（农产品加工及贮藏工程专业论文）干酪中五种生物胺的HPLC快速分析技术研究.pdf

蓊褰 摘要 于酪在世界各邂素有“乳钥品之王的美称，是一种营养价值事富的产晶。我国乳品工 业在经历乳粉、液态乳加工阶段后，进入干酪阶段。在干酪的成熟过程中，会形成生物胺。 高浓度的生物胺不仅影响食品风味，而且对人体有严重的危害，应引起足够熏视。因此建立 种适用予干酪孛生物胺的快速分板技术是十分必要的。 本试验从分析样品前处理、衍生、检测器入手，建立了一个简便、快捷、灵敏、高效的 液相色谱分析方法，得到了以下研究结果： l 。戳邻苯二甲醛( o p a ) 为衍生试剂，构建了一个生物胺柱前鬣生h p l c 分折条件。衍生条 件：衍生2m i n ，乙酸乙酯萃取6m i n 后h p l c 分析。色谱条件：大连依利特h y p e r s i lo d s 2 ( 4 。6m m x 2 5 0m m ，5l a m ) 色谱柱；紫外检测波长为3 3 5n m ；荧光检测激发波长( e x ) 3 3 6 n m ， 发射波长( e m ) 4 6 6h i l l ；流动相为k h z p 0 4 - q j 醇( 体积比3 0 ：7 0 ) ，流速o 8m l - m i n - 1 ，进样量 l o “l ，柱温3 5 ( 2 。 2 分别运用h p l c 荧光检测器和h p l c 二极管陈列检测器，对五种生物胺进行检测。荧光 检测在0 1 1 0m g 0 1 浓度范围内呈线性范禹，缀胺、酪胺最低检出限为0 0 1 0m g l - 1 ，色胺最 低检出限为0 0 0 5m g l - l ，腐胺、尸胺最低检出限为0 0 1 5m g l 1 。紫外检测在4 q 0m g l 1 的浓 度范围内星线性范围，组胺最低检出限为2m g 0 1 ，酪胺、尸胺最低检出限为0 8m g l _ 1 ，色胺、 腐胺最低检出限为lm g l - 1 。 3 采用三氯乙酸、无水乙醇、甲醇为提取溶剂，对干酪样品进行提取。样晶匀浆提取2 次、 正己烷潦纯处理、衍生后，进行h p l c 分析，采用外标法定量。 ( 1 ) 互氯乙酸提取：添加量为2 5m g l - 1 时，荧光测定回收率达到8 0 4 - - 1 0 7 1 ，相对 标准偏差小于7 8 。添加量为5 0m g l 1 时，荧光测定回收率达到7 8 2 - - 1 0 1 3 ，相对标 准偏差小予6 1 ；紫外测定匿牧率达刘8 0 。0 - - - , 1 1 0 。7 ，檑对标准偏差小予6 7 。添拥量 为1 0m g l 1 时，荧光测定回收率达到7 9 6 - - - - 1 0 6 6 ，相对标准偏差小于6 0 ；紫外测定 回收率达到7 5 7 1 0 3 ，1 ，相对标准偏差小于7 6 。 ( 2 ) 无水乙醇摄取：添加量力5 0m g 0 1 嚣重，荧光测定圆收率在3 7 。8 l1 8 0 0 , 6 之间，福 对标准偏差在5 1 - 2 1 2 之间；紫外测定回收率在2 3 5 - - 一1 1 5 2 之间，相对标准偏差在 1 1 1 5 2 之间。添加量为1 0m g - l 1 时，荧光测定回收率在3 9 5 - - 1 5 0 9 之间，相对标 准偏差在2 9 1 9 5 之间；紫外测定回收率在3 8 3 - - 一1 3 i 1 之闻，相对标准偏差在 1 6 1 5 7 。 ( 3 ) 秃水甲醇提取：添加量为5 0m g l - 1 时，荧光测定回收率在4 8 。2 1 2 7 7 之阂，相 对标准偏差在5 4 - 2 8 o 之间；紫外测定回收率在6 3 。2 l1 3 9 ，相对标准偏差在4 o 2 6 。4 之间。添加量为1 0m g l 1 时，荧光测定回收率在2 6 。7 1 4 8 4 之间，相对标准偏差 在7 3 - 2 7 2 之间；紫外测定回收率在3 1 。3 - - 1 6 2 1 ，檩对标准偏差在5 5 - - 2 7 9 之 间。 通过三种提取方法的比较，确认三氯乙酸提取是快速、高效的提取方法，样品前处理时 间约为3 0r a i n ，整体分析时间约为1 0 0m i n ，适崩于_ 于酪中生物胺分析。 东北农业大学工学硕士学位论文 关键词生物胺；干酪；提取溶剂；柱前衍生；高效液相色谱法 h a b s t r a c t s t u d y o n a n a l y s i so f f i v eb i o g e n i ca m i n e s i nc h e e s e b y a r a p i dh p l ct e c h n i q u e a b s t r a c t c h e e s ew a sk n o w na s “k i n go ft h ed a i l yp r o d u c t s ”i nt h ew o r l d ，i tw a so n eo fh i g hn u t r i t i o n a l v a l u ep r o d u c t s d a i r yi n d u s t r yo fo u rc o u n t