（生物医学工程专业论文）曼地亚红豆杉植株中ggpp合成酶的克隆与分析.pdf

华中科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t t e r p e n o i d s ，a l s oc a l l e di s o p r e n o i d s ，a r eag r o u p o fn a t u r a lp r o d u c t sw h i c ha l lf o r m a l l y b u i l tf r o mi s o p r e n i cu n i t t h o s ek i n do fc o m p o u n da r eb i o s y n t h e s i z e db ya r c h a e b a c t e r i u m ， b a c t e r i u m ，f u n g i ，a n dp l a n t m a n yo f t h e s ec o m p o u n d sa r eo fi m p o r t a n te c o n o m i cv a l u e ， e g m e n t h o lo rt a x 0 1 t a x o l ，at e t c y c l i cd i t e r p e n o i ds e c o n d a r yp r o d u c tf r o mt h eb a r ko f y e ws p e c i e s ，h a sb e e na p p r o v e d a sa l le f f i c i e n ta n t i c a n c e rd r u gf o ri t s p o t e n ta c t i v i t y i m p o r t a n te x p e r i m e n t a lt u l n o r sa n di t su n i q u em o d eo fa c t i o n h o w e v e r ，j u s t0 0 1 ( d r y w e i g h t ) t a x o lc a r l e x t r a c t e df r o mt h eb a r ko fo v e r2 0 y e a r - o l dy e w , t h el a c ko fn a t u r a l s o l l f c ea n dl o wy i e l do ft a x o la r et h ec o n s t r a i n t s a tp r e s e n t ，t h e r ei sap o p u l a rc o m m e n t t h a ty e w s u s p e n s i o nc e l l sc u l t u r ew i l l b eap o t e n t i a ls t r a t e g yt or e s o l v et h i sp r o b l e m ，s o t a x o lb i o s y n t h e s i sp a t h w a ya n dr e g u l a t i o no fc o n c e r n e de m z y m e ss h o u l db ee l u c i d a t e d ， w h i c hi st h eb a s eo ft a x o lb i o s y n t h e s i s ，a n dw i l lp r o v i d eh e l po ni n c r e a s i n gt h ey i e l do f t a x 0 1 t o t a lp , _ n aw a se x t r a c t e df r o mf l e s hl e a v ea n dt w i g so f5 - y e a ro l dt a x u sm e d i ac v h i c h s i ia n dt h e n ，m r n aw a si s o l a t e db yp o l y a t t r a c tm r n ai s o l a t i o ns y s t e m i i i ( p r o m e g a ) e d n ae n c o d i n gg g p p s w a sc l o n e du s i n gr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p c rs t r a t e g y 0 nt h ed e s i g no f d e g e n e r a t e do l i g o n u c l o t i d e s ab r i g h tb a n d o fa b o u t6 0 0b pw a s a c q u i r e d a f t e rp c rp r o d u c tr e c o v e r y ，t ac l o n i n g ，w h i t e b l u es c