（环境科学专业论文）不同碳源和光照周期对三种微藻生长及油脂积累的影响.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t t h eb i o d i e s e li sak i n do fr e n e w a b l ee n e r g ys o u r c ew h i c hh a v es o m ea d v a n t a g e s s u c ha sc l e a n ，e n v i r o n m e n t a lf r i e n d l y i ns om a n yp r o m i s i n gr a wm a t e r i a lf o rt h e p r o d u c t i o no fb i o d i e s e l ，m i c r o a l g a eh a sm a n ys u p e r i o r i t i e sl i k e ：w i d ev a r i e t y ，h i g h p h o t o s y n t h e s i se f f i c i e n c ya n ds t r o n ga b i l i t yo ff a t t ya c i ds y n t h e s i sa n ds oo n ，w h i c h m a k et h er e s e a r c ho fm i c r o a l g a ep r o d u c i n gl i p i da st h eh o tp o i n t t h i sp a p e rt a k e t h r e ek i n d so fm i c r o a l g a e ：s c e n e d e s m u so b l i q u u s ，e u g l e n ag r a c i l i s ，p h a e o d a c t y l u m t r i c o r n u t u ma st h er e s e a r c ho b j e c t w en o to n l ys t u d i e dt h ee f f e c t so ff o u rc a r b o n s o u r c e s ，i e g l u c o s e ，n a h c 0 3 ，s o d i u ma c e t a t ea n dg l y c e r i nb u ta l s os t u d i e dt h e e f f e c t so ft h e i rr e s p e c t i v ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o n so nt h eg r o w t ha n dl i p i da c c u m u l a t i o n t h eo t h e rh a n d ，w es t u d i e dt h ee f f e c t so fp h o t o p e r i o do nt h eg r o w t ha n dl i p i d a c c u m u l a t i o no fs c e n e d e s m u so b l i q u u s t h em a i nc o n c l u s i o na sf o l l o w i n g ： ( 1 ) i nt h ef o u rc a r b o ns o u r c e s ，g l u c o s ei st h eb e s tc a r b o ns o u r c ei np r o m o t i n g t h eg r o w t ho fs c e n e d e s m u so b l i q u u sa n de u g l e n ag r a c i l i s ，b u tg l y c e r i ni st h eb e s t c a r b o ns o u r c ei np r o m o t i n gt h eg r o w t ho fp h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ( 2 ) i nt h et h r e ek i n d so fm i c r o a l g a e ，s c e n e d e s m u so b l i q u u si st h em o s ti d e a l m i c r o a l g a ei np r o d u c i n gl i p i d ( 3 ) t h eb i o m a s so fs c e n e d e s m u so b l i q u u s e u g l e n ag r a c i l i sa n dp h a e o d a c t y 1 u mt r i c o r n u t u mi sn o ti nl i n ew i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fc