培养基及其配制.ppt

第3章培养基及其配制,讲授：白凤麟2013.09.26,培养基的种类培养基的组成培养基的配制,本章主要内容,培养基形态不同：固体培养基、液体培养基培养过程不同：初代培养基、继代培养基其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基营养水平不同：基本培养基、完全培养基,一、培养基的种类,二、培养基的组成,植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等点化学方面的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。,无机营养成分+有机营养成分=基本培养基,Arnon和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准,A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史。B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复。C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。,国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。,根据植物体内含量多少，可把这些元素分为大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S9种微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kgFe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl7种,按照国际植物生理协会的建议：所需浓度0.5mmol/L的元素为大量元素所需浓度0.5mmol/L的元素为微量元素,1、大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4NaH2PO4等。K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。,Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。,2、微量元素在微量元素中，铁的使用最大：一些氧化酶的组成成分叶绿素形成的必要条件使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀,硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长锰参与植物的光合、呼吸代谢钼参与氮素的代谢氯是光合作用水光解的活化剂微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。,缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。,桃树,缺铜症状：新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。,菊花,缺锰典型症状：叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。,菜豆,缺钼典型症状：叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。,白菜,缺硼典型症状：受精不良,籽粒减少，“花而不实”，“蕾而不花”；根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；常引起各种腐烂病。,马铃薯,3、碳源碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。糖类物质特点：具有热易变的性质利于吸收和利用使用浓度一般在2%5%提供能源和调节渗透压,4、维生素类以各种辅酶的形式存在参与多种代谢活动对生长，分化等有很好的促进作用主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素常用维生素有VB1和VB6,5、肌醇环己六醇细胞壁的构建材料参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动促进活性物质发挥作用,6、氨基酸蛋白质的组成成分有机氮源可直接被细胞吸收利用培养基中常用的是甘氨酸7、天然复合物促进某些愈伤组织和器官的生长化学成分不明、复杂天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物,8、琼脂是使用最普遍的凝固剂用量一般在610g/L之间颜色以浅、透明度高好，洁净为上品除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。,9、活性炭吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质抑制外植体褐变防止玻璃苗的产生促进培养物生长和分化促进生根缺点：没有选择性10、抗生素防止外植体内生菌造成的污染,活性炭,11、生长素类促进细胞伸长和分裂促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实诱导愈伤组织形成溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好常用的生长素：IAA(吲哆乙酸)NAA(奈乙酸)2,4-D(二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸),生长素作用强弱顺序：,2，4-D常用于诱导愈伤组织，IBA和NAA常用于生根,12、细胞分裂素类促进细胞分裂和分化诱导胚状体和不定芽的形成延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成用于离体成花的调控溶于0.51.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中常用的细胞分裂素：KT(激动素)BA(6-卞基腺嘌呤)ZT(异戊烯氨基嘌呤)玉米素,2019/12/12,27,可编辑,13、赤霉素类和脱落酸A、赤霉素类组织培养中不常使用加速细胞的伸长生长促进细胞的分裂主要是GA3B、脱落酸抑制细胞分裂和伸长促进脱落和衰老促进休眠和提高抗逆能力,14、水作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。注意：用蒸馏水，最好是双蒸水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。,1、MS培养基无机盐浓度高高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐含有一定数量的铵盐营养丰富不需要添加更多的有机附加物,（一）、几种常见培养基的特点,（二）、White培养基1943年由White为培养番茄根尖而设计1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素无机盐浓度较低使用广泛在生根培养、胚胎培养中有良好的效果,（三）、B5培养基1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计含有较低的铵盐较高的硝酸盐和盐酸硫胺素,（四）、N6培养基1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他禾谷类植物的花粉和花药培养。,AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出现浓度：1-10mg/L抗生素：种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等。作用：可防止外植体内生菌污染。浓度：520mg/L。,1、母液(stocksolution)的配制和保存所谓母液是欲配制液的浓缩液。意义:保证各物质成分的准确性配制时的快速移取便于低温保藏。,三、培养基的配制,单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用mg/ml。混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等,母液的配制方法：,培养基母液的配制,MS母液配制：MSI大量元素20XMSII微量元素200XMSIII铁盐200XMSIV有机物200XMSV肌醇200X激素0.1mg/ml,将1、2、4、5称好放入烧杯分别溶解混合，将3最后混合，再定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MSIX202013.9.26HXH,注：Ca2+和S042-混合后易沉淀。,将17称好放入烧杯分别溶解混合，定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MSIIX2002013.9.26HXH,MS(铁盐),配方用量mg/L,200X（mg）,称量(g),1.FeSO47H2O,27.8,5560,5.56,2.Na2EDTA2H2O,37.3,7460,7.46,将1称好放入烧杯甲溶解，将2放入烧杯乙溶解，再混合定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,1L,MSIX2002013.9.26HXH,将1、2、3、4称好放入烧杯分别溶解混合，定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MSIVX2002013.9.26HXH,将肌醇称好放入烧杯溶解定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MSVX2002013.9.26HXH,母液配制时应注意事项：母液配好后放人冰箱内低温保存（4），用时再按比例稀释。其中III、IV、以及激素类物质应以棕色瓶盛装。母液使用前摇动瓶子，如有沉淀、絮状物、微生物污染应停止使用取样时移液管要对应取样，防止交叉污染,2、培养基的配制：MSBA2NAA0.2糖3.0琼脂0.7pH=5.8MS：MSI50mlMSII5mlMSIII5mlMSIV5mlMSV5mlBA：20ml;NAA：2ml糖：30g;琼脂：7g,V贮备液用量V配制/浓缩倍数V激素贮备液C激素*V配制/0.1mg/ml,培养基的选择,培养基基本培养基植物激素培养基的选择在实质上讲就是设计营养物质与激素（种类、用量）的最佳组合。,筛选培养基常用的试验方法：单因子试验多因子试验逐步添加和逐步排除试验,1、单因子试验只变动一个因子，通过试验找出该因子的影响及影响程度。如：MS+BA2+NAA（0.1、0.5、1.0mg/L）MS+BA+NAA0.1（1.0、2.0、3.0mg/L）不能反映各种单因子成分之间的组合效果与相互影响,2、多因子试验对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验。,2种激素5种浓度的实验组合（单位：mg/L）,例如研究NAA和BA的最佳浓度组