r e e n i n g ，r e c o m b i n a n tp l a s m i d e l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i s a n dp c rt e s t i f i c a t i o n ，o n ec l o n ew a ss e l e c t e df o rs e q u e n c i n g s e a r c h i n gi nt h eo e n b a n kd a t a b a s eu s i n gb l a s t r e v e a l e dt h a tt h ed e d u c e da m i n oa c i d s e q u e n c e o f t h i sc l o n es h a r e d9 8 a n d8 6 i d e n t i t yw i t ht a x u sc a n a d e n s i s ( a a d1 6 0 1 8 1 ) a n da b i e sg r a n d i s ( a a l1 7 6 1 4 2 ) a n dac h a r a c t e r i z e dd o m a i na r e ao fi s o p r e n y ls y n t h a s e f a m i l yw a sf o u n di nt h i sd e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e s a n a l y s i sb yb l a s t p , p r o s i t e ，c l u s t a l x ( 1 8 1 ) a n dp h y l i o ( 3 6a l p t m ) s h o w e d g g p p s i i 华中科技大学硕士学位论文 c d n aw a sc l o n e df r o mg y m n o s p e r mt a x u sm e d i a e v o l u t i o np h y l o g e n e t i ct r e ec o n s t r u c t e d b yp h y l i o i n d i c a t e dt h a tg g p p so ft a x u sm e d i axh i c h s i ib e l o n g e di n t o p l a n tg g p p s b r a n c h ，a n dn e i g h b o r e do nt h a to fa r c h e a b a c t e r i u m t h ec l o n i n ga n da n a l y s i so f g g p p so f t a x u sm e d i axh i c h s i ip r o v i d e dag o o db a s ef o rr e s e a r c ho n t a x o p r o d u c t i o nt h r o u g hy e w c e l lc u l t u r e ，a n df o rc o n s t r u c t i o no f h i g hy i e l d t a x o lg e n e t i c e n g i n e e r i n gp l a n t k e y w o r d s ：t a x u sm e d i ag g p p sr t - p c rs t r u c t u r ed o m a i n p h y l o g e n e t i c t r e e 一一 i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对 本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：艺稆 日期：舶p 年j 碉孚日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密回。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名：弋神童 日期：矽岵妇3 日 指导教师签名：角辞f 日期：- 拜，月g 目 华中科技大学硕士学位论文 符号缩写 i p p i s o p e n t e n yd i p h o s p h a t e异戊烯基焦磷酸酯 d m a p pd i m c t h y l a l i y ld i p h o s p h a t e 二甲基丙基焦磷酸酯 d x p 1 _ d e o x y - d - x y l u l o s e 5 - p h o s p h a t e1 一去氧木糖一5 一磷酸 g p p g e r a n y ld i p h o s p h a t e锟牛儿基焦磷酸 g g p p g e r a n y lg e r a n y ld i p h o s p h a