a r b o ns o u r c e ，a n dt h e r ei s l i t t l ed i f f e r e n c ei ne a c hc o n c e n t r a t i o no fc a r b o ns o u r c e ( 4 ) t h ee x t e n s i o no fl i g h t i n gt i m ei ss h o r t e nt h eg r o w t hc y c l e i n c r e a s e dt h e b i o m a s sa n d l i p i dp r o d u c t i o ni ng r e a td e g r e e ( 5 ) i nt h ed i f f e r e n tc u l t u r ec o n d i t i o n s s c e n e d e s m u so b l i q u u sc a nr e a c ht h e b i g g e s tb i o m a s so f4 0 5 2 9 la n dt h eb i g g e s tl i p i dp r o d u c t i o no f1 6 0 2 9 li nt h eb e s t c o n d i t i o nw h i c hi s4 0 9 lo fg l u c o s ea n dt h ea l ld a y l i g h t k e yw o r d s ：s c e n e d e s m u so b l i q u u s ；e u g l e n ag r a c i l i s ；p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ； c a r b o ns o u r c e , p h o t o p e r i o d ；b i o m a s s ；l i p i dp r o d u c t i o n i l 第1 章绪论 第1 章绪论 微藻是一类以光合自养促进自身生长的低等植物，是自然界起源最早、分 布最广、种类和数量最大的生物资源。许多微藻在一定条件下能够将大量三酰 甘油储存在细胞中，其含量最高可达到细胞干重的5 0 以上i l 也j 。微藻的生长周 期短，不占用耕地，单位面积油脂产量高，是高等陆生油料作物的数十倍p j 。因 此，从微藻油脂的品质和产量上考虑，微藻是解决全球能源短缺的理想原料。 我国人口多，人均耕地面积少，微藻的这种优势非常适合在我国发展，待其技 术成熟后，可大规模培养生产生物柴油以取代传统能源。 自然界中的藻类种类繁多，微藻资源尤为丰富。筛选生长速度快、生长周 期短、生物量和油脂含量高、易于培养的优良能源微藻，是实现能源微藻规模 化培养的前提和保斟4 1 。本论文主要对斜生栅藻、纤细裸藻、三角褐指藻三种微 藻进行生物量和油脂积累的比较，以及对生长量和油脂积累的影响因素进行分 析，筛选出性能优越的产油能源微藻，为后续油脂生产条件优化及产油代谢机 理方面提供指导作用。 1 1 微藻概述 微藻( m i c r o a l g a e ) 是一类形体微小的藻类的总称，包括众多真核和原核种 类，可表现为单细胞或者多细胞，广泛分布于淡水和海水中，总数约2 0 万余种， 占全球已知藻类的7 0 左右【5 。微藻能利用阳光、水、c 0 2 等合成自身所需要的 物质。许多微藻含油量极高，在适宜的培养条件下，一些微藻的含油率甚至高 达干藻体质量的5 0 7 0 1 2 j ，且微藻油脂中的脂肪酸适合制备生物柴油【6 j 。据 保守估计，每公顷微藻每年可生产3 0 0 0 0 5 0 0 0 0 升油脂，而如棕榈和麻风树等 的富油植物每年每公顷仅能生产1 3 0 0 2 4 0 0 升油脂1 7j 。微藻对环境的适应能力极 强，几乎能适应地球上的各种生长环境，无论是室内、室外、海水、淡水还是 一些荒芜的滩涂地、盐碱地、废弃的沼泽、池塘等都可以种植微藻瞵j 。微藻通常 没有复杂的生殖器官，繁殖方式简单，生长周期短，繁殖能力强，易于大规模 培养【9 1 。此外，微藻还具有光合作用效率高、生物产量高等特点l l o 】。 目前微藻分为1 1 个门，绿藻门、红藻门、黄藻门、蓝藻门、金藻门、硅藻 第1 章绪论 门、甲藻门、隐藻门、裸藻门、褐藻门和轮藻门，其中绿藻门、硅藻门、金藻 门、隐藻门和甲藻门中的藻类都含有大量的微藻油j2 1 。而且从微藻中提取得 到的油脂成分类似于植物油( 三酰甘油) ，它不仅可以代替石油作为生物柴油 直接应用于工业上，还可以作为植物油的替代品l l3 1 。目前国内外对微藻中所含 的脂肪酸进行了大量研究，但报道较多的是小球藻( c h l o r e l l av u g a n i s ) 、红球 藻( h a e ma t o c o c c u s ) 、杜氏盐藻( d u n a l i e l l a p r i m o l e c t a ) 等。这些微藻以阳光、 水、二氧化碳和简单的无机元素为原料进行光合作用，所产生的油脂通过酯化 反应后可转变为生物柴油( 脂肪酸甲酯等) ，提取油脂后的藻渣还可以用来生产动 物饲料、有机肥料和甲烷【l 训。