r yh a de x p e r i e n c e dt h em i l kp o w d e ra n dl i q u i dm i l k s t a g e ，a n dt h e ne n t e r e dt h ec h e e s es t a g e b i o g e n i ca m i n e sw o u l db ef o r m e dd u r i n gt h em a t u r a t i o n p r o c e s so fc h e e s e b i o g e n i ca m i n e so fh i g hc o n c e n t r a t i o nw o u l dn o to n l ya f f e c tf o o df l a v o r , b u t a l s ow o u l dd oh a r mt oh u m a nh e a l t h ，t h e r e f o r e ，i tw a sn e c e s s a r yt oe s t a b l i s har a p i da n a l y s i s m e t h o do f b i o g e n i ca m i n e si nc h e e s e i nt h i ss t u d y , as i m p l e ，r a p i d ，s e n s i t i v ea n dh i 【g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d w a se s t a b l i s h e df r o mp r e t r e a t m e n to fs a m p l e ，d e r i v a t i z a t i o na n dd e t e c t o r t h er e s u l t so ft h i ss t u d y w e l ea sf o l l o w s ： 1 o - p h t h a l d i a l d e h y d e ( o p a ) w a su s e da sd e r i v a t i z a t i o na g e n t ，a n dc o n d i t i o n so f p r e - c o l u n m d e r i v a t i z a t i o no fb i o g e n i ca m i n ef o rh p l cm e t h o dw e r ed e t e r m i n e d a 1 ls a m p l e sw e r ea n a l y s i s e d b yi - i p l ca f t e rd e r i v a t i z e df o rt w om i n u t e sa n de x t r a c t e db ye t h y la c e t a t e f o r s i xm i n u t e s c o n d i t i o n sf o rc h r o m a t o g r a p h yw e r ea sf o l l o w ：h y p e r s i lo d s 2c o l u m n ( 4 6m i n x 2 5 0 加m ，5 “m ) w a su s e d w a v e l e n g t ho fd i o d ea r r a yd e t e c t o rw a s3 3 5n m ；u n d e rf l u o r e s c e n c ed e t e c t o rw i t he x 3 3 6n ma n de m4 6 6n l n m o b i l ep h a s e ：0 0 2m k h 2 p 0 4 - m e t h a n o l ( 3 0 ：7 0 ，v v ) ；f l o w i n gr a t e ：0 8 m l m i n 以；i n j e c t i o nv o l u m e ：1 0 皿；c o l u m nt e m p e r a t u r ek e p ta t3 5 c 2 f i v eb i o g e n i ca m i n e sw e r ed e t e c t e db yh p l ci n s t r u m e n t 谢mad i o d ea r r a yd e t e c t o rs y s t e m o raf l u o r e s c e n c ed e t e c t o rs y s t e m f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nw a sl i n e a ri n t h er a n g eo fc o n c e n t r a t i o n f r o mo 1m g l 1t o10m g l - 1 ；t h ed e t e c t i o nl i m i tf o rh i s t a m i n ea n dt y r a m i n ew a s0 010m g l - 1 ，f o r t r y p t a m i n ew a s0 0 0 5m g l - 1 ，a n dt h a tf o rp u t r e s c i n ea n dc a d a v e r i n ew a s0 0 1 5m g 。