t e糖牛儿基糖牛儿基焦磷酸 o o p p s g e r a n y lg e r a n y ld i p h o s p h a t es y n t h a s e栊牛儿基貔牛儿基焦磷酸合成酶 f p p f a m e s y ld i p h o s p h a t e法尼基焦磷酸 m e p 2 - c m e t h y l - d - e r y t h r i t o l 4 - p h o s p h a t e2 一甲基赤藓糖4 一磷酸 m v am e v a l n a t e f a r mt h ef i r s ta s p a r t a t e r i c hm o t i f 甲羟戊酸 第一天冬氨酸富集区 _ _ _ - _ - _ _ _ - _ 一 i v 华中科技大学硕士学位论文 1 1 萜类及其功能 1 绪言 萜类化合物( t e r p e n o i d s ) 是自然界存在的一类由异戊二烯为结构单元组成的化合物 的统称，也称为类异戊二烯( i s o p r e n o i d s ) 。该类化合物广泛分布于古细菌、细菌、真菌、 植物等生物体内。常见化合物主要有麦角甾醇、赤霉素、脱落酸、类固醇、胡萝h 素、 类胡萝h 素、甾醇、鲨烯、柠檬烯、薄荷醇、甾体皂甙、杜松烯、棉酚、青蒿素、紫 杉醇等，迄今人们已发现了近3 万种藉类化合物1 1 】1 2 】。萜类化合物有许多重要的生物 学功能，例如一些初生代谢物，如赤霉素、脱落酸是植物激素；胡萝卜素类和叶绿素 参与光合作用：醌类是电子传递的载体：警体是细胞膜组成成分；多聚异戊烯磷酸是 多糖合成中的介质。同时，大量的萜类化合物是次生代谢物，例如植物的植保素，虽 不是植物生长发育所必需，但在植物通讯与防御及调节植物与环境之间的关系上发挥 重要的生态功能。有些植物在受到病原微生物侵染后，会产生和积累植物抗毒素，菇 类化合物是其中的主要类型，可以增强植物自身的抵抗力。许多萜类化合物同时具有 很好的药理活性，是中药和天然植物药的有效成分。已经开发出临床广泛应用的有效 萜类化合物药物，如抗肿瘤的紫杉醇、抗疟药青蒿素、避孕药棉酚等，使人们对植物 中萜类化合物产生了浓厚的兴趣和引起了广泛的重视。尤其近年来，随着分子生物学 的发展，萜类化合物成为植物次生代谢研究领域的热点之一，人们试图通过弄清萜类 化合物的生物合成途径及关键酶，结合代谢工程和基因工程等技术使萜类化合物的大 量生产成为可能。 1 2 萜类化合物的代谢途径 长期以来，甲羟戊酸被认为是植物萜类生物合成的唯一前体，因此萜类化合的合 成途径又称为甲羟戊酸途径。甲羟戊酸途径口1 是以乙酰辅酶a 为原料，经甲羟戊酸这 一酊体，形成异戊烯基焦磷酸酯( i p p ) 和其双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸酯 l 华中科技大学硕士学位论文 ( d m a p p ) ，进一步缩含形成倍半萜、三萜和甾体，这些反应均在细胞质中进行，又称 c y t o s o l i cp m h w a y 。 1 9 9 3 年r o h r n e r 4 & 6 1 等通过大量研究证明，萜类化合物的生物合成除甲羟戊酸途 径外，还存在另一条类异戊二烯合成途径。1 9 9 6 年，e i s e n v a i c h 【7 1 等将1 3 c 一葡萄糖和 ”c 一乙酸加入到红豆杉培养细胞，发现c 标记进入紫杉烷中，推断类异戊二烯合成 的另途径在紫杉类植物的存在。称为非依赖甲羟戊酸途径。非甲羟戊酸途径【8 9 1 是以 丙酮酸和磷酸甘油醛为原料，在转酮酶的催化作用下聚合成1 去氧木糖5 磷酸 ( d y e ) 这一前体，经异构化和还原等反应，形成2 甲基赤藓糖4 磷酸( m e p ) 6 0 间体， 再经磷酸化、环化等步骤生成i p p ，从而衍生出胡萝h 素、单萜、二萜等萜类化合物。 该生物合成途径是在植物特有的细胞器一质体中进行。由于1 去氧木糖5 磷酸是 该途径的关键前体，故该途径又简称d x p 途径。 在萜类化合物生物合成的两条途径中，最后都是由5 个碳原子的i p p 和其双键异 构体d m a p p 缩合丽成各种萜类的前体，两条途径的差异是1 p p 的形成途径和机制的 明显不同。不管是m v a 途径，还是d x p 途径，i p p 是“活化”的异戊二烯单元，是所 有萜类生物合成的中心前体。在烯丙基转移酶的催化作用下，i p p 与其异构体d m a p p 经头尾缩合生成具c i o 骨架的犍牛儿基焦磷酸( g p p ) ：g p p 加上第二个i p p 单元形成具 c 1 5 骨架的法呢基焦磷酸( f p p ) ；再加上第三个r p p 单元形成具c 2 0 骨架的栊牛儿基犍 牛儿基焦磷酸( g g p p ) 。最后g p p 、f p p 、g g p p 这三种中间体形成相应的单萜、倍半 萜和二萜类化合物的通用前体。g g p p 是二萜类化含物的通用前体，经环化酶作用可 生成紫杉醇等紫杉烷类化合物。