（环境科学与工程专业论文）厌氧颗粒污泥产甲烷菌群功能基因克隆及分析研究.pdf

河北科技大学硕士学位论文 值降低的速度和程度均有所增大。由此推测，基因工程菌的投加，可能有利于产酸 过程，进而提高产甲烷速率；同时，乙酸加速积累导致p h 值快速降低，抑制了产 甲烷菌的活性，造成厌氧颗粒污泥的累积产甲烷量明显降低。 关键词厌氧颗粒污泥；产甲烷菌群分析；克隆文库；p c i r d g c 陋；生物强化； 产甲烷活性 a b s t r a c t 。 m e m 咖g e 嬲8 坞c 0 嬲i d e dt ob ei n l p o r t 斑f i l n c t i o n a lp o p u l 撕。邶i n 强a e r o b i c f 叫u l 盯s l u d g e ，觚d 肌c 喇g e n e 胁c o d i n gg s u b u i l i to fm e m y lc o e 皿y m e mr e d u c t a s e ( m c r ) i su l l i q u e f o rm e t l l 锄o g e 邶m e t h 锄o g 即i cc o m m u m t yi i l 锄a e r o b i c 黟a n u i a r s l u d g es a 瑚i p l 蕾r 锄 允u s c a l eu a s bb i o f e a c t o i i s仃e a t i n gv b l i 甜l da v e 衄a c t i n w 嬲t e w a t e rw e i n v e s t i g a t e db yp c r d g g e 觚dc l o n el i b r a 叮b a s e do n 聊c 栩g e n e t h e d i v e r s i t yo fm e t l l 锄o g 觚cc 0 姗u 1 1 i t y 锄dt i l ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po fd o m i n a i l t m e t l l a l l o g e i i l cp o p u l a t i o 璐w e r e 锄a l y z e da n dc o m p a r e db e t 、) l ，e 啪d i 依= r 髓ts 锄p l e s t h e e f | f e c t so fg 朗e t i c a l i ye n 西n e e r e dm i c r o o 玛a 砸s m so nm e t l l a n e p r o d u c i n gc 印a c i t y o f s l u d g es 锄p l e sw e r ea l s od i s c u s s e d t h er e s u l t sw e r es h o w n a sf o l l o w s t h ed i 懋暑r e n c ei nd g g eb a n dp a i t e mb e m e e nt 、v os l u d g es 卸叩l e si n d i c a t e dt h a tt h e s t m c t u r eo fm e t h a n o g e n s 卸dd o m i n a n ts p e c i e sv a r i e di nd i f f h e n tt r e a t m e n te n v i r o 舢e n t s h a 仰o nd i v e r s i t yi n d e x ，m a 唱a l e ft i c h n e s si n d e xa n db e r g e r p a r k e rd o m i n a n c ei n d e x w e r ec a l c u l a t e d 劬md g g eb a n dp a t t e m so ft w od i 行旨e n ts l u d g es a m p l e s ，w h i c h s h o w e dh i g l l e rd i v e r s i t y 缸dm o r er i c h n e s so fm e t h a n o g e n si ns l u d g es a m p l et r e a t i n g v b l 2w a s t e w a t e