（生物医学工程专业论文）双链DNA芯片的制备及其应用研究.pdf

东南大学博i ：学位论文 点能够被相应的内切酶识别并切割。这种结果进一步表明，按照不同需要制备般链d n a 芯片可用于研究 多个d n a 蛋白质序列特异性地相互作刚。这也预示烈链d n a 探针通过在片生化修饰，能够_ l j 丁_ d n a 转录因子多步骤的基因调控研究。 4 r hn f k bp s 0 二聚体与d n a 序列特异性的相互作用研究 利用方法1 1 制备了包含n f r bp 5 0 二聚体蛋白识别的野生型结合位点以及所有可能发生的单碱基突 变的结合位点的双链d n a 芯片。通过比较不同结合位点与荧光标记的n f - r bp 5 0 二聚体的结合效率，每 一个碱基对丁- d n a p 5 0 p 5 0 蛋白质相互作用的重要性都得到评价。结果显示每个碱基对于这种结合亲和率 的影响是不一样的。g l 、g 2 和c 1 0 巧对于p s d p 5 0 l g r b 的高亲和力的结合是最为重耍的，任何其他碱基的 替代都会导致亲芹力的极人降低。相比较而育，g 3 、a 4 、t 8 和c 9 对于这种高亲和力的结合的贡献就小一 些，不同碱基的替代导致不一样的亲和力的改变。c ；对于p 5 0 p 5 0 i g - l z b 的相互作用是最不重要的，改变为 其它碱基影响很小。在所有可能的单碱基突变中，t 8 突变为c 时相反地还能提高这种结合亲和力。t 7 与其 对称碱基c 5 的作用是不一样的，中轴碱基t 6 对于p 5 0 p 5 0 i g r b 高亲和力的结合也是至关重要的。实验证 明，这种单分子舣链d n a 芯片可以提供以提供一种可靠的方法来分析d n a 结合蛋自与大量的不同结合位 点见的结合亲和力的变化。 5 r hn f - k bp s 0 二聚体与单碱基错配d n a 的相互作用研究 研究d n a 结合蛋白与含有不同单碱基错配的识别位点间的相互作用对于揭示蛋向质与d n a 靶序列间 的序列特异性结合的机理同样也是非常有价值的。我们利用方法1 1 1 制备了包含n f - 1 c bp 5 0 二聚体蚩向识 别的野生型结合位点以及所有可能发生的单碱基错配的结台位点的敏链d n a 芯片。我们用错配位点的杂 交信号与野生型位点的杂交信号的比值来说明不同碱基位置上引入错配对n f - r bp 5 0 的杂交亲和率的影 响。结果显示，1 “w 、2 a w 、3 a w 、4 9 w 、5 t w 、6 e w 、7 e w 、8 e w 、9 t w 和1 0 t w 分别为0 4 8 、0 ，4 9 、 o4 5 、o 4 9 、1 0 7 、o 7 7 、0 0 3 7 、0 ，4 4 、0 4 6 和o 3 5 。通过比较不同结合位点与荧光标记的n f - r bp 5 0 二 聚体的结合效率，我们可以得出与蛋白质发生作异 的不同碱基在d n a 蛋白质相互作用中的不同重要性。 同时我们比较了单碱基错配与单碱基突变对n f - r , bp 5 0 二聚体与不同d n a 位点的影响，发现在一些碱基 上引入错配和突变对于缩台亲和率的影响是不完全一样，这种结果的原因可能是有些错配可能导致d n a 烈链在空间上更容易与p 5 0 二聚体发生接触，而有些碱基正好相反。实验结果进一步证明了我们的双链 d n a 芯片，不但能够高通龄的研究n f - 1 c bp 5 0 二聚体蛋白与发生单碱基突变的结合位点之间的相互作用， 同样也能很好的研究与单碱基错羁己位点之间的相互作用。 6 基于双链d n a 芯片的n f - v b 蛋白标记检测方法 在烈链d n a 芯片的应用中，主要通过蛋白质的直接荧光标记或对应抗体标记的方法进行检测。真接标 记待检测蛋自的方法有明显的缺点。因为检测细胞核提取物中的d n a 结合蛋白时，直接标记可能会导致蛋 白质失活；而且很多转录因子的表达景很低，经过荧光标记过程会导致蛋白质信息丢失。标记抗体的方法 相对i 丁前者来说免去了待检测蛋白的标记这步。但是该方法却要标记蛋白质的抗体。这种方法虽然能达 到蛋白质的检测目的，但对于多个蛋白的检测来说是不经济的。多个抗体的杂交反应也有可能导致交义结 合。我们发展了两种新的非标记蛋白质检测方法：内切酶介导的检测法和半位点检铡法。将待检测的蛋白 质的觜转换为标记荧光的探针的量通过检测标记的d n a 探针的景而达到检测蛋向质的目的。半位点检测 法在操作上非常简单，具有比较好的重复性。通过比较四种基于双链d n a 芯片的d n a 结合蛋白的检测方法 ( n f ，r b 蛋白直接荧光标记检测法、抗体标法检测记、内切酶酶切介导的n f 一1 c b 蛋白1 f 标记检测法、基于 、p 位点般链d n a 芯片的非标记检测蛋向缔合蛋白的方法) 的荧光强度- 蛋白质浓度曲线图，表明我们提出 的非标记方法更适合丁不同状态f 蛋白质表达高低的检测。 7 不同结构的同定化双链d n a 探针核酸杂交性能的比较 我们提山了一种双链d n a 探针检测和核酸序列的方法，并比较三种不同结构的固定化探针的核酸杂交 能力。研究发现公共苇干区的发卡结构探针( s h a r e s t e mh a i r - p i ns t r u c t u r ep r o b e ，s h p ) 的杂交能力最强， v 中文摘要 直链探针( l i n e a rp r o b e ，l ) 次之普通的发 结构探针( h a i r - p i ns t r u c u r ep r o b e ，h p ) 最差。但是，在单 碱基错配识别能力方面正蚶相反。我们通过增加两种发仁结构探针的笔干区的t m 值，发现随着t m 值得增 加，虽然降低了它们的杂交能力却明显地提高了它们的杂交特异性。通过优化杂交温度，发现在4 5 f ， h p 2 8 t 1 1 s h p 。3 2 t 的d r 都达剑8 5 。而直链探针的d r 值一般都在0 3 o 7 左右。本章的实验结果说明，发卡 结构的崮定化探针同样能够像分子信标一样进行单碱基错配的识别。研究表明，同定化的双链d n a 探针不 仅能够降低探针的合成成本，而且避免了分子信标由下白复性不完全而造成的背景问题。 8 吲定化的双链d n a 探针结构用于单碱基错配识别 通过延艮s h p 探针的辈干区序列，我们发展了一种新的阑定化双链d n a 探针用以单碱基错配识别。 该探针的具体设计方法为：将s h p 探针的苇干区全部置丁杂交区的内部，并将中间碱基设置一个错配识别 位点。