l - 1 u l t r a v i o l e t d e t e c t i o nw a sl i n e a ri nt h er a n g eo fc o n c e n t r a t i o nf r o m4m g l - 1a n d4 0m g l 1 t h ed e t e c t i o nl i m i t f o rh i s t a m i n ew a s2m g - l - 1 ，f o rt y r a m i n ea n dc a d a v e r i n ew a s0 8m g l - 1 ，a n dt h a tf o rt r y p t a m i n e a n dp u t r e s c i n ew a s1m g l - 1 3 t h ec h e e s es a m p l e sw e r ee x t r a c t e db yt r i c h l o r o a c e t i ca c i d 、e t h a n o la n dm e t h a n o lr e s p e c t i v e l y t h ec h e e s es a m p l e sw e r eh o m o g e n a t ee x t r a c t i o nt w i c e ，p u r i f i e dw i t hn - h e x a n ea n dd e f i v a t i z e db y o p a a f t e r w a r d s ，t h es a m p l e sw e r eq u a n t i t a t i v e l ya n a l y z e db yh p l cw i t he x t e r n a ls t a n d a r d m e t h o d ( 1 ) e x t r a c t i o n 谢t 1 1t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ( t c a ) ：w h e na d d e dc o n c e n t r a t i o nw a s2 5m g l - 1 ， r e c o v e r yr a n g e df r o m8 0 4 t o1 0 7 1 a n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) w e r el e s st h a n7 8 ， d e t e c t e db yf ld e t e c t o r w h e na d d e dc o n c e n t r a t i o nw a s5 0m g l 1 ，r e c o v e r yr a n g e df r o m7 8 2 t o 101 3 a n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) w e r e1 e s st h a n6 1 ，d e t e c t e db yf ld e t e c t o r ； i h 东北农业大学t 学硕士学位论文 r e c o v e r yr a n g e df r o m8 0 0 t o1 1 0 7 a n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) l e s st h a n6 7 ， d e t e c t e db yu l t r a v i o l e td e t e c t o r w h e na d d e dc o n c e n t r a t i o nw a s l 0m g l ，r e c o v e r yr a n g e df r o m 7 9 6 t o1 0 6 6 a n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) w e r e1 e s st h a n6 0 ，d e t e c t e db yf l d e t e c t o r ；r e c o v e r yr a n g e df r o m7 5 7 t o1 0 3 1 a n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) l e s st h a n 7 6 d e t e c t e db yu l t r a v i o l e td e