美国国家可再生能源实验室( n i 也l ) 的报告指出， 利用微藻生产油脂可能是生物柴油产业的重要研究方向i l 引。 1 1 1 藻种简介 1 1 1 1 斜生栅藻简介 斜生栅藻( s c e n e d e s m u so b l i q u u s ) 又称栅列藻，隶属于绿藻门，绿球藻目， 真集结亚目，栅藻科，栅藻属。斜生栅藻一般是4 个细胞的定型群体，也有8 个或1 6 个细胞的群体，极少为单细胞。细胞形状通常是椭圆形或纺锤形，以长 轴排成l 2 列或多列，细胞壁薄而且光滑，或有各种突起，如颗粒、细齿、隆 起线和刺等。4 个细胞的群体宽1 2 3 4 岬，细胞长1 0 2 1 p , m ，宽3 9 岬，每个 细胞内有1 个周生色素体和1 个蛋白核i l6 | 。斜生栅藻的光合作用色素主要为叶 绿素a 、叶绿素b 、叶黄素和类胡萝卜素，这也是斜生栅藻呈草绿色的原因。 斜生栅藻属于无性生殖，产生似亲孢子时，细胞中的原生质体发生横裂， 接着子原生质体发生纵裂变成似亲孢子，从母细胞壁纵裂的缝隙中放出，与纵 轴相平行排列成子群体。斜生栅藻是淡水藻，在各种淡水水体中均能生活，分 布极广。斜生栅藻细胞内含有丰富的蛋白质和维生素，是鱼类很好的饲料，也 可作家禽的饲料，极易进行大量人工培养，故可广泛应用。 1 1 1 2 纤细裸藻简介 纤细裸藻( e u g l e n ag r a c i l i s ) 隶属于裸藻门，裸藻科，裸藻属。与其他微藻 不同的是，纤细裸藻是一种生活在水中的单细胞原生生物，同时具有动物与植 物的两种特性，没有细胞壁。细胞形状呈长梭形或圆柱形，前端有一个凹口， 由此伸出一根鞭毛，其在水中摆动产生的反作用力能够推动身体运动，凹口的 2 第1 章绪论 下方有一个具有感光机能的红色的眼点。如果纤细裸藻生活的水环境中含有有 机物，则其能够靠细胞膜吸取水里的有机物“食物”，过着动物式的异养生活i l 6 1 。 纤细裸藻喜生长在静止、有机质丰富的小水体中，此时极易大量繁殖形成 水华，同时纤细裸藻所适宜生存的温度范围较广，而水华形成的适宜温度范围 为2 0 3 5 ，横跨春、夏、秋三个季节，尤以6 、7 、8 、9 月份生长最旺盛。纤 细裸藻能将高浓度的c 0 2 快速固定作为自身生长的原料，其干重中有5 0 是蛋 白质，优于植物产生的蛋白质，内含2 0 种氨基酸，包括异亮氨酸等9 种人体所 必需的氨基酸，比小球藻更适合作为食品。 1 1 1 3 三角褐指藻简介 三角褐指藻( p h a e o d a c t y l l l mt r i c o r n u t u m ) 隶属于硅藻门，羽纹纲，褐指藻 目，褐指藻属。其形态特征为：具有卵形，梭形，和三出放射形三种不同的形 态，这三种形态在不同的环境条件下可以转变，如在正常的液体培养的条件下， 多是三出放射形细胞和少量的梭形细胞，这两种形态都没有硅质的细胞壁。三 出放射形细胞长度约为1 0 1 8 t r n ，细胞中心部分有一个细胞核，有1 3 片黄褐 色的色素体；梭形细胞长度约为2 0 岬，两臂末端较钝；卵形细胞长度约为8 9 m ， 宽3 9 m ，只有一个硅质壳面，没有壳环带。三角褐指藻的繁殖方式一般是通过 平行分裂成为2 个形态相同的细胞，因细胞无硅质壳，故在裂殖时出与一般硅 藻不一样，藻体不会缩小。 三角褐指藻是类单细胞硅藻，广泛分布于海洋和淡水水体中，它具有较 高的营养价值，油脂含量可达干重的1 5 6 3 1 5 ，因富含多不饱和脂肪酸而被 广泛地应用于水产饵料，可作为鱼、虾、贝等海珍品养殖中的理想饵料，是一 种具有极大开发潜力的优质经济藻种。众多研究表明，三角褐指藻是一种具有 高含量油脂的微藻，而且其成分比较单一，利于分离纯化。此外还具有生长快、 易培养、单位面积产量高、可直接食用等优点，因此被认为是可用于微藻生物 柴油生产的潜力藻种，如陆开宏i l7 j 等。 1 1 2 藻种的应用价值 1 1 2 1 藻种在食品领域的应用 由微藻制成的营养健康食品可以分为两类：一类是在食品超市或药房出售 的直接利用食品级干藻粉制成的藻片或胶囊等营养保健食品：二类是在药房出 3 第1 章绪论 售的个别获得医药批文的产品，有些也可作为医生的处方药物。继日本在1 9 6 4 年领先开创了大规模养殖微藻生产营养食品以来，1 9 7 3 年法国和墨西哥共同建 立了世界上第一个大规模生产螺旋藻的基地。微藻食品的销量持续上升，不仅 在日本、美国、欧洲等发达国家，而且在一些发展中国家也被越来越多的人所 认可。微藻的营养价值是比较高的，这是因为：第一微藻中的蛋白质含量高达 6 5 7 0 ；第二微藻细胞内含有多种维生素，尤其是维生素b 1 2 最丰富；第三 富含人体所必需的9 种氨基酸；第四某些藻类( 如螺旋藻、杜氏藻) 中含大量 的b 胡萝卜素，可有效地抗生物氧化；第五藻体中含有钾、钠、铁、镁、钙等 多种微量元素；第六含有大量的藻胆蛋白，能显著增强机体的免疫功能。 同时微藻也是一种高营养价值的优质饵料，可用来提高水产动物，尤其是 海珍品育苗的成活率，降低育苗的成本，提高幼体的免疫力和生命力，还可以 使观赏鱼的颜色鲜艳。例如因为螺旋藻的细胞中含有大量蛋白质和多糖，其生 长繁殖速度很快，因此可以作为一种优质的饲料【1 8 】。