在一组止配和错配探针中，我们将正配碱基内部( 楚干区) 引入一个错配碱基用以提商正配探针的 杂交效率，而错配探针f 勺碱基不变，即笨干区仍为正配。通过在不同温度和m 9 2 + 浓度下的杂交实验，证明 了这种新喇的碳链d n a 探针具有更强的单碱基错配识别能力。我们相信，这种双链d n a 探针同样也能适 用于分子信标的研究和应用。 通过上述实验研究表明，双链d n a 芯片作为一种高通量的研究手段。对于研究d n a 蛋白质的相互作 1 j ，以及预测d n a 结台蛋白潜在的结合1 ：i ) = 点是非常有帮助的。阕而，我们可以预测，般链d n a 芯片将在 以f j l 个方面的具有湔在的应用：( 1 ) 在全蛋向质组的规模上对d n a 结台蛋白进行探测；( 2 ) 在全基冈 组范闱扫描d n a 结合蛋白的不同结合位点：( 3 ) 了解d n a 蛋白质复合物中不同碱基和氨基酸之间的作用 情况：( 4 ) 比较不同组织或同一组织在不同状态卜备种d n a 结合蛋白的表达水平：( 5 ) 对可能受同一组 d n a 结合蛋白调控的基因进行分类：( 6 ) 探索基因表达调控网络：( 7 ) 发现新的与d n a 结合蛋白或其结 台位点相关的药物靶标；( 8 ) 探测可能的与d n a 结合的小分子药物后核受体；( 1 0 ) 寻找与d n a 结合蛋 白相关的并可用于疾病诊断的生物标记物( b i o m a r k e r s ) 。同时我们也证明了固定化的双链d n a 探针同样 也适用于大规模d n a 样品的检测。 关键词：坡链d n a 芯片，d n a 结台蛋白，单碱基多态性 a b s t r a c t 英文摘要( a b s t r a c t ) t i t l e ：s t u d i e sa n da p p l i c a t i o n so fd o u b l e s t r a n d e dd n am i c r o a r r a y c a n d i d a t ep h d ：b a iy u n f e j s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rl uz u - h o n g n a m eo ft h eu n i v e r s i t y ：s o u t h e a s tu n i v e r s i t y f o rt h ea d v a n t a g e so fe a s ym a n i p u l a t i o n ，c h e a p ，h i g ht h r o u g 】1 p u ta n ds e n s i t i v i t y , d n am i c r o a r r a yh a sb e e n w i d e l yu s e d i nt h ef i e l d so fg e n o m i c s ，p h a r m a c o l o g ya n dm e d i c a lt e s t ，e r e t h ei n t e r a c t i o n so fd n a b i n d i n g p r o t e i n sa n dd n a - b i n d i n gd r u g sw i t hd o u b l e - s t r a n d e dd n a ( d s d n a ) i ng e n o m ea t ei n v o l v e di nm a n yi m p o r t a n t b i o l o g i c a lf u n c t i o n s m o s to fd i s e a s e sa r ea s s o c i a t e dw i t ht h ea b n o r m a li n t e r a c t i o n sb e t w e e nd n a sa n dd n a b i n d i n gp r o t e i n s m o s to ft h ed n am i c r o a r r a yi sa p p l i e di nt h en u c l e i ca c i d d e t e c t i o n sb yi m m o b i l i z e d s i n g l e - s t r a n d e do l i g o n u c t e o t i d e s h o w e v e r , d n ab i n d i n gp r o t e i n sm a i n l yr e c o g n i z es e q u e n c es p e c i f i c d o u b l e s t r a n d e dd n a s s o i ti sav e r ys i g n i f i c a n tw o r kt od e v e l o ps e v e r a lk i n d so fd o u b l e s t r a n d e dd n a ( d s d n a ) m i c r o a r r a y sf o rt h es t u d y i n gd n a p r o t e i ni n t e r a c t i o n f u r t h e r m o r e ，w eh a v ei m p r o v e dt h ed e s i g no f i m m o b i l i z e dd s d n ap r o b e si nt h es n pd e t e c t i o n t h em a i nw o r k sd u r i n gm yp h d s t u d ya r ea sf o i l o w s ： 1 t h em a n u f a c t u r eo f t h ed s d n am i c r o a r r a y s i ot h i sp a r t w eh a v ed e v e l o p e da n dc o m p a r e ds e v e r a lm e t h o d st of a b r i c a t ed s d n am i c r o a r r a y m e t h o di ： l m m o b i l i z e das i n g l e s t r a n d e do l i g o n u c l e o