t e c t o r ( 2 ) e x t r a c t i o nw i t he t h a n o l ：w h e na d d e dc o n c e n t r a t i o nw a s5 0m g l - 1 ，r e c o v e r yr a n g e df r o m 3 7 8 t 01 1 8 o w i t hr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) b e t w e e n5 1 a n d2 1 2 ，d e t e c t e db y f ld e t e c t o r ；r e c o v e r y r a n g e df r o m2 3 5 t o 115 2 w i t hr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) b e t w e e n1 1 a n d15 2 d e t e c t e db yu l t r a v i o l e td e t e c t o r w h e na d d e dc o n c e n t r a t i o nw a s 1 0 0m g l - 1 r e c o v e r yr a n g e df r o m3 9 5 t o1 5 0 9 w i t hr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) b e t w e e n2 9 a n d1 9 5 d e t e c t e db yf ld e t e c t o r ；r e c o v e r yr a n g e df r o m3 8 3 t o1 3 1 1 w i t l i r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) b e t w e e n1 6 a n d15 7 ，d e t e c t e db yu l t r a v i o l e td e t e c t o r ( 3 ) e x t r a c t i o nw i t hm e t h a n o l ：w h e na d d e dc o n c e n t r a t i o nw a s5 0m g 0 1 。r e c o v e r yr a n g e df r o m 4 8 2 t o12 7 7 w i t hr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) b e t w e e n5 4 a n d2 8 0 ，d e t e c t e db y f ld e t e c t o r ；r e c o v e r y r a n g e df r o m6 3 2 t o l l3 9 w i t hr e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n ( r s d ) b e t w e e n4 0 a n d2 6 4 d e t e c t e db yu l t r a v i o l e td e t e c t o r 珊l e na d d e dc o n c e n t r a t i o nw a s 1 0 0m g l 1 r e c o v e r yr a n g e df r o m2 6 7 t o1 4 8 4 w i t hr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) b e t w e e n7 3 a n d2 7 2 ，d e t e c t e db yf ld e t e c t o r ；r e c o v e r yr a n g e df r o m31 3 t o16 2 1 w i t h r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) b e t w e e n5 5 a n d2 7 9 ，d e t e c t e db yu l t r a v i o l e td e t e c t o r t r i c h l o r o a c e t i ca c i de x t r a c t i o nw a sar a p i da n de f f e c t i v ee x t r a c t i o nm e t h o dc o m p a r e dw i t h t h eo t h e rt w oe x t r a c t i o nm e t h o d s t h ep r e t r e a t m e n tt i m ew a s3 0m i n u t e sa n dt h et o t a la n a l y s i st i m e w a s1 0 0m i n