rc o m p a r e dt os l u d g es 锄p l et r e a t i n ga v e m a c t i nw a s t e w a t e r d u et o d ih e r e n tw a s t e w a t e rt r e a i m e n te n v i r o r l m e n t d g g eb a n d so fb o t hs a m p l e sw e r es e q u e n c e dt od e t e m l i n e dt h ed o m i n a n ts p e c i e s o fm e t h a n o g e n si na n a e r o b i cg r a n u l a rs l u d g ea n da i l a l y z et h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po f m e t h a n o g e n s i ns l u d g es a m p l et r e a t i n gv b l 2w a s t e w a t e r ，以p ， a ，l d s 口p f 口b e l o n g i n gt o ，押p ， a ，l d 口口，d ，2 a 正鲫w a sd o m i n a n ta n d ， p f 矗口珂d 6 口c f p ，f 口f p sw a sa l s od e t e c t e d i ns l u d g e s 锄p l et r e a t i n ga v e r m a c t i nw a s t e w a t e r ，t h ed o m i n a n ts p e c i e sw a sa j s od e t e 舯i n e dt ob e 册p f j i l 口，l d s 日e f 口 i na d d i t i o n ，挖e f 口n o s 口，c f 以口 b e l o n g i n g t o ， e f 矗口以o s 口，- c f ，l 口厶巴譬a n d e 聃口以d 6 口c f p ， 口，西w a sa l s od e t e c t e d t h ec l o n el i b r a r ya n a l y s i so ft h em e t h a n o g e n t si nb o t hs 锄p l e sb a s e do n ，l c r 彳g e n e m d i c a t e dt h a t ，力p f j i l 口以o s 口，d 肛口厶亨s ，以e f j i l 口玎d 6 口c f 口r f 日 巳s a n d ，竹p f j l 2 口，l d ，竹f c ，d 6 f 口 b sw e r e d e t e c t e di l l s l u d g es a m p l et r e a t i n g v b l 2w a s t e w a t e r ，a n d m p 砌口，l d j 口，c 砌口，e sw a s d o m i n a n t 1 na d d i t i o n ，o n l y ，靠e f 口，l o s 口，f n a f 甜a n d ，”e f i l l 口珂0 6 口c f e r f c “昭w e r ed e t e c t e di n s l u d g es a m p i et r e a t i n ga v e n n a c t i nw a s t e w a t e r a n dm p 伪口以d s 口p f i 口w a sd o m i n a n i t h e r ew 鹬0 b 讥o u sd i 疵r e n c ei nm e m a n o g e n i cc 0 删 1 l u n i t y 锄a l y s i sb e t w e c l o n e l i b r a 巧锄dp c r d g g e f o rs l u d g es 锄p l et r e a t i n gv b l 2w a s t e w a t e r ，棚e 聃口以口，c f 甩口胁 i i l 河北科技大学硕士学位论文 w 蠲d e t e 眦l i n e dt 0b e 蛐a n t 髑i 1 1 9b o