这两条生物合成途径如图1 1 所示： 在高等植物中甾体合成所需的m v a 途径的所有酶均含在细胞质中，质体中合 成的类异戊二烯如胡梦h 素、时绿素的异戊二烯侧链和质体醌以及单萜和二菇则是通 过d x p 途径合成，而倍半萜生物合成的i p p 既可来源于m v a 途径又可来源于d x p 途径，或者来源于两条途径。 植物次生代淤产物是一个巨大的宝库，包含着许多人类急需的医药、工农业生产 等原料，紫杉醇是其中最具代表性的一个。紫杉醇是具有细胞毒的次生代谢物，红豆 杉细胞在j 下常生理条件下很难大量合成，若要大幅度提高紫杉醇含量，进行其生物合 2 华中科技大学硕士学位论文 a l 酰c o a - 一磷酸丙糖一葡萄糖 + 3 一羟基一3 一甲基戊二单酰c o a ( h m g ) h m g r 甲羟戊酸( m v a ) ， 5 一磷酸甲羟戊酸( m v a p ) 0 5 一焦磷酸甲羟戊酸( m v a p p ) 3 一异 b 3 一磷酸甘油醛+ 丙酮酸 i t i 脱氧木酮糖5 磷酸( d x p ) l ，d x r 2 一甲基赤藓糖醇- 4 焦磷酸 i ， 2 甲基赤藓塘酵一4 胞苷二磷酸 + 2 磷酸- 2 甲基赤藓糖醇4 胞营二磷酸 2 甲基赤藓糖醇2 ，4 - 环焦磷酸 y 獍牛儿妻 法尼基黛 磷酸( d m a p p l 萜( 薄荷醇) 甾体( 羊毛甾醇) 萜( 农壳醇) r a s g t p 结合蛋白) p p 合成酶( g g p p s ) 犍牛儿基徙牛儿蓦焦磷酸( g g p p ) 亨、 二萜( 紫杉醇等) 多聚异戊二二烯醇( 类胡萝h 素) 圈1 1 萜类生物台成途径 a ：甲羟戊酸途径 b ：非甲羟戊酸途径 f i 9 1 it e r p e n o i d sb i o s y n t h e s f sp a t h w a y a ：m e 。a l n a t ep a t h w a y b ：m e v a l n a t e - i n d e p e n d e n tp a t h w a y 一一 3 华中科技大学硕士学位论文 成的代谢调控将是决定性的措施，然而只有详细了解其代谢途径、中间代谢酶以及调 节手段等，才能达到有效控制代谢、促进紫杉醇大量合成的目的。 1 3 紫杉醇 紫杉醇最早是于1 9 7 1 年，w 姐i 和w a l l 等t m 】，首次从短技红豆杉( t a x u sb r e v i f o ，枷 的树皮中分离得到，命名为紫杉醇，是一种四环二萜类的生物碱( 其化学结构如图 1 2 ) ，具有显著的抗癌作用，其独特的抗癌机制在于可使微管蛋白和组成微管蛋白的 二聚体失去动态平衡，导致细胞分裂时不能形成纺缍丝，抑制细胞分裂的增殖，使肿 瘤细胞停止在g 2 期和m 期，直至死亡【i “。对晚期卵巢肿瘤、转移性乳腺肿瘤、非小 细胞肺癌，前列腺肿瘤、上胃肠道肿瘤和白血瘸有良好疗效。此外，m a n t h e y 等认为紫 杉醇有明显的细胞周期非依赖性作用，与细菌性脂多糖( l p s ) 一样，具有激活鼠巨噬细 胞杀灭肿瘤的作用。d i n g 等发现紫杉醇还可调节体内免疫功能，对肿瘤细胞起杀伤或 抑制作用。因此认为紫杉醇的抗肿癌机制可能是各种作用或相互作用的结果【1 2 1 。1 9 9 2 年1 2 月2 9 日，美国f d a 正式批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌的新抗癌药物( 商品名 为y a x 0 1 ) f j 4 j ，现已陆续在美国、加拿大、瑞典、英国、澳大利亚、奥地利、中国等 4 0 个国家上市。年需求量在2 0 0 5 0 0 k g 以上具有十分广阔的市场前景。 图l2 紫杉醇化学结构 f i g1 2 c h e m i c a ls t r u c t u r eo f t a x o 4 华中科技大学硕士学位论文 紫杉醇目前主要来源是从红豆杉树皮中提取，这将破坏野生资源和生态环境，而 且天然红豆杉在世界范围内数量很少，生长周期长，从而对紫杉醇的进一步开发利用 造成了很大的困难。因此紫杉醇的来源问题一直受到人们的关注，成为紫杉醇研究开 发的热点。长期以来科学家们为解决这巨大供求矛盾做出了很大的努力，包括筛选 高产红豆杉栽培品种、化学合成、基因工程、细胞培养、真菌发酵、寻找紫杉醇类似 物等，其中对紫杉醇生源途径的研究处于核心地位【l ”。美国华盛顿州立大学生物化学 教授c r o t e a u 领导的研究组和华盛顿大学化学教授f l o s s 领导的研究组在这方面做出了 卓有成效的工作，基本阐明了紫杉醇生物合成框架、并已分离鉴定了多种紫杉醇合成 代谢酶和克隆了相应的酶基因，从而为实现从分子水平调控紫杉醇合成代谢以提高紫 杉醇产量奠定了基础，在寻找及扩大紫杉醇药源途径的研究上取得了极大的进展。 目前紫杉醇的药源途径主要有：1 、植株栽培法即通过杂交的方法，获得生长周 期短、紫杉醇含量高的红豆杉新品种，并与直接提取法相结合来分离提取紫杉醇，国 内外都建立了红豆杉种植园，紫杉醇的含量也不低于野生植株，取得了一定的成效。 但受土壤、气侯、季节等的影响，难以大面积堆广。2 、全合成法：紫杉醇的全合成 虽已获得成功，但合成过程复杂，需2 2 2 5 步反应，难度较大，要真f 用于工业生产 紫杉醇还有一定的距离。