在国际上，很大一部分微 藻已经被用来作为优质饲料。日本的d i c 公司在泰国建造的螺旋藻养殖场每年 产藻粉为1 5 0 吨，其中用作饵料或饲料的约占总量的三分之一，为5 0 6 0 吨； 墨西哥的t e x c o c o 公司每年产藻粉为3 0 0 吨，用作饵料或饲料的就有1 0 0 吨；我 国台湾每年产藻粉3 0 0 吨，其中用于虾苗、观赏鱼类和其它海珍品、鸟类的饲 料为1 2 0 吨 19 1 。 1 1 2 2 藻种在医药领域的应用 微藻细胞内含有大量结构独特的生物活性物质，从有机化学角度看来这些 生物活性物质具有药理活性，这一特性使微藻在制药和保健品的开发应用方面 具有巨大的潜力【2 。微藻含有丰富的不饱和脂肪酸，可以降低血液的粘稠度， 有效减少血液中的胆固醇和低密度脂蛋白的含量，从而起到预防和治疗心血管 疾病的作用拉1 | 。p r a t t 等从小球藻中分离得到含小球藻素的脂肪酸混合物，其具 有有效抵抗细菌和自身毒性的功能；p e s a n d o 证明日本星杆藻的二十碳五烯酸光 氧化产物具有很强的抗菌活性；s i e b u r t h 证明金藻植物褐胞藻合成的丙烯酸是抗 菌化合物【2 2 】；而甲藻前沟藻中的前沟藻内酯、一种海产衣藻( c h l a m y d o m o n a s ) 中的l 型天冬酰胺酶、小球藻和栅藻中的一种糖蛋白等均具有抗肿瘤活性【2 3 1 。 螺旋藻中含有丰富的生理活性成分如叶绿素、b 胡萝卜素、a ，y 亚麻酸、藻蓝 蛋白、多糖、糖酯、维生素、微量元素可促进细胞新陈代谢，调节人体机能， 4 第1 章绪论 提高自身免疫力，抗辐射、抗氧化、抗衰老，对多种疾病如高血压、糖尿病、 心脏病、肿瘤、艾滋病、金属中毒、肥胖等均有明显的功划2 4 j 。 1 1 2 3 藻种在化妆品领域的应用 一些医疗机构的临床试验表明，微藻营养液可以提供皮肤所需的氨基酸、 超氧化物歧化酶( s o d ) 、藻多糖等各种营养活性成分，而且微藻营养丰富，能够 清除自由基，起到防皱、抗衰老、抗辐射的作用。从微藻细胞中可以提取能吸 收紫外线的酪氨酸制剂，有防晒、祛斑的效果。螺旋藻及其酶解产物还有刺激 皮肤的新陈代谢，防止皮肤形成角质化的作用。同时，微藻制成的化妆品透过 性好，能为皮肤表层和深层补充营养和进行护理，对皮肤没有刺激和过敏作用 f 1 9 】 0 1 1 2 4 藻种在污水处理中的应用 利用微藻处理污水是一项污水资源化生物技术。近年来，国内外开展了大 量关于藻类培养和废水处理的研究，发展了藻类处理技术，包括藻类塘、活性 藻、非活体藻类、固定化藻类、光生物反应器。h a m m o u d a 等【2 5 j 用小球藻( c h l o r e l l a v u l g a r i s ) 和四尾栅藻( s c e n e d e s m u sq u a d r i c a u d a ) 处理水产养殖废水，其中的氮、 磷去除率均可达到1 0 0 ，处理后废水的c o d 和b o d 5 均可达到排放标准。王 爱丽掣2 6 j 将铜绿微囊藻进行固定化，分别对合成污水和实际污水进行净化，结 果表明，合成污水经过5 天的净化，固定化铜绿微囊藻对合成污水中n 0 3 - n 和 p 0 4 3 - _ p 去除率分别可达到9 2 9 2 幂i6 9 1 9 ，而悬浮态铜绿微囊藻对n 0 3 n 和 p 0 4 3 p 的去除率分别可达到3 6 5 4 幂i2 6 7 7 。实际污水经过6 天的净化，固定 化铜绿微囊藻对污水中n 0 3 - n 和p 0 4 3 - - p 的去除率都达到了1 0 0 。 1 1 2 5 藻种在基因工程中的应用 如今，随着基因工程的迅速发展，大量的微藻基因被克隆、测序和定位， 其相关的功能也进行了遗传分析。现已知被利用的蓝藻基因有2 种，被人工克 隆的蓝藻基因有1 3 0 多种【27 1 。同时还可将微藻的优势进一步发挥，从中分离出 有经济价值的基因，在大型藻类、细菌、真菌及高等植物中进行表达，创造巨 大的经济效益。总之，随着科技发展，微藻的应用前景会更加广阔。 1 1 2 6 藻种在开发生物质能源中的应用 生物质能是绿色植物通过叶绿素将太阳能转化为化学能而贮存在生物质内 5 第1 章绪论 部的能量。研究表明，微藻催化热解可得到芳烃含量高、辛烷值高的汽油【2 引。 藻类具有生物量高、生长周期短、易于培养以及油脂含量高等特点，是一种制 备生物质液体燃料的良好材料。微藻生物热解所得的生物质燃油热值高达 3 3 m j k g ，是木材或农作物秸秆的1 6 倍。通过调节微藻的培养条件和脂肪含量， 可获得高品质、高热值的生物质燃油1 2 圳。d o t e 等在3 0 0 下以n a e c 0 3 为催化剂 对葡萄球藻进行高压液化，所获得的液态油含量可达到其干重的5 7 - 4 5 4 ，其 中的烃含量为5 0 ，油的质量大致与石油相割3 0 j 。吴庆余等通过调整碳、氮源 的供给获得异养小球藻，该细胞内不含叶绿素，而且蛋白质含量非常低，但其 粗脂肪含量却比自养条件下培养的小球藻提高了3 4 倍，同时快速热解高脂肪含 量的异养藻可获得5 7 2 的产油率，比白养藻的产油率提高了2 4 倍 3 1 1 。 