md o n eh b 姐巧锄dp c r - d g c e ，b u t m e 班口加m f c 加栅垴w 勰m 沱e 曲e do n l yi nc l o n e 琢哪孤a l y 3 i s hs e e m e d 也砒d o n b h l b m r yc o l l l dp f o 们d em o r ei n f o m a d o no f m i c b i a lp o p l l i a 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性质、粒径大小及灰分含量均会影响厌氧颗粒污泥的密度。 厌氧颗粒污泥的孔隙率多在4 0 8 0 之间。颗粒污泥的粒径大小与孔隙率成反 比。颗粒污泥的粒径越小，污泥的生命力越强，产甲烷活性越高。 s c h m i d t l ，j 认为，厌氧颗粒污泥的沉降速率范围为】8 1 0 0 m 之间。沉降速率为 1 8 2 0 n 沛的颗粒污泥，沉降性能不好；沉降速率为2 0 5 0 m h 的颗粒污泥，沉降性能 较好；沉降速率为5 0 1 0 0 n 沛的颗粒污泥，沉降性能很好。 1 1 1 2 厌氧颗粒污泥的化学特性 厌氧颗粒的化学组成为：灰分、蛋白质、总糖、总有机碳、凯式氮和胞外多聚 物等f 8 】 颗粒污泥的密度会随着污泥中无机灰分的增多而增大，且污泥中的灰分会提高 颗粒强度的稳定性，为菌体粘附提供天然支持物，加快污泥的颗粒化。无机灰分在 河北科技大学硕士学位论文 污泥中的空间分布不均匀，且不同生长基质中污泥的灰分有较大不同。 厌氧颗粒污泥的7 0 9 0 为挥发性悬浮物( v s s ) ，v s s 的主要成分是细胞和胞 外多聚物。胞外多聚物的成分主要是聚多糖和蛋白质，还有少量的类脂质和核酸等。 颗粒污泥中许多厌氧微生物都可以产生胞外多聚物。 1 1 1 3 厌氧颗粒污泥的生物特性 厌氧颗粒污泥中的微生物群落主要是由细菌和古菌组成，大致可分为3 类：水解 发酵菌，将分子量较大的有机物分解为分子量较小的有机物；产乙酸菌，将水解发 酵得到的小分子的有机物进一步分解成乙酸；产甲烷菌，将氢气、二氧化碳、乙酸 等化合物转化为甲烷。这三种微生物在颗粒污泥中交错缠绕，形成菌丛，通过自然 选择的方式在生物反应器中进行分布，使菌群之间的相互作用能协调进行。 1 1 2 厌氧颗粒污泥的形成 1 1 2 1厌氧颗粒污泥的形成机理 厌氧颗粒污泥的形成从本质上来说就是厌氧微生物生态系统的演化，这一生态 学过程需要微生物与微生物、微生物与环境之间相互作用、相互影响，从而达到动 态平衡。尽管厌氧颗粒污泥的形成机理是许多学者研究的对象，但没有一个统一的 说法，只是不同学者从不同角度提出各自不同的观点。 有学者认为厌氧颗粒污泥的形成是由于无机物的相互作用，他们认为c a c o 卦 f e s 、s i 0 2 等无机物在颗粒污泥形成过程中起着重要作用。细胞表面带负点，可以吸 附带正电的钙和硅，中和细胞表面的负电荷，使细菌表面因电荷减少而形成疏水性， 从而，使细菌凝聚在一起，形成颗粒污泥。 还有些学者认为，颗粒污泥的形成是由取决于微生物的自身性质。他们通过透 射和扫描电子显微镜发现，颗粒污泥中的某些微生物，如产甲烷八叠球菌和产甲烷 杆菌会分泌以夹膜或胞外黏液形式累积的胞外多聚物，为共生细胞间形成生物键提 供了条件，并使菌体由于胞外多聚物的黏附作用附着于其他物质表面或相互黏合而 形成颗粒污泥。 1 1 2 2 厌氧颗粒污泥的形成条件 当采用u a s b 反应器来去除废水中有机物时，厌氧污泥的颗粒化对污染物的去 除效果和能力会产生深远的影响，因此许多学者一直致力于厌氧污泥颗粒化的研究。 厌氧颗粒污泥的形成受一下几方面影响。 第一，废水性质及有机物浓度。到目前为止，已经有人从不同的废水中培养出 了颗粒污泥。资料显示，污泥在处理含糖废水时易颗粒化，而在处理含脂类和蛋白 质废水以及有毒难降解废水时较难颗粒化，或根本不能颗粒化。污泥要想颗粒化， 所需要废水的c ：n ：p 最佳为2 0 0 ：5 ：1 ，否则要适当调整。厌氧污泥颗粒化所需进水的 2 第1 章绪论 c o d 浓度最好保持在1 0 0 0 - 5 0 0 0 m g l 1 之间。较高的进水c o d 浓度可以提高底物向 附着在颗粒污泥表面的细菌细胞的传递速率，促进颗粒污泥的形成和生长。但是不 能通过一味地提高进水c o d 浓度来加快污泥的颗粒化进程。