3 、半合成法：半合成法是指从红豆杉细枝中和针叶中分离 出来的紫杉醇前体药物1 0 一d e a c t y lb a c a t i n i l i 为原料，合成紫杉醇及同系物，针叶资源 丰富，再生能力强，半合成工艺实验室己趋于成熟，因此半合成被认为是扩大紫杉醇 来源的有效途径，这是目前市场上紫杉醇类物质的主要来源。4 、真菌培养法：从红 豆杉的树皮中分离出能产生紫杉醇的内生真菌，由于真菌生长速度快，来源广，菌种 选育简单，可通过发酵大规模生产。因此通过真菌发酵生产紫杉醇的前景是十分可观 的。目前，真菌培养液中只能获得纳克培养，离产业化生产还很远。5 、细胞培养： 根据细胞全能化的观点，通过细胞培养方式可大量生产紫杉醇。细胞培养方式速度快， 培养条件易于优化，培养过程易于人工控制，不受时间、地域等因素的限制，所以细 胞培养生产紫杉醇从长远来看是解决紫杉醇来源的一条最佳途径。迄今细胞培养中获 得的最高紫杉醇含量已达0 6 ，是成年树皮中紫杉醇含量的3 5 倍以上。同时，可以 通过基因操作，提高关键酶的表达量，从而提高紫杉醇生物合成的水平，这就要求对 5 华中科技大学硕士学位论文 紫杉醇的生物合成途径、催化各步反应( 尤其是关键步骤) 的酶以及编码这些酶的基因 有个全面的了解。红豆杉细胞大舰模培养生产紫杉醇虽取得了一定的成果，前景也非 常乐观，但仍有很多问题需进一步研究，在紫杉醇生产体系中存在细胞增殖与产物积 累的冲突，并且细胞生长状态及生产能力变化很大，难于控制，极大地限制了培养工 作。其主要原因是存在对紫杉醇合成机制缺乏足够的了解。 1 4 g g p p 合成酶( g g p p s ) g g p p 合成酶催化法呢基焦磷酸( f a r n e s y lp y r o p h o s p h a t e ，f p p ) 与异戊烯焦磷酸 ( i s o p e n t e n y ld i p h o s p h a t ei p p ) 缩合反应产生g g p p ，紫杉醇的紫杉烷骨架是由g g p p 环化而成，由g g p p 合成酶催化。该反应处于萜类合成途径的分叉点，高浓度g g p p 是紫杉醇大量合成的前提。g g p p 是赤霉素、胡萝p 素、异戊烯醌和紫杉醇等萜类化 台物的合成前体f 1 7 】。g g p p 在真核生物中参与对包括r h o r a c ，r a p 和r a b 家族在内 的多种蛋白质的翻译后修饰，及蛋白质的槛牛儿基犍牛儿基化f 1 ，由于这种翻译后加 工的修饰对于蛋白质在膜结构( 如细胞膜、高尔基体、核膜等) 上，或是在胞质中的 特异性定位有重要意义，因而被认为可能与膜核蛋自或蛋白核蛋白之间的相互作用有 关。g g p p 合成酶主要的作用是在次生代谢中，调控那些处于代谢分支点前体的代 谢方向2 饥。因此，其克隆和表达特征的分析对于阐明紫杉醇和其他次生代谢产物的合 成机理非常重要。 s i t t h i t h a w o mw 等研究了g g p p s 在植株内的定位问题，他们将g g p p s 与绿色荧 光蛋白( g f p ) 融合表达，通过基因枪轰击拟南芥，发现融合蛋白特异性表达在植株的叶 绿体帮位，证明了g g p p s 是一种叶绿体蛋自。他们的研究还表明，g g p p s 中第一个 天门冬氨酸富集区( t h e f i r s ta s p a r t a t e - r i c h m o t i f , f a r m ) 前第4 位( m e t ) 、第5 位( s e r ) ， 以及f a r m 中的p r o 和c y s 对产物长度起着决定作用 2 1 1 。 拟南芥中存在一个小的g g p p 合成酶基因家族，它们编码5 种不同的酶和一种相 关蛋白。这些同系物在亚细胞结构中有不同的定位，每个g g p p 基因在拟南芥中呈器 官特异性表达【22 1 。 g g p p s 还参与植物的发育过程，z h uc 通过n o r t h e r nb l o t t i n g 发现g e n t i a n al u t e a 6 华中科技大学硕士学位论文 中g g p p s 的表达具有时空特异性在g e n t i a n al u t e a 花期表达，而且其活性只在花瓣 和叶片中检出，而且随着花瓣的发育，其活性逐渐降t f 氐t 2 3 1 。 g p p p s 在曼地亚红豆杉中在植株中时空表达特性，以及结构特点的研究将有助于 阐明紫杉醇类物质的合成，这也是我们进一步研究的目标。 1 4 1g g p p s 的e d n a 克隆 h e f n e r j 等 2 4 j 已成功从加拿大红豆杉中进行了g g p p 合成酶基因的分离、克隆并 在酵母中得到了功能表达。该酶为二聚蛋白，分子量为6 0 0 0 0 a ，m 9 2 十为最佳辅助因子， 丙烯基化合物d m a p p 、g p p 和f p p 均可作为底物，对它们的亲合力大小依次为g p p f p p d m a p p 。其c d n a 片段含有1 1 7 9 b p 的开放阅读框，分子量为4 2 6 k d a ，能 编码3 9 3 个氨基酸残基。