1 2 微藻生长和油脂积累的影响因素 1 2 1 碳源对微藻生物量和油脂积累的影响 微藻是一种自养型生物，依靠光能，以c 0 2 为唯一碳源进行光合作用生长。 但是在自养条件下，由于光因素和营养元素的限制，微藻的生长量和含油量均 较低。研究表明，有些微藻可以利用外加碳源进行异样生长，生长量和油脂量 均大大提耐3 2 j 。外加碳源可以分为两类：无机碳源和有机碳源，其中无机碳源 包括c 0 2 、n a h c 0 3 和n a 2 c 0 3 ，有机碳源包括糖类、有机盐类和醇类。郑洪立1 3 3 j 等研究了无机碳源对小球藻产油脂的影响，结果表明：小球藻能利用c 0 2 、 n a h c 0 3 和n a 2 c 0 3 产油，当c 0 2 、n a h c 0 3 和n a 2 c 0 3 的初始浓度分别为6 、 4 0 m m o l l 、4 0 m m o l l 时，其生物量最大分别可达到2 4 2 l 、0 6 7 l 和0 5 2 l ， 分别是空白对照组的1 5 1 、4 2 和3 3 倍；其对应的油脂产量分别为0 7 2 9 l 、 0 2 2 9 l 和0 1 9 9 l ，分别是空白对照组的1 2 、3 7 和3 2 倍，得出c 0 2 是小球藻 生长和产油脂的最佳无机碳源。杨静等1 3 2 j 的研究表明，在自养、异样和兼养条 件下，栅藻的含油量分别为3 5 6 9 、3 0 2 5 和3 6 1 7 ，生长量分别为0 3 5 9 l 、 1 6 6 9 l 和2 8 6 ，l ，油脂产率分别为1 5 7 0 m g ( l d ) 、6 2 6 2m g ( l d ) 和1 2 9 1 3 m g ( l d ) ，葡萄糖的加入量大大提高了油脂产率，兼养组的生长量是自养组的 8 1 倍，兼养组的油脂产率是自养组的8 倍。刘晓娟1 3 4 j 等的研究结果表明，三角 褐指藻具有异样生长的能力，它可以利用甘油、乙酸钠和葡萄糖进行生长，添 加甘油、乙酸钠和葡萄糖兼养所获得的生物量分别是自养组的1 6 0 、1 2 8 和1 2 1 6 第1 章绪论 倍，所获得的总脂肪含量分别是自养组的1 2 0 、1 4 3 和1 0 2 倍。 微藻的生物量和油脂积累也与碳源的浓度有关。h s u e h l 3 5 1 等研究发现，当 c 0 2 的浓度范围为0 0 4 8 0 0 时，斜生栅藻的生物量和油脂含量都会增加，但 当c 0 2 浓度增加到1 0 0 0 时，斜生栅藻的生物量和油脂含量都会减少。此外， 还有一些研究也发现，c 0 2 浓度高于5 0 0 可能会损伤藻细胞，抑制微藻的生长 3 6 - 3 8 】。w i d j a j a 等进一步研究认为，产生这种情况可能是由于高浓度的c 0 2 导致 培养液的p h 降低所致眇j 。 1 2 2 环境因子对微藻生物量和油脂积累的影响 微藻的培养受到很多因素的影响，这些因素包括温度、光照强度、p h 等， 这些因素都会对微藻的生理生长和油脂积累产生影响。 ( 1 ) 温度对微藻生物量和油脂积累的影响 微生物的生长和产物合成都是在酶催化反应下进行的，因此温度是微藻生 长代谢活动的重要影响因子之一。不同的微藻适应生长的温度各不同，不适应 的温度会减缓微藻的生长和代谢甚至会使藻细胞死亡，相反合适的温度则可以 加速微藻的生长。潘瑾等【4 0 j 的研究结果表明当温度范围在1 0 3 0 之问时，随着 温度的升高，三角褐指藻到达指数生长末期所需的时间缩短；当温度范围在 1 0 - 2 0 之间时，随着温度的升高三角褐指藻的生长速率增加，藻细胞在2 0 时 培养能够达到最大密度。 同时温度也是影响微藻油脂积累的重要环境因子之一，既会影响微藻的油 脂产量，又会影响微藻脂肪酸的种类。c o n v e r t i 【4 l j 等研究表明，斜生栅藻 ( s c e n e d e s m u so b l i q u u s ) 在2 5 和3 0 下生长速率一样，但是在2 5 生长下的 油脂积累速率和产量分别是后者的2 7 和5 o 倍。李文权等【4 2 】等的研究结果表明， 等鞭金藻、盐生杜氏藻、三角褐指藻的不饱和脂肪酸含量随温度升高而下降， 饱和脂肪酸含量则随温度升高而上升。潘瑾等【4 0 j 对温度影响三角褐指藻的生长 和脂肪酸组成进行了初步探讨，结果表明：随着温度的升高三角褐指藻到达指 数生长末期所需的时间缩短，不同温度下三角褐指藻的主要脂肪酸为c 】4 、c 1 6 、 c 1 8 和c 2 0 ( e p a ) ，总脂肪酸含量随着温度的升高依次呈现先升高后降低的趋势， 在1 5 时e p a 占总脂肪酸的百分含量可达到最高值2 5 7 1 。 ( 2 ) 光强对微藻生物量和油脂积累的影响 光照是影响微藻光合作用的重要因素，光照强度的变化会显著影响藻类的 7 第1 章绪论 生长。过低的光照强度会降低微藻的光合效率，影响微藻的生物量；过高的光 照强度不仅不能被藻细胞有效地利用，可能还会抑制藻细胞的生长；只有在合 适的光照强度下，微藻才能有效地利用光照进行光合作用。严美姣【4 3 】等设定了 不同的光照周期和光照强度来研究其对小球藻、斜生栅藻生长速率和叶绿素含 量的影响，结果表明5 0 0 0 1 x 光照强度和1 8 l 6 d 的光照周期培养条件下小球藻、 斜生栅藻的生长速率最大，叶绿素含量最高。 