若进水c o d 浓度过高， 会加快污泥中微生物的生长，从而使污泥结构变得松散，沉降性能有所降低：若进 水c o d 浓度过低，则会使污泥颗粒化进程变慢甚至不能颗粒化。 第二，接种污泥。为了加快反应器内污泥的颗粒化进程，人们有时向反应器内 投加一定量的具有产甲烷活性的接种污泥。接种污泥的种类和接种污泥量都对污泥 的颗粒化进程有不同的影响。有研究表明，将颗粒污泥作为接种污泥投加到反应器 中，可以明显缩短污泥颗粒化的时间，而不同的接种量对污泥的颗粒化也会产生影 响。有资料显示，污泥接种量越大，反应器启动的时间越短，但并不是越大越好 当污泥接种体积为2 5 时，污泥颗粒化程度最高、平均粒径最大、粒径分布范围最 广，而当污泥接种体积为5 0 和7 5 时，污泥颗粒化的程度并不是很好，只能形成 少量的颗粒污泥，而且污泥粒径很小。 第三，污泥负荷。污泥负荷率在污泥颗粒化进程中起着至关重要的作用，当污 泥负荷率为0 3k g c o d ( k g v s s 。d ) 左右时，污泥开始颗粒化。众所周知，在培养颗粒 污泥的过程中，污泥负荷率不能一成不变。当污泥负荷率在0 3 0 5 c o d ( k g v s s d ) o 之间时，絮状污泥会争夺颗粒污泥的营养而迅速生长，从而减慢颗粒污泥的生长速 度，所以，一旦反应器内出现了颗粒污泥，应该将反应器的污泥负荷应迅速提高到 o 6 o 7 k g c o d ( k g v s s d ) 之间。 第四，水力负荷率和产气负荷率。要想去除结构松散、沉降性能差的絮状污泥， 获得沉降性能良好的颗粒污泥，可以通过改变水力负荷来获得。要想使絮状污泥与 颗粒污泥完全分开，需要控制反应器内的水力负荷大于0 。2 5 m 3 ( m 2 h ) j 【9 1 。 第五，碱度。碱度也会影响污泥的颗粒化进程，此外，还会对颗粒污泥活性产 生影响。有研究表明，进水碱度越高，污泥颗粒化的进程越快，但是颗粒污泥的产 甲烷活性会越低。因此，在培养颗粒污泥时，初期可以将进水碱度适当提高，达到 加快污泥颗粒化的目的，而到了后期应将进水碱度适当降低，以得到产甲烷活性较 好的颗粒污泥。 第六，环境条件。环境对污泥颗粒化的影响主要是指温度和p h 的影响。就目前 而言，厌氧颗粒污泥均能在常温( 2 0 左右) 、中温( 3 5 左右) 和高温( 5 5 左右) 条件下培养。有资料显示，污泥颗粒化所需的时间与环境温度成反比，因此，为了 更快的形成颗粒污泥，可以适当的使环境保持较高的温度，但温度过高或过低都会 影响污泥的颗粒化。此外，在污泥颗粒化进程中，使系统保持在适宜的p h ( 6 8 7 6 ) 也 是至关重要的。 河北科技大学硕士学位论文 1 2 厌氧颗粒污泥中的主要菌群 厌氧颗粒污泥是一种特殊的活性污泥，是在通过生物法处理有机废水的过程中 产生的由厌氧微生物组成的一种物质。在对废水进行厌氧处理时，厌氧微生物和兼 性好氧微生物等菌群共同作用，可以降解去除废水中的大分子有机物，将其转化为 水、甲烷、二氧化碳、硫化氢等气体，从而使有机废水达到排放标准后排放到河流、 湖泊等水体中。厌氧消化可以处理较高的c o d 浓度，而且对水质条件有一定的抗 冲击负荷，因此，这种处理方法在环境保护中起着至关重要的作用，很多学者也一 直致力于厌氧消化的研究和应用i l o 】。 厌氧消化是一个非常复杂的过程，它是有多种微生物共同作用完成的。目前应 用较多的是m p b 巧锄t 在1 9 7 9 年提出的三阶段理论，即水解发酵阶段、产氢产乙 酸阶段和产甲烷阶段。水解发酵菌、产乙酸菌以及产甲烷菌分别在这三个阶段中发 挥作用，由它们共同参与才能完成有机物的厌氧消化过程。 1 2 1 水解发酵菌 永解碳硝噻恶孺被入称万友酵缅菌繁觅的永解发酵茵 耍为纤藤芬碎百一 果胶分解菌、淀粉分解菌、脂类分解菌和蛋白质分解菌等。 水解发酵菌在厌氧消化的第一阶段发挥作用，不溶性的大分子有机物经胞外水 解酶的作用，将复杂的有机物分解为简单的有机物，复杂的有机物被微生物的胞外 酶分解为小分子化合物后，进入到水解发酵菌的细胞内，并在其中，转化为更为简 单的化合物，水解发酵菌则利用这部分物质合成新的细胞而自生生长。参与此反应 的主要是厌氧菌或兼性厌氧菌。复杂的有机物经水解发酵菌作用后生成的产物可以 分为四类：第一类，是可以被产甲烷菌利用的有机物，即甲酸、甲醇、甲胺、乙酸 等；第二类，是可以被产乙酸菌利用生成乙酸和氢的简单有机物，如有机酸、酵、 酮等：第三类是h 2 和c 0 2 ：第四类是n h 3 和h 2 s 。 1 2 2 产乙酸菌 产乙酸菌在厌氧消化的第二阶段发挥作用。