u t e s t h et c ae x t r a c t i o nm e t h o dw a sf i tf o rd e t e c t i o no fb i o g e n i ca m i n e si nc h e e s e k e yw o r d sb i o g e n i ca m i n e s ；c h e e s e ；e x t r a c t i o ns o l v e n t ；p r e - c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n ；h i g h p e r f o r m a n c ef i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i v c a n d i d a t e ：s u nn i n g s p e c i a l i t y ：a g r i c u l t u r a lp r o d u c t sp r o c e s s i n g a n ds t o r i n ge n g i n e e r i n g s u p e r v i s o r ：p r o f z h a ox i n h u a i 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼! 翅遗直墓他盂要挂别座盟的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：孑小刍 日期：泐亨年6 月e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名：z j 、宁 e t g q ：枷9 年多月日 导师签 名：& 乏，夕乏 日期：国眸月l ，日 引言 1 引言 食品的安全性是广大消费者关心的重要问题，在全球范围内由于干酪、鱼类等食品的卫 生情况不好而导致的生物胺中毒事件时有发生。故此，生物胺问题也是食品安全问题之一。 随着社会经济的高速发展，不同国家对食品中的生物胺问题也越来越重视，对其在食品中的 存在水平进行严格的监测与控制，并做了限量要求。 生物胺通常在食品腐烂或发酵过程中产生。典型的食品包括鱼类、肉类、发酵食品( 例 如干酪) 、大豆食品和一些蔬菜等( j a n s e nsc 等2 0 0 3 ) 。可分为单胺和多胺两类，适量的生物 胺对人体有益。但是，高浓度的生物胺不仅会严重影响食品风味甚至改变其成分，而且对人 体有着严重的毒害作用，可造成人神经系统和心血管系统损伤。因此，研究和认识食品中生 物胺的含量有助于提高和改善食品的质量和安全性，生物胺的检测不仅能防止其对人体的危 害，还能以此作为判断食品腐败程度的指标。在我国乳品工业迅速发展的今天，干酪食品营 养价值丰富，随着再制干酪的不断研制和大量推出，在不久的将来必将超越鲜奶、奶粉等成 为乳制品的主要产品。生物胺是在干酪成熟和贮存过程中，由于微生物产生的酶对游离氨基 酸的脱羧作用而形成的，利用优质原料乳、良好的卫生环境、适当的发酵剂以及合理的热处 理和保藏，是解决生物胺潜在不安全因素的关键；此外，为了保证我国干酪工业的健康发展， 开发一套完善的发酵干酪中生物胺的快速分析方法，例如利用先进的h p l c 仪器分析技术和 样品前处理提取技术，是保证这些工作的基础，同时也能够为我国相关食品标准的建立提供 必要的手段和基础数据。 1 1 生物胺概述 生物胺( b i o g e n i ca m i n e s ) 是具有生物活性的低分子有机胺类化合物的总称，它们是一 类含氮的脂肪族或杂环类低分子化合物，分为单胺和多胺两类，包括酪胺、组胺、腐胺、尸 胺、苯乙胺、色胺、精胺和亚精胺等多种物质。它是动物、植物和多数微生物体内的正常生 理成分，在机体细胞中具有重要的生理功能，单胺类化合物对血管和肌肉有明显的舒张或收 缩作用，对精神活动和大脑皮层有重要的调节作用；在生物体的生长过程中，多胺化合物能 促进d n a 、r n a 和蛋白质的合成，加速生物的生长发育。但是，当人体吸收过量的生物胺 时，会对人体有着严重的毒害作用，可能会引起头痛、呼吸紊乱、心悸、血压变化等过敏性 反应；严重的还会危及生命。在生物胺中，组胺的生理毒性最强，其次是酪胺。生物胺通常 是在食品腐烂或发酵过程中产生，由于微生物的作用，一些食品中的氨基酸通过氧化脱羧作 用而形成了生物胺类化合物。生物胺中影响较大的有组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺等，它 们分别来自组氨酸、酪氨酸、鸟氨酸( 通过精氨酸) 、赖氨酸、色氨酸，此外，还有些其它 不常见的生物胺，例如由精氨酸生成的精胺、由羟色氨酸形成的血清素( 孙宁，2 0 0 7 ) 。 食品中生物胺的形成，须具备三个条件( s i l l as a n t o smh ，1 9 9 6 ) ： ( 1 ) 有一定的游离氨基酸存在，但是这不一定能够生成生物胺。 ( 2 ) 有具有脱羧酶活性的微生物存在。 ( 3 ) 食品所处的条件适合上述微生物的繁殖以及脱羧酶的产生。 东北农业大学t 学硕j 二学位论文 d y 洲一叱 苯丙氨酸肛苯乙胺 弋幽扩 已文。攀酬九 o o h m i 赖氨酸 尸胺 c s hz c 。幽泖 色氨酸 削y h n 八1 1 n 2 h 幽 i u n h 2 n 丫n 州必 n h 精氨酸 图1 1 不同氨基酸脱羧反应生成的生物胺 p i g 1 1b i o g e n i ca m i n e sf r o md e c a r b o x y l i cr e a c t i o no fd i f f e n e r ta m i n oa c i d s 1 2 生物胺来源及产生生物胺的食品 1 2 1 生物胺的来源 各种动植物的组织中都含有少量的生物胺，生物胺是生物有机体内的正常活性成分，在 机体内起着重要的生理作用。此外，也普遍存在于多种食品和含酒精的发酵饮料中。如：干 酪、肉制品、水产品、啤酒、葡萄酒等。人们从食品中摄入的一定数量的高质量的外源生物 胺，具有一定的生理和毒理活性。研究表明，生物胺在生物体内最主要的生物合成途径是氨 基酸的脱羧反应，也有部分生物胺是通过醛的胺化作用形成的。般来说，食品中的生物胺 大多是在食品中的微生物所产生的氨基酸脱羧酶的作用下，脱去氨基酸的羧基而生成的。 1 2 2 产生生物胺的食品 1 2 2 1 肉类及其制品 无论是在新鲜的还是经过加工的肉类产品中都可以检测出多种生物胺类物质。前人在牛 和羊的肌肉中发现了组胺及其合成因子。肉制品中的亚精胺和精胺含量比较接近；酪胺、腐 胺、精胺和亚精胺含量较之组胺和尸胺要高；精胺的浓度比其它大多数被测试食品都要高。 与其它肉比较，牛肉含有较高的生物胺，且其浓度是易变的，尤其是腐胺和尸胺；烤鸡肉的 亚精胺含量高；在香肠的制作中，发酵对组胺的形成有重要作用。肉及其制品中的微生物与 生物胺关系密切。 1 2 2 2 水产品及其制品 鲭鱼、鲱鱼、沙丁鱼、金枪鱼等海洋鱼类体内含有多种低含量生物胺，如组胺、腐胺、 尸胺、酪胺、鲱精胺、精胺和亚精胺等，而发酵水产制品中生物胺的含量增加更高。研究表 明，这些胺的出现与水产品的腐败有关( m i e t zjl 等1 9 7 7 1e l i a s s e nk a 等2 0 0 2 ) 。因为胺是 由腐败微生物产生的，这些微生物在水产品的货架期要结束时含量最高，它们的浓度更可能 标志着水产品的腐败程度( j u d i t el a p a g u i m a r i e s 等2 0 0 4 ) 。腐烂的鱼、贝等，可以产生大量 的胺类，包括二甲胺、三甲胺、腐胺、脂肪族聚胺、精胺等。 2 引言 1 2 2 3 孚l 及孚l 韦0 品 在鼠类和人的乳汁中都含有精胺、亚精胺和腐胺，其含量因个体不同而不同( s i l l as a n t o s mh ，1 9 9 6 ) 。研究发现人的左、右乳所产生的乳汁中精胺和亚精胺含量有着显著的不同。 纯乳中的生物胺含量很低，但各种乳制品中却很高，全脂和半脱脂牛乳中含量相对较少。已 有大量报道称干酪中组胺量仅次于其在鱼类中的含量，位居第二。干酪中的主要生物胺有： 酪胺、组胺、腐胺、尸胺、色胺，这是由于在干酪的制作过程中酪蛋白催化降解，生成大量 游离氨基酸，这些氨基酸在脱羧酶作用下脱羧生成二氧化碳和胺。因此，延长制作时间会增 加干酪中生物胺的含量。 1 2 2 4 饮料 新鲜橙汁中腐胺含量高，仅比其水果略低，而贮藏中的橙汁生物胺含量要低，约为3 0 ( 李白强，2 0 0 7 ) 。葡萄酒中的生物胺是由乳酸菌在发酵过程中对氨基酸脱羧而产生的，依 据质量和工艺不同，含量在1 5 0m g l - 1 之间。啤酒中生物胺与原料质量、酿造工艺以及酿 造和贮藏过程中受微生物污染的程度密切相关( h a l a s ea 等1 9 9 9 ) 。啤酒中的生物胺可分为 3 类：第1 类来自原料中的，如鲱精胺、腐胺、精胺、亚精胺等，它们通常存在于麦芽中， 酪胺、2 苯乙胺和多元胺存在于酒花中；第2 类产生于糖化过程，如酪胺、鲱精胺和尸胺等， 它们的存在有助于麦芽中自然酶的产生和相应氨基酸的分解；第3 类是在发酵过程中产生的， 如酪胺和色胺等。 1 2 2 5 水果和蔬菜 生物胺是植物自然产生的物质，通常存在于食品中，特别是在水果和蔬菜中。生物胺在 水果中的具体情况难以准确分析，所获得的研究数据显示，即使是同种水果的不同个体间所 含的生物胺的种类和含量也是变化不定的；在一些常见水果汁中的胺类物质以腐胺为主。与 肉和鱼相似，生的与烹饪过的蔬菜之间生物胺量的变化很小，蔬菜几乎不含有尸胺，尸胺是 微生物感染的标志性产物。胡萝b 中生物胺的含量很低，花椰菜中亚精胺的含量比鱼和肉都 要高( 冯雅蓉，2 0 0 5 ) 。 1 3 生物胺与食品安全 对人类来讲，食品中的生物胺一般是有不良作用的。生物胺不仅是生成荷尔蒙、核酸、 蛋白质等物质的前体，也是生成致癌物质和亚硝基类物质的前体。食品中存在过高的生物胺 类化合物，可以产生两方面的危害性： ( 1 ) 在亚硝酸盐的存在下，生物胺类化合物可以与亚硝酸盐形成亚硝胺化合物，而亚硝 胺类化合物是已知的强致癌化合物，可以导致多种肿瘤的发生，即间接致癌作用。 ( 2 ) 生物胺本身直接引起的食品安全问题，即生物胺的毒性。一些生物胺具有生理作用， 人体摄入过量的生物胺会引起不良的生理反应( 见龆1 ) ，例如，组胺等能调节神经系统活动， p 一苯乙胺和酪胺有升压作用，组胺则有降压作用。总体上看，组胺对人类的健康的影响最大 ( b o d m e rs 等1 9 9 9 ) ，并且尸胺和腐胺等二胺的存在能够加强组胺的毒性作用( b a r d o c zs ， 1 9 9 5 ) ；其次是酪胺。例如，在1 3n 8 - 4 0m g 组胺时产生轻微中毒症状，超过4 0m g 时产生中 等中毒症状，超过1 0 0m g 时产生严重中毒症状；口服酪胺超过1 0 0m g 时会引起偏头痛，超过 1 0 8 0m g 时会引起中毒性肿胀( p a r e n t ee 等2 0 0 1 ) 。总体上看，当食品中生物胺含量达到1 0 0 0 3 东北农、i p 人学t 学硕_ 学位论文 m g l - 1 时，人体会吸收过量的生物胺，可能会引起头痛、呼吸紊乱、心悸、血压变化等过敏 性反应。 表1 1 一些生物胺的生理作用 t a b 1 1p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no fs o m eb i o g e n i ca m i n e s 生物胺种类生理作用 组胺精神萎顿、精神分裂症、过敏、皮肤潮红、呕吐、腹泻、癌症 ( h e l l s t r a n dk ，2 0 0 2 ) 酪胺 偏头痛、高血压、精神分裂症、早老性痴呆症、帕金森症、精神萎顿 ( s i l l as a n t o smh ，1 9 9 6 ：p r e m o n trt ，2 0 0 1 ) 腐胺和尸胺 引起低血压，破伤风，四肢痉挛( s h a l a b yar ，1 9 9 6 ) b 。苯乙胺 消除神经系统中的去甲肾上腺素，增加血压，引起偏头疼 ( s h a l a b y a r ，1 9 9 6 ) 色胺 升高血压，精神萎顿、精神分裂症、肝毒性 ( o n a la ，2 0 0 7 ：p r e m o n trt ，2 0 0 1 ) 在对生物胺类化合物的长期研究中，美国f d a 通过对爆发组胺中毒的大量数据的研究， 确定组胺的危害作用水平为5 0 0m g l - 1 食品；欧美及我国也对部分食品中组胺含量做了限量要 求：美国f d a 要求进口水产品纽胺不得超过5 0m g l - 1 ，欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超 过1 0 0m g l 1 ，其它食品中组胺不得超过1 0 0m g l 1 ，酪胺不得超过1 0 0 8 0 0m g l _ 1 ，我国规定 鲐鱼中组胺不得超过1 0 0 0m g l - 1 ：其他海水鱼不得超过3 0 0m g l 1 ( 李志军，2 0 0 4 ) 。 哺乳动物消化道内具有一定的解毒功能，可以分解饮食中所摄入的微量生物胺，从而降 低它们的毒性。在酶的作用下，单胺或多胺的氨基被氧化，从而达到解毒目的。即便如此， 鉴于食品中生物胺多是由微生物引起的，所以控制原材料中的微生物的生长，以及防止生物 胺的过量生成，对食品安全性仍然是至关重要。 1 4 干酪中的生物胺 干酪是重要的发酵乳制品，由于需要进行发酵加工，所以存在生成生物胺的可能。一些 细菌，有可能还有其它的微生物，可以将氨基酸作为一种前体进行脱羧代谢，从而生成了生 物胺，因此，延长制作时间会增加干酪中生物胺的含量( 张国农，2 0 0 5 ) 。已经发现干酪中组 胺的存在量仅次于鱼类，主要有酪胺、组胺、腐胺、尸胺、色胺等，例如在意大利干酪中检 出组胺和酪胺为3 9 0m g k g - - 4 0 0m g k g ；尸胺为2 5 8m g k g 以1 6 7 5m g k g 一：腐胺为5 4 9 8 m g k g 以1 1 0 4 6m g k g 一。下面是一些干酪中存在的主要生物胺种类和生物胺总的含量水平 ( i n n o c e n t ，2 0 0 2 ) 。 1 4 1 影响干酪中生物胺形成的因素 干酪等乳制品中生物胺产生以及含量水平取决于各种因素，包括：微生物、底物、环境 因素、干酪类型、贮藏时间等。 4 引言 表1 2 各种干酪中主要的生物胺 t a b 1 - 2p r i m a 呵b i o g e n i ca m i n e si nc h e e s e s 表1 3 各种干酪中生物胺的总量 勾达干酪 莫泽雷勒干酪 巴尔马干酪 碎巴尔马干酪 波萝伏洛干酪 8 2 7 3 0 4 4 9 1 2 7 6 1 0 1 7 希腊白软干酪( 成熟1 2 0 d ) 乌尔法干酪 太尔西特干酪 普拉托干酪 戈贡佐拉干酪 6 1 7 6 5 1 9 6 5 3 3 4 4 1 3 2 1 4 1 1 微生物 影响干酪中生物胺形成以及含量水平的最重要因素是具有氨基酸脱羧酶活性的微生物。 