光强的变化对有些藻类的油脂变化也是有显著影响的，这可能与光强影响 藻细胞内的三酰甘油的含量有关。s u k e n i k a 等m j 的研究表明，斜生栅藻在高光 强下三酰甘油的含量有所增加，并且通过同位素示踪法测得，在高光强下流向 三酰甘油的新同化的碳的比例增加。王付冬【4 5 j 报道，随着光强的增加，斜生栅 藻的油脂含量先增加后减少，说明合适的光照强度可以增加油脂的含量。郭兵 等m 】的研究表明，在设置的光照强度范围内，光照强度越强，微藻的生长速度 越快。光强对各种脂肪酸的含量影响有差异，过低和过高都不利于藻体内p u f a s 的积累。 ( 3 ) p h 对微藻生物量和油脂积累的影响 p h 是微藻培养条件的一个重要因子，在一定程度上影响微藻的生长等代谢 过程，它可以影响微藻光合作用中c 0 2 的吸收利用，同时在微藻的呼吸作用过 程中，一方面p h 会影响微藻对有机碳源的吸收利用，另一方面p h 对培养基中 离子的吸收利用也有影响1 4 。大多数微藻所适应的p h 范围为6 8 。 p h 值能改变培养基中碳源的存在形式、微藻体内相关酶的活性和结构状态 以及各种金属复合物的溶解度，从而影响微藻的生长及脂肪酸含量1 4 引。生物体 内长链脂肪酸的合成是从1 6 ：0 开始，通过一系列脱氢酶、加氧酶和链延长酶类， 向1 6 ：1 和1 8 ：0 转化，p h 可能会影响与此过程有关的酶的活性1 4 9 | 。微藻体内酶 的最适p h 值为7 5 8 0 左右，在p h 值为7 5 8 0 的条件下，有关酶能很好的发 挥作用，使油脂的不饱和度增加，从而增加多不饱和脂肪酸的含量；在其它p h 值时，多不饱和脂肪酸的含量相对较低1 4 引。 1 3 微藻生物油提取技术 微藻中含有丰富的油脂，从微藻中提取的生物油脂不含胆固醇，氧化稳定 性好，而且没有腥味，因此利用微藻生产生物油脂具有巨大的潜力，而如何快 8 第1 章绪论 速简单地从微藻中提取生物油脂则成为全世界科研工作者的难题。目前微藻生 物油脂提取技术主要包括以下几种：细胞破碎法、混合有机溶剂抽提法、超临 界c 0 2 萃取法。 ( 1 ) 细胞破碎法 孙晓璐【5 0 】等对产油酵母菌采取了不同的细胞破碎法，如：冻融破碎法、超 声波破碎法、酸热法、冻融与酸热结合法，研究了不同的破碎方法对产油酵母 菌细胞破碎程度以及细胞破碎后的油脂得率的影响。冻融破碎法是指通过温度 的突然变化，在形成冰粒和剩余胞液盐浓度增高的同时，细胞发生溶胀破碎， 从而达到使细胞破碎的目的；超声波破碎法是利用超声波产生独特的机械振动， 使细胞结构发生变化，促使细胞破碎；酸热法主要是利用盐酸对细胞中的糖份 及蛋白质等成分的作用，使细胞结构变得疏松，再经过沸水、冷冻处理，使细 胞达到破碎的效果。研究结果表明：采用冻融破碎法，破碎温度越低，溶解时 间越长，油脂得率越高；采用超声波破碎法，油脂得率与超声作用时间成正比， 延长超声作用时间，能显著提高油脂得率；采用酸热法，油脂得率与盐酸浓度 成正比，盐酸浓度为3 m o l l 时的油脂得率是l m o l l 时的两倍；冻融与酸热结合 法的细胞破碎效果不如酸热法理想，油脂得率也比酸热法略低。 姜进举【5 l 】等研究表明不同的细胞破碎方法也会导致细胞内油脂萃取效率的 差异，由于微藻的种类繁多，因此需要选择不同藻种各自适合的细胞破碎和萃 取方法。由于细胞破碎法的耗时长，油脂得率低，因此不适于工业生产。 ( 2 ) 混合有机溶剂抽提法 混合有机溶剂抽提法是目前以微藻为原料制备液体燃料最常用的实验室方 法，具有工艺相对成熟，所得油品质量较好，生物油的使用性能与矿物石油基 本相当的优点。常用的有机溶剂主要包括氯仿一甲醇、乙醇一正己烷、乙醚一石油 醚等。陈文利【5 2 】等用乙醇一正己烷混合溶剂从被孢霉菌体中提取油脂，油脂得率 为3 4 8 。禹慧明【5 3 】等采用不同的有机溶剂系统提取被孢霉菌体中的y 亚麻酸油 酯，研究结果表明：所用溶剂系统中以氯仿一甲醇、乙醇一正己烷和氯仿一甲醇一 正丁醇一水- e d t a 的效果较好，尤以氯仿一甲醇一正丁醇一水- e d t a 的提取效果 最佳，可获得最高的油脂得率。马建设【5 4 】等用有机溶剂提取裂殖壶菌中的油脂， 发现当氯仿和甲醇以1 ：1 的体积比混合时，油脂提取得率最高。姚领1 55 j 等用氯仿 一甲醇和乙醚一石油醚两种溶剂系统提取三角褐指藻中的油脂，结果表明两种提 取法在提取三角褐指藻中油脂含量上差别明显，而在油脂种类上差别不大，氯 9 第1 章绪论 仿一甲醇法所提取的油脂含量为3 9 0 1 ，乙醚一石油醚法所提取的油脂含量为 2 0 0 6 。 综合所述，氯仿一甲醇法提取出的油脂含量高，离心效果好，溶剂腐蚀性小， 提取物与非提取物分层明显，但是由于氯仿和甲醇作为萃取剂具有较强的毒性 且难以回收，不适合用于食品生产，同时对环境也会产生危害。而乙醇一正己烷 法和乙醚一石油醚法提取的油脂含量相对较低，但其毒性小，易于操作和产业化。 因此，乙醇一正己烷提取法和乙醚一石油醚提取法在食品方面的应用前景更广。 ( 3 ) 超临界c 0 2 萃取法 超临界c 0 2 萃取法是新一代化工分离技术，广泛应用于分离和提取生理活 性物质，具有有效防止提取物氧化分解，可在常温下操作，无溶剂残留，安全 性高等特点。