从n - 端的一段氨基酸序列推测，它可能是转移肽。它引导该 核基因产物转移到质体，在那里完成蛋白质的水解加工，成为成熟肽。与其它g g p p 合成酶的氨基酸序列比较，推测出与红豆杉其它组织有6 2 7 5 的同源性，与薄菏 中的该酶也有很高的同源性 2 5 】。 b u r k e 等用他们克隆的加拿大红豆杉的g g p p 合成酶作探针，从冷杉( a b i e s g r a n d i s ) 中，克隆出4 个全长d n a ，它们彼此间的同源性大于9 6 ，与所用探针d n a 系列同源性大于6 9 。进一步的实验表明，其中个就是g g p p 合成酶，另3 个是单 萜类的g p p 合成酶。他们将此g g p p 合成酶基因重组到大肠杆菌质粒中，在培养基 中加入g g p p 合成酶的底物i p p 和二甲基烯丙基焦磷酸( d m a p p ) ，检测分析显示， 反应的主要产物是g g p p t 2 6 1 。 g g p p s 的c d n a 克隆成功以及在真核细胞中获得功性表达的事实表明，通过维持 高水平的g g p p 供应能力，同时使限速步骤基因超量表达将可获得高产紫杉醇的工程 细胞株。 1 4 2g g p p s 的诱导与调控 次生代谢的调控不仅具有组织和器官的特异性，而且在特定环境激发下被诱导。 研究次生代谢途径中关键酶及其调控对全面认识植物及植物与环境的关系，用细胞生 7 华中科技大学硕士学位论文 物学技术大量合成对人类有益的次生代谢物具有十分重要的意义。另外，为了使植物 天然产物的品质，构成和产量更加符合人类的使用要求，可以用转基因技术修饰次生 代谢途径。 l a s k a f i s 【2 7 , 2 8 等人报到了紫杉醇生物合成途径中诱导酶的存在，在t b a c c a t a 细胞 悬浮培养的第七天加入茱莉酸甲酯诱导物，发现g g p p 合成酶活性在头6 h 常内快速 增加，到第5 天时活性达到最高，荣莉酸甲酯诱导了g g p p 的合成，而此酶的增加促 进了细胞中紫杉醇的合成与积累，当加入茱莉酸甲酯诱导物2 4 h 细胞中紫杉醇开始积 累，等到第5 天时紫杉醇积累达到最大值，这是首次报到的紫杉醇合成途径中的诱导 酶。 h e f i a o r 2 4 1 等人用茉莉酸甲酯对加拿大红豆杉悬浮细胞进行诱导，g g p p 合成酶和 对应的m r n a 都得以迅速提高，表明茉莉甲酩调控该酶至少在转录水平。 1 4 3g g p p s 与紫杉醇的合成 目前实验已经证明，g g p p 可经环化成紫杉醇的紫杉环骨架。g g p p 环化形成紫 杉二烯( 紫杉环骨架) 然后此双烯萜中间体进行不同程度的氧化，形成完整的紫杉烷系 统【2 5 j 。 g g p p 是植物萜类次生代谢的公共前体，因此，研究g g p p s 对于阐明红豆杉植株 产生紫杉醇的机理具有重要意义。g r e g r o y 等研究了g g p p s 活性和紫杉醇合成的关系， 研究发现在t a x u sb a c e a t a 悬浮细胞培养系中，g g p p s 活性在第3 d 达到顶峰，而紫杉 烷在第9 d 开始检测出，1 9 d 达到峰值( o 0 0 4 于重) ，暗示了g g p p s 的产生导致 紫杉烷的合成。 通过荣莉酸甲酯诱导t a x u sb a c c a t a 悬浮细胞， 6 h 内g g p p s 被诱导表达，5 d 后 达到峰值( 6 0 7p k a t k g ) ，随着g g p p s 活性的提高，紫杉烷在细胞中快速积累。诱导 2 4 h 后可检测到紫杉烷的产生，5 d 后达到顶峰，进一步证明了g g p p s 是决定红豆杉 植物合成紫杉醇类物质的关键酶，并对其进行了纯化【2 9 l 。 从太平洋紫杉幼苗得到的游离细胞制备物能催化 1 - 3 h g g p p 形成个环化的双 萜烯，当接种到茎切段时，能以很高的放射化产率转换成一些高度官能化的紫杉烷类 8 华中科技大学硕士学位论文 化合物如1 0 - - d e a c e t y l b a c c a t i n l i i 及紫杉烷等。加入标记的g g p p 到紫杉茎提取液中， 并进行放射化学方面的分离，最后通过二维n m r 光谱方法证实g g p p 环化产物紫杉 二烯的结构为4 ( 5 ) ，2 2 ( 1 2 ) - t a x a d i e n e ，因此紫杉醇生物合成的第一步重要反应是自 然界广泛存在的双萜烯前体g g p p 环化而成4 ( 5 ) ，2 2 ( 1 2 ) - - t a x a d i e n e ，而不是紫杉烯 化合物在4 ( 2 0 ) ，( 1 2 ) 位置存在的双键结构而推测的4 ( 2 0 ) ，l l ( 1 2 ) - - t a x a d i e n e 3 0 1 。 所得产物与红豆杉幼茎共培养后可得到l o - - d e a c e t y l - b a c c a t i n l i i 和紫杉醇在内的多种 紫杉烷化台物。 1 5 研究内容及意义 本课题是对二萜类合成的通用前体g g p p 的合成酶g g p p 合成酶进行克隆及序列 分析。