t i d ea n da n n e a l e dw i t has h o r to n e t h e nc o n v e r t e di n t oa d o u b l e - s t r a n d e d p r o b eb yo n - c h i pp o l y m e r a s ee l o n g a t i o n ；m e t h o d i i ：i m m o b i l i z e da h a i r p i n s t r u c t u r e s i n g l e s t r a n d e do l i g o n u c l e o t i d ea n dc o n v e r t e di n t oad o u b l e - s 仃a n d e dp r o b eb yo n - c h i pp o l y m e r a s ee l o n g a t i o n ； m e t h o d1 1 1 ：a n n e a l e dal o n gs i n g l e - s t r a n d e do l i g o n u c l e o t i d ew i t hah a i r p i np r o b et oc o n v e r t e da u s h a p e d o l i g o n u c l e o t i d e ，a n dt h e nc o n v e n e di n t oad o u b l e - s t r a n d e dp r o b eb yo n - c h i pp o l y m e r a s ee l o n g a t i o na f t e r i m m o b i l i z a t i o n ；m e t h o di v ：i m m o b i l i z e daw h o l ed o u b l e - s t r a n d e dp r o b ew i t hah a i r p i ns t r u c t u r e d i r e c t l y s e l f - h y b r i d i z a t i o nt oc o n v e r ti n t oad o u b l e - s t r a n d e dd n ap r o b e w ec o m p a r e dt h ef o u rm e t h o d sa n df o a n dt h a t m e t h o di ia n dm e t h o di va r et h em o s te r i e c t i v ew a y st of a b r i c a t ed s d n am i c r o a r r a y h o w e v e r , f o rt h en e e do f v a r i o u sr e s e a r c ha p p l i c a t i o n s e v e r ym e t h o dh a si t so w na d v a n t a g e s 2 o p t i m i z a t i o no f d s d n am i e r o a r r a yf a b r i c a t i o n i no r d e rt om a k ed s d n am i c r o a r r a ye f f e c t i v e l ya n de c o n o m i c a l l y , s o m ep r e l i m i n a r yw o r k sw e r ep e r f o r m e d o nt h ed s d n am i c r o a r r a yf a b r i c a t i o nb yu s i n gm e t h o d1 1 f i r s to fa l l ，w eh a v eo p t i m i z e dt h ed e s i g np r i n c i p l eo f t h eh a i r p i ns t r u c t u r e ，i n c l u d i n gt h ed e s i g no ft h es p a ns e q u e n c e ，t h eb a s en u m b e ro ft h el o o pa r e aa n dt h e p a l i n d r o m ea r e ai n t h eh a i r p i n a f t e rt h eo p t i m i z a t i o n ，t h ed e s i g np r i n c i p l eo ft h e h a i r p i ns t r u c t u r ew a s s u m m a r i z e da sf o l l o w s ：( 1 ) l o n g e rs p a ns e q u e n c eo fi m m o b i l i z e dp r o b ei sf a v o r a b l ef o rt h ed n a i ：l r o t e i n i n t e r a c t i o n f o rt h en f r d 3p r o t e i n a ti e a s ts i xb a s e ss h o u l db eu s e d ( 2 ) t h ep a l i n d r o m ea r e ai nt h eh a i r p i ns h o u l d n o ts h o r t e rt h a nf o u rb a s e s a l lo f t h ep a l i n d r o m ea r e au s e di no u ri a r e rw o r kw a sf i v eb a s e s ( 3 ) i nt h ef i v eb a s e s p a l i n d r o m ea r e a ，g o o de l o n g a t i o nr e s u l ta l s oc o u l db eo b t a i n e dw i t h o u ta n yl o o pb a s e f u r t h e r m o r e ，w eh a v e d i s p l a c e dt h ek l e n o