因为产甲烷菌只能利用甲酸、乙酸 和甲醇生成甲烷，而第一阶段中发酵细菌生成的产物并不是只有那些物质，还有一 些产甲烷菌无法利用的有机酸和醇类，所以需要产乙酸菌在这一阶段，将产甲烷菌 无法利用的那些有机酸和醇类转化为乙酸、h 2 和c 0 2 等产甲烷菌可以利用的物质。 1 9 7 9 年，j qz e i l ( 1 1 s 将产乙酸菌进一步划分为产氢产乙酸菌和同型产乙酸菌两类。 产氢产乙酸菌要想将长链脂肪酸降解为产甲烷菌生长所需要的乙酸和氢气，保 证产甲烷菌的生长，需要与耗氢微生物共生。同型产乙酸菌的代谢基质主要有糖类 和二氧化碳。同型产乙酸菌在代谢糖类时，乙酸甚至是唯一的产物；同型产乙酸菌 第1 章绪论 还可以将二氧化碳作为末端电子受体而生成乙酸。此外，同型产乙酸菌对分子氢的 代谢，可以降低厌氧消化系统中的氢分压，为沼气发酵的正常进行提供有力条件。 1 2 3 产甲烷菌 产甲烷茵在厌氧消化的第三阶段发挥作用，是厌氧消化所需要的最后一组成员。 厌氧颗粒污泥中的主要菌群就是产甲烷菌。根据伯杰系统细菌学手册的分类， 产甲烷菌分为5 目j1 0 科、3 l 属【i l t l 2 1 ，5 目分别为产甲烷杆菌目( m e t h 锄o b a c t e r i a l e s ) 、 产甲烷球菌目( m e t h a l l o c o c c a l e s ) 、产甲烷微菌目( m e m 锄o m i c r o b i a l e s ) 、产甲烷八 叠球菌目( m e t h a n o s a r c i n a l e s ) 和产甲烷火菌目( m e m 狮o p y r a l e s ) 。产甲烷菌群结构 及代谢方式均随生态环境的变化而体现出多样性。 产甲烷菌按营养类型分可以分为氢营养型、甲基营养型和乙酸营养型三类。其 中，氢营养型可以利用氢气和二氧化碳生成甲烷，甲基营养型以甲胺和二甲基硫作 为营养物质，乙酸营养型则可以利用乙酸产生甲烷【1 3 1 4 1 。 在严格厌氧及没有外源电子受体的条件下，产甲烷菌可以利用乙酸和h 2 c 0 2 来合成自身物质，并生成甲烷( c h 4 ) 。产甲烷菌世代时间长，且对生长环境要求严 格，因此产甲烷过程成为厌氧消化过程的关键步骤。 1 3 产甲烷菌的研究进展 厌氧消化过程的快慢取决于产甲烷过程，产甲烷菌是严格厌氧菌，对环境敏感， 而且产甲烷菌在厌氧反应器中具有一定的特殊性与重要性，因此，需要对产甲烷菌 进行全面深入的研究。 1 3 1传统的微生物学分析方法 最早对产甲烷菌进行研究时，大多数采用的是对产甲烷菌进行培养等传统的微 生物学方法，同时也会采用显微镜对其形态进行观察，并用选择性培养基对其进行 分离计数。 由于产甲烷菌是一种严格厌氧菌，对它的培养需要在严格厌氧的条件下进行。 早期对产甲烷菌进行培养时，大多数采用的是深层液体培养，并用石蜡密封表面或 放入真空密闭空间中。但这些方法有一定的局限性，而且在技术上也不易实施，因 此，获得的产甲烷菌的种类和数量都只是其中很小的一部分【”j ，无法获得较全面的 产甲烷菌的微生物学信息。 直至h u n g a t e 发明了h u n g a t e 滚管，研究人员通过此项技术对厌氧菌进行分离 纯化培养，对产甲烷菌等严格厌氧菌的研究才能够深层次的开展。但是，传统的微 生物学分析方法对产甲烷菌的分离培养周期长、工作量大，而且培养基的选择对产 5 河北科技大学硕士学位论文 甲烷菌原有的种群结构会产生一定的影响【1 6 】，因此，要想对产甲烷菌进行全面正确 的分析，传统的微生物学分析方法并不能达到要求，这就需要人们开辟另外一条道 路。 1 3 2基于1 6 sr i a 的分子生物学方法 随着分子生物学技术的兴起和发展，越来越多的人们开始采用分子生物学手段 对厌氧颗粒在形成机理、微观结构和微生物群落等方面进行研究1 1 7 】。在研究微生物 群落结构组成方面，分子生物学手段比与传统的分离培养方法相比较，有更多的优 势【】。不同的微生物有不同的核酸分子，序列组成也各不相同，要想对环境样品的 微生物群落结构进行分析，可以从环境样品中提取所有微生物的核酸，根据核酸序 列的差异，对序列的种类和数目进行分析，这样就可以知道环境样品中微生物的种 类以及各种微生物在全部微生物中所占的比例，从而对环境样品中的微生物多样性 及菌群结构有全面、客观的认识。 分子生物学手段主要是以微生物的核酸序列为依据基础，通过对核酸分子种类 和数目的分析比对，反映环境样品的微生物群落结构，以及样品中菌群的种类和数 目【1 9 】。 