目前已有不少采用超临界c 0 2 萃取法提取真菌油脂的报道。禹慧 明1 5 3 j 等用超临界c o ：萃取法提取被孢霉菌体中的v 亚麻酸油酯，油脂得率略低 于混合有机溶剂抽提法，但超临界c 0 2 萃取法具有操作简单，安全性高，萃取 成本低，不使用有毒易燃的有机溶剂；同时在萃取过程中由于萃取温度低，油 脂等活性成分不易受热、被氧化而损失，且c 0 2 极性低，提出的油脂杂质少， 纯度高，含量高，品质好。李植峰【5 6 】等的研究结果表明，超临界c 0 2 萃取法提 取真菌油脂的效果比索氏法略差，但油脂的脂肪酸组成及含量相近，且样品需 要量小，样品处理能力较索氏法大为提高。宋启煌【57 j 等应用超临界c 0 2 萃取法 分离e p a 和d h a ，结果表明超临界c 0 2 萃取法具有萃取率高、产品气味佳、无 溶剂残留、不破坏多烯不饱和脂肪酸、不危害环境等优点，效果比混合有机溶 剂提取法要好，同时操作简单方便，所用c 0 2 的性质稳定安全，提取成本低。 因此超临界c 0 2 萃取法也是一种较理想的油脂提取方法，适合用于工业生产。 1 4 微藻脂肪合成与代谢调控 随着能源与环境问题的日益严峻，利用微藻生产生物柴油已经成为全世界 研究者们的研究热点。与传统的油料作物相比，微藻具有生长速度快、含油量 高、不占用耕地等优势，是极具潜力生产生物燃料的原料。虽然许多微藻在压 力条件下( 如缺氮、高光等) 会在细胞内积累脂肪，特别是中性脂肪中的三酰 甘油，它是生产生物柴油的主要原料，但是为了更好地理解和操控微藻的脂肪 代谢以增强脂肪的积累，有必要对微藻的脂肪合成与代谢调控进行研究。 1 0 第1 章绪论 1 4 1t a g 的生物合成途径 微藻细胞内的脂肪可以分为两大类，即极性脂肪和中性脂肪。极性脂肪包 括各种磷脂和糖脂，是构成各种细胞质膜及细胞器膜的主要成分。中性脂肪包 括二酰甘油( d a g ) 、三酰甘油( t a g ) 和胆固醇等，通常是细胞在压力条件下积累 的产物，用于储存能量以支持细胞的生长和分裂。其中，t a g 是中性脂肪的主要 成分，同时也是生产生物柴油的主要原料。t a g 在有酸碱作催化剂的条件下会与 甲醇发生转酯化反应生成脂肪酸甲酯( 生物柴油) 和副产物甘油。形成t a g 的主 要途径f 5 s l 包括脂肪酸合成途径和t a g 合成途径( 团 k e n n e d y 途径) 。 1 4 1 1 脂肪酸合成途径 c 0 2 进入叶绿体经过卡尔文循环产生三磷酸甘油醛，随后通过糖酵解途径形 成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下释放一分子c 0 2 并生成乙酰辅酶a ， 而乙酰辅酶a 在乙酰辅酶a 羧化酶的催化作用下，在a t p 和c 0 2 的参与下，生成丙 二酰辅酶a ，这一过程被认为是脂肪酸合成的第一个关键反应，同时丙二酰辅酶 a 是脂肪酸合成的中心碳供体。丙二酰基从丙二酰辅酶a 上转移到蛋白辅因子酰 基载体蛋白( a c p ) 上形成丙二酰一a c p ，a c p 是脂肪酸生物合成所必须的辅因子， 此后所有的反应都需要它的参与，直到脂肪酸形成各种甘油脂或者被运出叶绿 体。丙二酰a c p 在脂肪酸合成酶( f a s ) 的作用下经过一系列碳链加长和脱饱和反 应最终形成以c 1 6 和c 1 8 为主的脂肪酸，这些脂肪酸是合成细胞膜、细胞器膜以及 三酰甘油的前体物质【5 9 j 。 1 4 1 2k e n n e d y 途径 t a g 的合成过程包括：游离的脂肪酸被运出叶绿体后，在内质网上进行 k e n n e d y 途径形成t a g ，此合成途径是依赖于酰基辅酶a 的，没有酰基辅酶a 的 参与是无法合成t a g 的。在内质网上t a g 的合成主要包括四个步骤：首先是3 磷酸甘油和酰基辅酶a 在甘油三磷酸酰基转移酶的作用下在s n - 1 位发生酯化反应 生成溶血磷脂酸，然后溶血磷脂酸在溶血磷脂酸酰基转移酶的作用下在s n 一2 位发 生酯化反应生成磷脂酸，接着磷脂酸在磷脂酸磷酸酶的催化作用下脱去磷酸形 成二酰甘油，最后二酰甘油经二酰甘油酰基转移酶的催化作用在s n 3 位上酯化形 成t a g ，t a g 以脂肪体的形式储存在细胞内【6 0 j 。在这个过程中，磷脂酸k d - _ 酰 甘油也能作为底物合成极性脂肪( 如磷脂酰胆碱和半乳糖脂) 。事实上，t a g 的 积累不仅仅是简单地用于储存碳源和能源，同时在整个藻细胞的生命周期中还 第1 章绪论 起着至关重要的作用，例如周转膜脂，消耗光合作用电子传递链中过量电子以 及光保护作用等【5 8 j 。 1 4 2 提高脂肪积累的生化调控 虽然微藻储存脂肪的能力与藻种紧密相关，但是通常情况下微藻在适合的 生长条件下细胞内脂肪的含量并不高，而往往是当微藻处于不利的生长条件下 才会倾向于大量合成和积累脂肪。影响脂肪积累的因素包括营养元素( 例如氮、 磷、铁、硅) 、p h 、光照、温度等，其中营养元素的控制是目前为止研究最多， 也是最容易操作的方式。 