通常，干酪生产时所用的发酵剂是没有脱羧酶活性的，但是在乳品工业生产上所使用的一些 工业微生物，例如乳酸链球菌和瑞士乳杆菌，具有将组胺酸转化为组胺的能力( s t r a t t o nss ， 1 9 9 1 ) 。在手工生产的干酪中，肠球菌是天然菌群的重要组成部分，甚至有时是优势菌群，被 认为具有很强的脱羧酶能力( f r e i m sac 等1 9 9 6 ) ；也有人认为粪肠球菌会产生组胺。虽然巴 氏杀菌能够杀死大肠杆菌，而耐热性较强的肠球菌可能存活下来，从而在干酪的生产中产生 相应的生物胺。 并非所有的微生物种类都具有氨基酸脱羧酶活性，但具有此种生理作用的细菌却不占少 数，如杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、埃希氏菌属、变形菌属、假单胞菌属、链球菌属等。 总结来看，具有脱羧酶活性的微生物如乳酸杆菌、肠球菌、微球菌等，是引起干酪中生成生 物胺的最重要因素。 1 4 1 2 游离氨基酸 像任何化学反应一样，底物对反应物的生成是至关重要的。氨基酸对生物胺的生成是最 重要的因素之一。干酪成熟过程中，随着成熟度的增加，更多的酪蛋白水解，游离氨基酸、 肽分子的含量增加，这些物质均可以作为微生物所产生的脱羧酶的催化反应底物，从而生成 5 东北农业大学下学硕上学位论文 生物胺( t a n p s t 等1 9 9 3 ) 。数据表明，随着干酪成熟时间的增加，游离氨基酸含量增加，生 物胺的含量也增加，呈现出明显的相关性。 表l _ 4 在干酪成熟期间氨基酸含量与生物胺含量间的关系( m g k g d ) t a b 1 - 4r e l a t i o n s h i po fa m i n oa c i dc o n t e n ta n d b i o g e n i ca m i n ec o n t e n ti nm a t u r a t i o np e r i o d o f c h e e s e 注：六次分析结果，- r p 0 0 0 l ，p 0 0 1 1 4 1 3 温度 一些研究表明，干酪的贮藏温度会影响生物胺产生的速度，但是不会影响一些生物胺的 最大生成量。也有研究表明，生物胺的生成量取决于温度，并且随着温度的升高和贮藏时间 的延长，生物胺的生成量增加。温度对生物胺生成的影响，应该综合考虑温度对蛋白酶、脱 羧酶活性的影响，以及温度对微生物繁殖速度的影响，它们均与生物胺的产生有密切的关系。 例如对阿哲泰欧( a z e i t a o ) 干酪的研究就发现( p i n h oo 等2 0 0 1 ) ，在4 放置2 周后，游离 氨基酸和生物胺的含量水平无明显的变化，如果是放置在室温下( 2 5 ) ，游离氨基酸和生 物胺含量却显著增加。 1 4 1 4 其它因素 脱羧酶的活性与p h 有关系。早在2 0 世纪的2 0 年代( k o e s s l e rkk 等1 9 2 8 ) ，就对生物 胺产生的生物学机制进行了探讨，认为生物胺的产生是为了抵抗酸性环境而形成的生理机能。 微生物产生的氨基酸脱羧酶的适宜p h ，一般是在4 o 5 5 ( t e o d o r o v i cv ，1 9 9 4 ) ，而千酪的 p h 为5 0 - 6 5 ，适合于脱羧酶的活性。 此外，盐分的含量也影响干酪中生物胺的生成。在n a c l 含量降低时，生物胺的生成量 增加，当n a c i 含量为5 时，生物胺的生成量达到最低，如果同时降低p h ，则会使生物胺 的生成量更低( s u m n e rss 等1 9 9 0 ；c h a n d e rh 等1 9 8 9 ) 。在德氏乳杆菌保加利亚亚种的培 养基中，当n a c i 含量为6 时，生物胺的生成速度显著下降，这可能是由于高浓度的n a c l 抑制了脱羧酶的活性而导致的。 1 4 2 干酪中生物胺的控制技术 已有研究表明，并非所有的干酪样品中均存在生物胺，同一类型的干酪的不同样品，其 生物胺含量也不相同，所以有理由相信生物胺的生成是可以避免的。一般来讲，加工中良好 6 引言 的卫生环境( 包括有效的杀菌处理) 、使用微生物污染程度低的原料乳、无脱羧酶产生发酵剂 等，均可以作为控制干酪中生物胺产生的预防性措施。其中，对原料乳的巴氏杀菌处理，可 以有效的减少组胺、酪胺的生成( 如表1 5 所示) ，当然也会影响到生物胺的总量水平，所以 是一个非常有效的手段( s c h n e l l e rr 等1 9 9 7 ) 。 表1 5 杀菌处理对半软干酪中生物胺形成的影响 ! 坐：! ：i ! 垒呈曼垡! 生2 11 1 1 巫! i 圣璺垒2 璺2 呈! i o 三巴璺堕2 呈2 11 i 2 9 呈尘呈呈翌垫呈! 垫! 皇翌i ：1 2 垒里垒宝宝! 宝 菌乳半( n - 1 0 ) 9 4 5 5 1 4 63 41 3 l 93 4 5 - 9 软干酪范围 1 - - 3 27 - - 一2 7 45 - - 3 2 70 - 2 26 - - 3 9 76 2 - - , 1 0 3 0 平均 鲜乳半( n _ 9 ) 2 4 65 2 l8 7