wd n ap o l y m e r a s ei n t ot a qd n ap o l y m e r a s ei nt h ee l o n g a t i o ns y s t e ma n do p t i m i z e dt h e n e wo n - c h i pr e a c t i o nc o n d i t i o n s t h er e s u l t sw e r es h o w nt h a t5 0 c o fr e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n d2 5 r a mo fm g ” c o n c e n t r a t i o nw e r eo p t i m a lf o r t h eo n - c h i pe x t e n s i o n 3 i n v e s t i g a t i o no f d n a p r o t e i ns e q u e n c es p e c i f i ci n t e r a c t i o n sb yu s i n gd o u b l e - s t r a n d e dm i e r o a r r a y v l i i 东南大学博| ：学位论文 as e r i e so fd s d n ap r o b e sw i t hm u l t jo p e r a t i o ns i t e so fr e s t r i c t i o np r o t e i n si nt h em i d d l es e q u e n c ew e r e i m m o b i l i z e dt oi n v e s t i g a t ed n a - p r o t e i ns e q u e n c e - s p e c i f i ci n t e r a c t i o ni n c l u d i n gm e t h y l a t i o n w ea r r a n g e de c o ri s i t ea n dr s ais i t ea tt h es a m ed u p l e xd n ap r o b et of a b r i c a t ed s d n aa r r a y sa n dt h e nu s e dt h ed s d n aa r r a y st o s t u d yd n a r e s t r i c t i o ne n z y m er e a c t i o n s b e f o r ea n da f t e rd u p l e xd n am e t h y l a t i o nu n d e rd i f f e r e n tp r o b e c o n c e n t 瞰i o n sa n dr e a c t i o nt i m e o u rr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ed s d n am i c r o a r r a yc a nb ef u a b e tb i o c b e m i c a l l y m o d i f i e da n da c c e s s i b l ef o ri n t e r a c t i o n sb e t w e e nd n a sa n dp r o t e i n si nc o m p l e xm u l t is t e pg e n e r e g u l a t i o n p r o c e s s e s 4 e v a l u a t i n gt h eb i n d i n ga f f i n i t i e so fn f - k bp 5 0h o m o d i m e rt 0t h ew i l d t y p ea n ds i n g l e - n u c l e o t i d em u t a n t b i n d i n gs i t e sb yt h ed s d n am i c r o a r r a y w eh a v ei n v e s t i g a t e dt h eb i n d i n ga f f i n i t i e so fn f - k bp 5 0h o m o d i m e rt ot h ew i l d - t y p ea n ds i n g l e n u c l e o t i d e m u t a n ts i t e sb yt h ed s d n am i e r o a r r a yw h i c hw a sf a b r i c a t e dw i t hm e t h o dl 儿。t h ei m p o n a n c eo f e a c hn u c l e o t i d e c o n s i s t i n go fn f - r , bs i t e f o rt h es e q u e n c e - s p e c i f i cp 5 0 p 5 0 i g - r bi n t e r a c t i o nw a st h u se v a l u a t e d t h er e s u l t s d e m o n s t r a t et h a tt h en u c l e o t i d e sa td i f f e r e n tp o s i t i o n sc o n t r i b u t ed i f f e r e n t l yt ot h ep 5 0 p 5 0 l g - k b b i n d i n g i n t e r a c t i o n t h eg 1 ，g 2a n dc l oa r em o s ti m p o r t a n tf o rp 5 0 p 5 0 t g - r , bb i n d i n gi n t e r a c t i o na n dd e t e r m i n et h e s p e c i f i c i t yo f p 5 0 p 5 0 i g - w bi n t e r a c t i o n ，w h i c hr e p l a c e m e n t sw i t ha n yo t h e rn