营养成分胁迫诱导微藻积累油脂的原因可能是：氮是细胞大分子的重要组 成成分，磷是细胞器膜结构的组成成分，硅是硅藻细胞壁的组成成分，氮磷硅 的胁迫会使细胞分裂和增殖受到抑制，因此细胞对碳的同化吸收会更多的流向 脂肪，其他非脂类成分也会逐渐向脂肪转化，使脂肪大量储存在藻细胞内。缺 氮是报道最多的启动脂肪积累的营养限制因子，对许多藻种都有显著影响【6 1 卅j 。 在缺氮的情况下，虽然细胞的生长和细胞内各组分的合成受到抑制，但是细胞 内的脂肪含量可以维持在较高水平。此外，磷对细胞的能量生物转化相关过程 非常重要，光合作用需要大量蛋白，蛋白合成需要富含磷的核糖体。因此，缺 磷会使微藻的光合作用受到严重影响，有可能会使细胞代谢倾向于脂肪合成1 6 引。 虽然营养因子胁迫能有效地提高脂肪含量，但同时也抑制了微藻的生长和光合 作用，使得生物量下降，影响微藻的整体脂肪产量。优化整体脂肪产量可以采 用两段培养法，即第一阶段将微藻置于营养充足的培养基中进行培养，此时藻 细胞生长和分裂作用旺盛，藻细胞可达到较高密度；第二阶段将微藻转至营养 缺乏的培养基中培养，促使藻细胞更多地积累脂肪。 1 4 3 提高脂肪积累的基因工程策略 生物学表明微藻的脂肪酸合成途径以及t a g 合成途径与高等植物很相似，因 此基于对高等植物基因工程的研究，学者们提出了针对提高微藻脂肪含量的基 因工程策略，主要包括5 个方面：增强脂肪酸的合成途径、增强k e n n e d y 途径、 调控t a g 的旁路途径、抑制脂肪合成的竞争途径以及抑制脂肪的分解代谢途径 5 9 】 o 目前微藻的脂肪代谢机制大部分参考了高等植物的研究结果，两者虽然在 1 2 第1 章绪论 较大程度上有相似之处，但也存在着不同，因此有必要对微藻的脂肪代谢机制 进行更深入的研究。提高脂肪积累的方式有生化调控和基因工程策略两种，其 中最有效的生化调控手段是限制氮源，但是生化调控往往会阻碍藻细胞的增殖 和分裂，因此要在保证不影响细胞整体生长量的情况下，对培养工艺进行优化 以使藻细胞更多地积累脂肪。在清楚微藻脂肪合成机理的基础上，运用基因工 程策略操纵已经进行基因测序的微藻，以获得脂肪含量高的藻株。目前对高等 植物的研究表明，增强t a g 合成途径中酰基转移酶的表达能显著提高植物体内的 含油量，效果比增强脂肪酸的合成途径更理想【6 6 | ，但这一结果在微藻中是否如 此还不清楚。另外一个提高微藻脂肪合成的策略是超表达t a g 合成过程中的多个 关键酶，但以目前的技术水平来看，操控多个基因还存在难度，并且由于缺乏 微藻的遗传信息，并不是所有藻株都适合基因改造。 1 5 微藻产生物柴油研究进展 生物柴油是生物质能的一种，与石化柴油相比，具有不含硫和芳烃、十六 烷值高、可被生物降解、对环境危害小等优势，达到美国“清洁空气法”所规 定的健康影响检测要求，且其闪点高，在储存、运输和使用过程中都非常安全， 所以成为最受欢迎的石油替代能源之一。制备生物柴油最常用的两种方法是酯 化及转酯化反应，其基本原理是脂肪酸与一元短碳链醇进行酯化反应、脂肪酸 甘油酯与一元短碳链醇进行转酯化反应制备脂肪酸单酯。传统的生物柴油生产 原料主要是一些产油植物( 如玉米等) ，随着生物柴油产业的发展，将会出现产 油植物与人争地与人争粮的局面，因此日后生产生物柴油的主要原料来源是非 粮油料植物和富油微藻。微藻是地球上可利用二氧化碳进行光合作用的最简单 的生物，某些富油微藻可在细胞内合成油脂，其单位面积产油率约是陆生油料 作物的1 0 - - 2 5 倍，每公顷年产油量可达2 0 3 0 t ，因此受到广泛重视。微藻的高生 产效率、高含油量、对土地质量要求低及对环境的耐受力强等特点使其成为替 代液体燃料资源的最佳选择之一【67 1 。 1 5 1 生物柴油的性质 生物柴油一般是由多种脂肪酸甲酯组成，与传统的石化柴油的性能相比， 生物柴油的优越性可以概括为以下几个方面【6 蹦9 】： ( 1 ) 环保性良好。生物柴油无毒害，含硫量低，二氧化硫以及硫化物排放 1 3 第1 章绪论 量低；不含苯类，c o 和废气排放量低，不具有致癌作用；生物柴油具有很高的 生物降解性，其降解速率基本是普通石化柴油的2 倍，环保性能良好。 ( 2 ) 燃烧性能高。生物柴油的十六烷值高，通常高于5 0 ，抗暴性能优于普 通石化柴油，且含氧量高，其点火和燃烧性能与石化柴油相比具有明显的优越 性。 ( 3 ) 润滑性能和启动性能良好。生物柴油的运动粘度高，能提高发动机缸 体等运动机件的润滑性能，无添加剂时冷凝点达负2 0 ，具有良好的低温发动 机启动性能，能够降低磨损率，延长机器使用寿命。 ( 4 ) 原料来源广。生物柴油的原料来源广泛，可以以动植物油脂、微生物 油脂和餐饮废弃油等为原料，其可生物降解性能高。 ( 5 ) 安全性能良好。生物柴油的闪点高，基本高出普通石化柴油7 0 ，不 属于危险物品，便于安全运输、存储和使用。 由以上各方面可知，生物柴油因其相对石化柴油具有环保、可再生和安全 等优点，使其具有广阔的应用前景，成为国内外研究的热点，为当代推进新的 清洁能源，减轻环境压力具有重大的意义。 1 5 2 微藻产生物柴油国内外研究现状 近年来能源危机日益严重，世界各国都在寻求可代替传统石油的新型能源， 生物柴油以其清洁性、环保性等特点引起许多国家的高度关注。目前对生物柴 油的研究发展最快的是欧洲国家，主要有