常用的分子生物学方法主要有聚合酶链式反应( p o l y i l l e r a s ec h a i nr e a c t i o n ， p c r ) ，变性梯度凝胶电泳( d e n a t 嘶n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 技术，基 因克隆文库( g e n ec l o n i n gl i b r a 叫) 技术等。 由于1 6 sr r n a 基因分子结构上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量信 息，使1 6 sr r n a 基因成为了一个较为理想的基因分类靶序列【2 0 1 。1 6 sr r n a 基因存 在于所有细菌的染色体基因组中，可以编码细菌染色体上相应的r i a ，长度大约为 1 5k b ，共包含5 0 个功能域。1 6 sr r n a 基因有高度保守区和可变区，高度保守区的 序列基本不变，而可变区的序列随细菌种类的变化而有所差异，因此，可以利用基 于高度保守区的序列而设计出的引物，从环境样品中的总核酸中扩增出1 6 sr l a 基 因片断，根据可变区的序列差异对微生物进行细分，确定其种属。这种分子生物手 段不仅能区分微生物不同种属之间的差异，还能通过序列测定的方法较轻易地获得 其序列，对序列进行同源性比对分析，可以以此判断微生物的系统发育关系。1 9 9 0 年，r e l m 锄等人首次利用l6 sr l a 的序列构建了种特异性p c r 引物，通过p c r 扩增 及对扩增片段进行d n a 序列测定，鉴定了未知特性的细菌。 1 3 3 基于功能基因的分子生物学方法 环境中某些微生物种类繁多，且分属多个分类学上的不同种属，故不能利用常 规的1 6 sr i a 测序方法对其进行研究。例如，按照传统的分类方法，不能将反硝 6 第1 章绪论 化菌划分为某特定种属。因此，要想对反硝化菌进行研究，需要将编码反硝化酶的 功能基因作为分子标记物对其进行研究。与相对保守的1 6 sr r n a 相比，功能基因 序列更具多样化，生态功能不同但亲缘关系较近的微生物种群，甚至是生态功能相 同但亲缘关系较远的微生物种群，都可以利用功能基因进行区别鉴定1 2 1 1 。随着人们 对功能基因的进一步认识，人们开始将功能基因做为1 6 sr r n a 的替代基因对微生 物进行种群分析。 产甲烷菌体内含有一些可以保证产甲烷过程顺利进行的独特的酶和辅酶，以编 码这些酶和辅酶的功能基因为基础设计引物，采用p c r d g g e 、构建克隆文库等方 法，可以更全面、更准确地获得产甲烷菌群的微生物学信息。到目前为止，已经有 很多人基于朋洲基因对产甲烷菌进行研究，而且其结果与基于1 6 sr i 州a 基因的研 究结果具有非常高的相似性【2 2 之6 1 。由此可以得出，功能基因也可以作为靶基因，对 微生物种群进行分析研究。 m c 叫基因 m c r ( 甲基辅酶m 还原酶) 有三种不同的亚基a 2 9 m ，分子量大 约在3 0 0 k d a 左右【2 7 ，2 引。有研究表明，甲基辅酶m 还原酶由两分子f 4 如和一个有色 辅基组成1 2 9 1 。到目前为止，已经有研究者从产甲烷菌不同的种属中分离纯化得到甲 基辅酶m 还原酶【3 2 1 。甲基辅酶m 还原酶在产甲烷过程的最后一步发挥作用，将 辅酶m 连接的甲基催化还原为甲烷【3 3 】，m c r 是产甲烷过程中的关键酶，且是产甲 烷菌所特有的酶f 3 4 ，3 5 1 。肌删基因可以编码甲基辅酶m 还原酶的a 亚基，在产甲烷 菌中具有普遍存在性，可以将朋c 一基因作为靶基因对产甲烷菌进行系统发育分析 【3 6 】。而且基于朋c 叫基因与基于1 6 sr r n a 基因对产甲烷菌进行研究时，两者的结 果具有高度相似性，因此，朋c 州基因可以代替1 6 sr r n a 作为靶基因对微生物种群 进行分析研究。 ，l f ，基因有研究表明，辅酶m 甲基转移酶有8 个不同的亚基( m t r a h ) ，其 中，m t r a 包含一个咕啉基团，这一基团在催化反应中甲基化和去甲基化。产甲烷菌 在生长过程中需要依赖钠离子【3 7 ，38 1 ，而辅酶m 甲基转移酶在产甲烷过程中就充当了 钠离子泵的作用。到目前为止，已经有人从产甲烷菌中提取出了这种辅酶，并在同 一微生物的醚脂脂质体中再次培养，发现这种辅酶能在细胞膜之间能够传递钠离子 1 3 9 1 。