳米管修饰葡萄糖生物传感器结构示意图 3 2 5 碳纳米管在电子鼻中的应用 碳纳米管具有一定的吸附特性，由于吸附的气体分子与碳纳米管发生相互作 用，改变其费米能级引起其宏观电阻发生较大改变，通过检测其电阻变化来检测 气体成分，因此碳纳米管可应用于气敏传感器。 c o l l i n s 【3 5 1 等人研究发现，室温下，放置在氧气中的半导体性碳纳米管 会转化成金属性。碳纳米管在吸附氧原予后电阻会下降，下降幅度最大可以达到 1 5 。c o l l i n s 等人进一步的研究表明，碳纳米管对氧气极为敏感，在氧分压为 1 3 3 1 0 t 1 3 3 1 0 “p a 气体环境中，仍可以测量到碳纳米管电阻的变化，具有 较高的灵敏度。碳纳米管对氧气的敏感特性，主要是因为电子在氧原子和碳纳米 管之间的转移引起的。碳纳米管上的缺陷和中空结构是这种转移得以实现的关 键。k o n g 3 6 1 等人研究了碳纳米管对n o 。和n 地的敏感特性。半导体性的单壁 碳纳米管放置在含n o 。或n h 。的环境中，几秒钟内碳纳米管的电阻变化可以达到 三个数量级。碳纳米管上吸附n 0 ：，会引起其电阻下降，而吸附n h 。导致其电阻 增大。一般地说，空穴是碳纳米管中主要的载流子，吸附n 0 。会引起费米能级下 移，从而靠近价带；而吸附n h 。导致费米能级上移，靠近导带。单壁碳纳米管放 置于含2 1 0 。n o t 的气体中，其响应时间为2 - l o s ，电阻变化i 0 0 1 0 0 0 倍，但 不足之处是恢复时间较长，大约1 2 h ，如果在2 0 0 c 处理，恢复时间也要1 h 。关 于碳纳米管气敏特性的研究还在不断深入中。 4 1 ，浙夕$ z 鲈 胆固醇生物彳毒感器的研究硕士学位论文 3 3 碳纳米管修饰的胆固醇生