u e l e o t i d ec o u l dr e s u l ti nt h es i m i l a r l y g r e a t e s tb i n d i n ga f f i n i t yl o s e s c o m p a r a t i v e l y , t h eg 3 ，a 4 ，t sa n dc 9e t r el e s si m p o r t a n tf o rp 5 0 p 5 0 i g - r b i n t e r a c t i o na n dr e g u l a t et h eb i n d i n ga f f i n i t y ，w h i c hs u b s t i t u t i o n sw i t ht h ev a r i a n tn u c l e o t i d ec o u l dc h a n g et h e b i n d i n ga f f i n i t yd i f f e r e n t l y t h ec 5i sm o s tu n i m p o r t a n tf o rp 5 0 p 5 0 l g - r , bi n t e r a c t i o n ，t h er a n d o m i z e dn u c l e o t i d e e x c h a n g eo fw h i c he f f e c t sl i t t l eo np 5 0 p 5 0 l g - r , bb i n d i n ga f f i n i t y a m o n ga l lp o s s i b l es i n g l e - n u c l e o t i d em u t a n t s , t h et st ocm u t a t i o nc o u l ds t r e n g t hp 5 0 p 5 0 i g - r , bi n t e r a c t i o n n l et 7a c t sd i f f e r e n t l yf r o mi t ss y m m e t r i cc 5a n d t h ea x i a lt 6i s n e c e s s a r yf o rh i g h * a f f i n i t yp 5 0 p 5 0 i g - 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d n a b i n d i n ga f f i n i t y e v e nt h e5 t gm i s p a i rm a yh a v et h ea b i l i t yt oe n h a n c et h ep r o t e i n d n ai n t e r a c t i o n ( 5 t w = l0 7 ) o nt h eo t h e rh a n d t h e7 c ao r1 0 t gm i s p a i rb l o c k e dt h ep r o t e i n - d n ai n t e r a c t i o nm o r es i g n i f i c a n t l yt h a no t h e rs i x s i n g l e - n u c l e o t i d em i s p a i r s ( 7 c w = 0 3 7 ，1 0 t w = o 3 5 ) a tt h es a m et i m e ，w eh a v ec o m p a r e dt h ev a r i a t i o no f d n a n f r bb i n d i n ga f f i n i t i e su n d e rs i n g l e n u c l e o t i d em i s p a i ra n dm u t a t i o ns i t e s i tw a sf o u n dt h a tt h eb i n d i n g a f f i n i t i e sc h a n g e sw e r ed i f f e r e n ti ns o m eb a s e sb e t w e e nm i s p a i ra n dm u t a t i o n i ta l s oh a sb e e ns u g g e s t e dt h a tt h i s k i n do fu n i m o l e c u l a rd s d n am i c r o a r r a yc a nb eu s e dt oa n a l y z et h ep r o t e i n d n ai n t e r a c t i o n sn o to n l yi n s i n g l e - n u c l e o t i d em u t a t i o n sb u ta l s oi nm i s p a i r s 6 n f - k bp r o t e i nd e t e c t i o nm e t h o d sb a s e do u td s d n am i e r o a r r a y i nt h i sp a r t ，w eh a v ed e v e l o p e df o u rd i f f e r e n tm e t h o d st od e t e c tn f - r bp r o t e i nb yu s i n gd s d n am i c r o a r r a y ： ( 1 ) d e t e c t i n gn f k bp r o t e i nb yf l u o r e s c e n tl a b e l i n gt h ep r o t e i na n dh y b r i d i z a t i o nt ot h ed s d n am i c r o a r r a y ( 2 ) d e t e c t i n gn f - l ( bp r o t e i nb yf l u o r e s c e n tl a b e l i n gt h ep r o t e i n sa n t i b o d ya n dh y b r i d i z a t i o nt ot h ed s d n a m i c r o a r r a y ( 2 ) e n