辅酶m 甲基转移酶也是产甲烷菌所特有的辅酶。到目前为止，对辅酶m 甲基 转移酶的性质、结构、催化机理已有一定的研究，但基于m 驴基因对微生物进行研 究仍处于探索阶段。 f 4 2 0 基因有文献报道，辅酶f 4 2 0 在产甲烷菌中普遍。辅酶f 4 2 0 主要是作为氢 化酶系统的电子载体，电子从甲酸盐脱氢酶转移到辅酶f 4 2 0 上，再由氢化酶将电子 传递给质子，生成氢气，或者将电子由n a d p 氧化还原酶直接传递到n a d p 上 河北科技大学硕士学位论文 1 4 生物强化技术 生物强化技术( b i o a u g m 锄t a t i o n ) 是指为提高系统去除污染物的能力，向废水 处理系统或者污染地投加特定功能微生物的一种工艺嗍。生物强化技术产生于2 0 世纪7 0 年代中期，到9 0 年代后期国内才开始对这一技术的研究进行总结【4 。近十 几年来，由于该技术在环境治理及废水生物处理系统中有较快较明显的处理效果， 受到越来越多的研究者的关注。 1 4 1 特定功能微生物的选育 生物强化技术能否顺利实旋关键在于是否能够获得特定功能的微生物。目前， 特定功能微生物的获得有两个途径：从自然界筛选菌种，人为手段构建用于废水处 理的特定功能微生物。 从自然界中筛选从自然环境或者污染地直接筛选时获得特定功能微生物的 一个重要途径，要想使筛选得到的微生物具有较好的生物强化效果，在制定筛选策 略是应考虑一下三方面：当实际废水中目标物浓度很低或有其他有机物影响时，该 菌是否能发挥作用；废水中的其他成分是否对该菌有抑制或毒害作用；该菌能否与 废水处理系统中原油的微生物兼容或竞争生存。因此，在筛选时应模拟实际废水成 分及操作条件或从相似环境中进行筛选。有学者从制革废水处理厂的活性污泥中以 萘二磺酸为唯一碳源得到两株特定功能菌，将其用于皮革废水处理系统的生物强化， 发现这两种菌均能很好的降解萘二磺酸 4 2 1 。 功能菌构建功能菌构建主要是通过人为手段有目的地改变微生物特性，以获 得所需菌种。目前，在废水处理中应用的基因工程菌大多数是通过质粒介导的基因 转移或原生质体融合获得的。 有些质粒本身具有降解功能，有些质粒可以通过基因重组获得降解某种物质的 功能，而且，质粒可以在细胞间自发或人为的发生转移，甚至有些质粒之间存在相 容性。运用质粒的这些特性，将具有某种功能的质粒导入到受体菌中，使其获得此 功能的这种技术就是质粒介导的基因转移。f f i e i l o 【4 3 】等通过质粒转到技术将不同功 能的质粒转移到同一株受体菌中，构建出了能同时降解芳烃、多环芳烃、脂肪烃和 萜烃的菌株。 原生体融合是将双亲株细胞在酶的作用下脱去细胞壁，形成原生质体，在高渗 和助融条件下通过细胞质融合、核融合，使基因得到重组，随后再生出细胞壁来获 得重组子，之后通过筛选获得目标菌株的一种方法( 4 4 1 。此方法的优点是遗传物质传 递完整、育种效率高、定向性好和致育性限制小【蝈。许燕滨【4 6 l 等采用原生质体融合 技术将两株具有降解含氯有机化合物特性的菌融合，构建出一株高效降解含氯有机 8 第l 章绪论 化合物的基因工程菌，投加到造纸漂白废水中，结果显示，融合菌去除c o d 和总氯 的能力比混合菌分别提高7 2 0 5 和1 9 0 。 目前，对基因工程菌的生物强化作用的研究，大多数仍以实验室为主，在实际 工程中的应用还比较少见。造成这种现象的原因主要有：( 1 ) 尚缺乏一个污染物降解 菌种的资源库，对降解菌进行系统育种；( 2 ) 各种污染物降解菌体的降解基因尚无 法精确定位，仍需要做大量的研究工作；( 3 ) 人们还无法充分认识基因工程菌释放到 环境中以后对环境所产生的生态影响，而且，目前除了细胞融合、原生质体融合、 诱变和传统杂交繁殖等技术以外，向环境释放其他基因工程菌的行为需要经过各国 政府的严格审查和批型4 7 1 。 1 4 2 生物强化作用原理 生物强化技术中，投入的菌种与基质的作用方式主要是直接作用和共代谢作用 两种【4 8 】。 1 4 2 1直接作用 直接作用是指将特定功能的微生物投加到生物处理系统后，特定微生物通过自 身的增值和代访 去除目标污染物，以改善系统的处理能力。这种方式最普遍、最具 应用价值。按功能菌投加到处理系统后存在的形式，可分为简单投加、与载体联合 及细胞包埋固定。 简单投加指将特定功能微生物投加到处理系统中后，这些微生物以游离或悬 浮状态存在。这种工艺简单、易于操作，可投加单一微生物，也可投加混合微生物。 