根据g g p p 合成酶的保守性序列设计引物，以曼地亚红豆杉为材料，通过r t - p c r 技术扩增出c d n a ，再以e d n a 为模板，扩增g g p p 合成酶基因片段，将该片段克隆 在质粒载体上，并转到大肠杆菌中进行鉴定，最后避行序列分析。 对二萜类合成的通用前体g g p p 合成酶进行分子克隆及表达分析的研究，进一步 阐明g g p p s 在次生代谢途径中的作用，揭示紫杉醇的生物合成途径、关键酶及分子 调控机制，以及构建高产紫杉醇的转基因植株奠定基础，为人工栽培，细胞培养大规 模生产紫杉醇提供理论指导。 9 华中科技大学硕士学位论文 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 2 r n a 抽提与纯化 ( 1 ) 琼脂糖 ( 2 ) 丙烯酰胺 ( 3 ) 甲叉双丙烯酰胺 ( 4 ) 去离子甲酰胺 ( 5 ) 澳酚兰 ( 6 ) t e m e d ( 7 ) 二甲苯青f f ( 8 ) 溴化乙锭( e b ) ( 9 ) 焦碳酸乙二酯( d e p c ) ( 1 0 ) 氯仿异戊醇：2 4 1 ( v ，v ) ( 11 ) 异硫氰酸胍溶液：4 m o l l 异硫氰酸胍2 5 m m o l l ( p h 7 0 ) ，0 5 ( w v ) ， 十二烷基肌氨酸钠，o 1 m 0 1 r l 巯基乙醇。 ( 1 2 ) d e p c 处理水：加l m l 焦碳酸z , - - - - 酯( d e p c ) ，至i 0 0 0 m l 超纯水中，充分振 荡，3 7 。c 温育过夜，高压灭菌使d e p c 失活。 ( 13 ) 5 x 甲醛凝胶电泳缓冲液：0 1 m o l l m o p s ( p h 7 0 ) 4 0 m m o l l 乙碳钠，5 m m o l l e d t a ( p h 8 o ) 。称取2 0 6 93 一( n 玛琳代) 丙磺酸( m o p s ) 溶于8 0 0 m l 经用d e p c 处理的5 0 m m o l l 乙酸钠溶液。用2 m o l l 氨氧化钠将溶液的p h 值调至7 0 ， 加1 0 n , 经用d e p c 处理的0 5 m o l le d t a ( p h 8 o ) ，再加经用d e p c 处理的水 至溶液总体积为1 l 。上述溶液经用0 2 v m 微孔滤膜过滤除菌，避光保存于室 温。光照或高压后溶液逐渐变黄，淡黄色的缓冲液可正常使用。而深黄色缓冲 1 0 华中科技大学硕士学位论文 液则不然。 ( 1 4 ) 甲醛凝胶加样缓冲液：5 0 甘油，l m m o l le d t a ( p h 8 o ) ，0 2 5 溴酚蓝，0 , 2 5 二甲苯青f f 。 ( 1 5 ) 4 0 n 烯酰胺溶液：丙烯酰胺3 8 9 ，n ，n 亚甲双丙烯酰胺2 9 ，加水定容至1 0 0 m l ( 1 6 ) t b 溶液：称取p i p e s 3 0 9 ，c a c l 2 2 h 2 02 2 9 ，k c l1 8 6 9 ，加水到9 5 0 m l 。用5 n k o h 调p h 至6 7 6 8 ，低p h 不溶。加入相应量的m a c l 2 。0 4 5 岫过滤除菌， 44 c 保存。 ( t 7 ) 固定液：以双蒸水配制成1 0 ( v v ) 的冰乙酸溶液。 ( 18 ) 染色液：i ga g n 0 3 ，1 5 m 1 3 7 甲醛溶液，加双蒸水定溶至1 0 0 0 m l 。 ( 1 9 ) 显色液：3 0 9 n a z c 0 3 ，1 5 m 1 3 7 甲醛溶液，2 m g n a 2 s 2 0 3 5 h 2 0 ，加双蒸水定溶 至1 0 0 0 m l 。 ( 2 0 ) t b e 电泳缓冲液( 1 0 贮存液) ：1 0 8 9 t r i s 碱，5 5 9 硼砂，4 0 m l0 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，加水至1 l 。 ( 2 1 ) 超纯水器 ( 2 2 ) 涡旋混匀器 ( 2 3 ) 台式高速冷冻离心机( h i t a c h i 公司) ( 2 4 ) 凝胶电泳装置( 北京六一仪器厂) ( 2 5 ) 凝胶成像系统( s y n g e n e 公司) ( 2 6 ) u v - 2 0 0 1 分光光度计 2 1 2 方法 2 。l 。2 1 样品采集 从北京采集的曼地亚红豆杉( t a x u sm a d i ac v h i c k s i i ) 植株组织，取新鲜的红豆杉 叶片用水冲洗2 4 h ，再用1 ：1 0 0 的8 4 消毒液消毒1 0 r a i n ，晾干后备用。 2 1 。! 2r n a 的提取 ( 1 ) 敢1 5 9 新鲜的红豆杉叶片放在研钵中，加入0 0 1 9 石英砂，0 0 1 9 p v p ，然后加 入液氮。迅速研磨成均匀的粉末，转入冰上预冷的5 0 m i 离，t l , 管中。 华中科技大学硕士学位论文 ( 2 )向离心管中加入1 5 m l 变性液，轻轻摇动使之混合均匀，- 7 0 0 冻融两次， ( 3 ) 6 0 温育l 3 m i n ，将离心管放置于冰上。 ( 4 ) 按顺序加入2 m o l l n a a c1 5 m l ( p h 4 0 ) ，冰浴1 5 3 0 m i n 。 ( 5 ) 于4 0 ，1 5 0 0 0 9 离心3 0 m i n ，将上清转移至另一个干净的离心管中。 ( 6 ) 加入5 m 1 5 m o l l 的k a c ，冰浴2 0 m i n 。 ( 7 ) 于4 * 0 ，2 0 0 0 0 9 离心1 0 m i n ，将上清转移至另一个干净的离心管中。 ( 83 加入水饱和酚1 5 m l 和氯仿，异戊醇3 m l ，剧烈振荡1 0m i n ，冰浴1 0 m i n 。 ( 9 ) 于4 。0 ，1 5 0 0 0 9 离心3 0 m i n ，将上清转移至另一个干净的离心管中。 ( 1 0 ) 加入等体积的异丙醇，混匀，置- 2 0 * 0 冷冻1 h 。 ( 1 1 ) 于4 c ，3 0 0 0 9 离心2 5 r a i n ，弃上清，沉淀溶于5 m l 变性溶液中。 ( 1 2 ) 加入5 r o t 水饱和酚，3 m l 氯仿异戊醇，振荡使之混合均匀，冰浴放置1 0 m i n ， 4 。0 ，1 3 0 0 0 9 离一t l , 3 0 m i n 。 ( 1 3 ) 小一t l , 转移上清至另干净的离心管中。加入6 0 0 t 1 1 2 0 倍( v v ) 2 m o l l n a a c ( p h 4 0 ) 和等体积的异丙醇，混匀，置一2 0 冷冻3 0 m i n 。 ( 1 4 ) 于4 o 1 3 0 0 0 9 离心2 0 m i n ，沉淀用7 5 乙醇洗2 遍，晾干后，溶于3 0 5 0 1 t l 体积的d e p c 处理水中。经紫外检测和甲醛变性凝胶电泳检测后分装，置7 0 保存备用。 2 1 ，2 3m r n a 的分离与纯化 21 2 3 i 总r n a 的纯度鉴定 ( 1 )预热紫外分光光度计3 0 r a i n 。 ( 2 ) 用d e p c 处理水调零和1 0 0 。 ( 3 ) 将r n a 样品有用d e p c 处理水稀释5 0 倍( 4 1 至1 0 0 0 9 1 ) 。 ( 4 ) 读取2 6 0r i m 、2 8 0r i m 、2 3 0 n r n 处的o d 值。 2 1 2 ，3 2r n a 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测 由子i l n a 是单链，很易形成二级结构，因此在电泳过程中变性条件非常重要， 一般常用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。 ( 1 ) 处理电泳槽：分别用去污剂和纯水彻底清洗电泳槽和梳子，然后用7 0 乙醇风 2 华中科技大学硕士学位论文 干，再在常温下用3 的双氧水浸泡l o 2 0 m i n ，最后用无r n a s e 的超纯水清洗 数次。 ( 2 ) 凝胶制备( 在通风橱内进行) ：称取l g 琼脂糖，置1 0 0 m l 锥形瓶中，加入6 2 m l 蒸 馏水，加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶晾至6 0 ，依次加入1 8m j 甲醛、2 0 m l 甲醛凝胶电泳缓冲液( 5 ) ，混合均匀。用胶布封住胶板的两端，将凝胶溶液倒 入胶板中，厚度为5 r a m 左右，插上梳子，室温放置l h 左右，凝胶已经完全凝 固，并撕掉胶板两边的胶布，然后将胶板放入电泳槽内，加入电泳缓冲液，液 面高出胶面1 2 r m ，小心移去梳子，检查样品孔是否完整。 ( 3 ) 样品准备：取d e p c 处理过的无菌离心管中，依次加如下试剂 5 甲醛凝胶电泳缓冲液2 o “i 甲醛 3 5 a l 甲酰胺( 去离子)1 0 p l r n a 样品 4 5 r t l 混匀，于6 5 ( 2 温育1 5 r a i n ，冰浴2 m i n 冷却，离心5 r a i n 使液体集中于管底。加 3 1 s 1 1 m g m l e b ，加2 1 z l 灭菌的经d e p c 处理的甲醛凝胶电泳缓冲液。 ( 4 ) 点样：用2 0 1 n 1 的移液管取r n a 样品5 m 加入样品孔内。同样方法点上r n a 分子量标准物。 ( 5 ) 电泳：3 4 v & m 电压进行电泳澳酚蓝泳动至胶3 4 时停止电泳。 ( 6 ) 电泳结束后，将凝胶取出，放入凝胶成像系统进行扫描，调节参数，使图像效 果最佳。 21 2 ，3 1 3m r n a 的纯化 m r n a 纯化采用磁珠分离法( p r o m e g a 公司) 。 ( 1 ) 把一定量的总r n a 加入到1 5 m l 的小管中，用无r n a s e 水定容到5 0 0 1 。 c 2 ) 6 5 温育1 0 m i n 。 3 ) 加入3 灿生物素标记的o e z o ( d t ) 探针和1 3 m2 0 s s c ，轻轻混匀，室温放置一 段时间，使之冷却。 (