d o n u c l e a s e b a s e df r e e l a b e l e dm e t h o df o rd e t e c t i n gn f 一1 出p r o t e i n ( 4 ) d e t e c t i n gn f - 1 c b p r o t e i nb yu s i n gan o v e ld e s i g n e dh a l f - s i t ed s d n am i c r o a r r a y t h ef i r s tt w om e t h o d ss h o u l dl a b e lt h ep r o t e i n s i t a b s t r a c t w a sn o ts u i t a b l ef o rt h ep r o t e i nd e t e c t i o n e s p e c i a l l yf o rt h em u l t ip r o t e i n sd e t e c t i o n t h eo t h e rt w om e t h o d sd i d n o tn e e dt ol a b e lt h ep r o t e i n f r o mt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y - p r o t e i nc o n c e n t r a t i o nc u r v e ，i ts u g g e s t e dt h a tt h e t w of l e el a b e l e dm e t h o d sh a v et h ep o t e n t i a la p p l i c a t i o ni nd n ab i n d i n gp r o t e i nd e t e c t i o n b u tf o rq u a n t i t a t i v e d e t e c t i o n ，i ts h o u l db en e e d e dm o r ei m p r o v e m e n t so nd s d n am i c r o a r r a yf a b r i c a t i o na n dt h eb i n d i n gr e a c t i o n e n v i r o n m e n to f d n a - p r o t e i n 7 s t u d i e so i lt h en u c l e i ca c i dh y b r i d i z a t i o na b i l i t i e so ft h ei m m o b i l i z e dd s d n ap r o b e s w eh a v ec o m p a r e dt h en u c l e i ca c i dh y b r i d i z a t i o na b i l i t i e so ft h r e ek i n d so fi m m o b i l i z e dp r o b e sw i t h d m b r e n ts t r u c t u r e s u n d e rt h ec o n v a n t i o n a is t r u c t u r ed e s i g n w ef o u n dt h a tt h es h a r e - s t e mh a i r p i ns t r u c t u r ep r o b e ( s h p ) w a sm o l ee a s i l yh y b r i d i z e dw i t ht h et a r g e tt h a nt h el i n e a rp r o b ea n dc o n v e n t i o n a lh a i r p i ns h a p e dp r o b e ( h p ) t h eh pp r o b eh a dt h el o w e s th y b r i d i z a t i o na b i l i t y h o w e v a r ，j tw a ss h o w nac o n t r a r yr e s u l ti nt h e s i n g l e n u c l e o t i d em i s m a t c hd i s c r i m i n a t i o nr a t i o s u b s e q u e n t l y w ei n c r e a s e dt h et mo ft h et w oh a i r p i n - s h a p e d p r o b e sa n df o u n db o t ho ft h et w op r o b e sw e r ei m p r o v e do nt h eh y b r i d i z a t i o ns p e c i f i c i t i e se v e nt h o u g ht h e h y b r i d i z a t i o na b i l i t i e sw e r ed e c r e a s e d t h er e s u l to ft h eh y b r i d i z a t i o nt e m p e r a t u r eo p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n t s h o w e dt h a tu n d e rt h e4 5 ，t h ed rr a t i o ( m i s m a t c hd i s c r i m i n a t i o nr a t i o ) o fh p - 2 8 ta n ds h p 一3 2 tw e r ea l la s h i g h 8 5w h i l ea s t h er a t i o so fl i n e a rp r o b ew e r et o 3 - o 7 t h er e s u l t so ft h i sp a r ts u g g e s t e dt h a tt h e i m m o b i l i z e dh a i r p i ns h a p e dp r o b e sa l s oh a dt h ea b i l