简单投加可以明显提高系统对目标污染物的去除能力，增强系统耐负荷冲击能 力，提高系统整体处理能力，还能满足现有处理厂升级及应急的需要。但是这种方 式也有不足，如投加菌种易流失，易被土著微生物吞噬等。这些都会使强化效果不 能稳定保持，需要周期性补充菌种。 与载体联合实现强化指强化菌引入处理系统后附着在载体上，结合载体所形 成阻滞及剪切作用，共同提高系统的整体处理能力。载体不仅可以为微生物的附着 和生存提供支持物，而且形成生物膜后由于膜的附着和截留作用，极大的减少了微 生物的流失，是系统能维持较高的生物量，获得稳定的处理能力，同时，流失菌的 减少，降低了生态风险。与载体联合实现强化的关键在于载体上强化菌的数量。 包埋固定实现强化利用高聚物在形成凝胶时将细胞包埋在其内部的原理实 现这一方法。该方法操作简单，对细胞活性的影响较小，制作的固定化细胞球的强 度较高，目前研究最广由于固定剂形成的微球囊结构对水质、环境条件的变化可 以起到一定的缓冲作用，而且这种微球囊结构不影响营养物质和小分子污染物的进 出，但是可以阻止强化菌的流出和土著微生物的进出，减少了强化菌的流失和被原 9 河北科技大学硕士学位论文 生动物吞噬的可能性，从而提高了系统的处理能力，增强了系统对环境条件变化的 适应性。 1 4 2 2 共代谢作用 微生物的共代谢作用是一种有机物化合物的生物降解过程，这一过程只有在初 级能源物质存在时才能进行。微生物的共代谢作用包括两个方面，能够正常生长代 谢的微生物对非生长基质的共同氧化，以及处于休眠时期的微生物对不可利用基质 的氧化代谢。微生物的共代谢作用可分为三类，一类是为了提高共代谢菌的生理活 性，而以易降解的有机物为碳源和能源；一类是为了提高酶的合成速率，而以目标 污染物的降解产物和前体作为酶的诱导物；还有一类是不同微生物之间的协同作用。 虽然微生物的共代谢作用能够提高难降解有机物的去除效果，但其机理十分复 杂，到目前为止，许多问题仍有待研究。人们对微生物的共代谢作用提出了不同的 假设。 对于微生物在某种基质上无法生长的原因，有人认为，并不是由于微生物不能 对这种基质进行分解代谢，而是由于微生物本身不具有吸收、同化其氧化产物的能 力。有学者认为卤代芳烃化合物的共代谢作用，可能是由微生物不具有从苯环上将 卤素取代基去除，并把芳香环导向碳吸收同化的功能。还有学者把具有氧化代谢卤 代芳烃化合物功能的细菌不能在改基质上生长的原因归结于有毒产物的积累。到目 前为止，学者们提出的各种假设都无法正确解释在实际应用中的共代谢现象。 通过微生物的共代谢作用可以去除很多难降解的有机物。例如在处理焦化废水 的氧化塘中，进水时混合一定量的生活污水，这一举措会提高c o d 的去除效率，其 主要原因就是生活污水中含有丰富的营养元素，加强了微生物的共代谢作用。 1 4 3生物强化技术在废水处理中的应用 1 4 3 1 去除难降解有机物 到目前为止，某些具有降解特定污染物性能的微生物已经成功分离，通过生物 强化技术，将这些微生物投加到处理系统中，不仅可以提高某种特定污染物的去除 效率，还能改善整体的处理效果。 有学者【4 9 j 将喹啉降解菌投加到处理焦化废水的厌氧一缺氧一好氧( a a o ) 系统 中，c o d 的去除率均有所提高。s h i 等【5 0 】将2 4 d c p 降解菌作为生物强化菌，投加到 含有多氯酚的废水中，不仅提高了2 ，4 - d c p 的去除率，同时也使其他多氯酚的去除 效率有所提高，另外，生物强化菌的投加改善了处理系统对有毒物质的抗冲击能力。 随着工业化的发展，产生的废水【5 钉中出现了越来越多的结构复杂的、难降解 的有机物。这些难降解有机物通过普通的生物处理方法根本无法去除，若长期残存 在环境中，会对环境造成污染，还可能会毒害环境中的土著微生物产生，必须通过 1 0 第1 章绪论 某些具有特定降解功能的微生物将其去除。 1 4 3 2 去除过量营养物 随着工农业的发展，氮、磷的排放量越来越高，水体中若氮、磷含量过高，会 引起水体的富营养化。在去除氮、磷的生物处理系统中，可以代谢氮、磷的微生物 生长周期长，而且较难使微生物在系统中保持相对较高的水平。例如，由于硝化细 菌的生长较慢，导致反应器启动时间长、污泥流失量大、抗冲击负荷能力差【5 6 1 。因 此，人们开始将生物强化技术引入到相应的生物处理系统中，提高氮、磷的去除率。 s a l o h 等吲向转盘生物反应器中投加硝化菌，促进了硝化菌的生长，提高了反应 器的启动速率和硝化速率，从而提高了反应器对氮的去除率。h e a d 等【5 8 】对硝化菌投 加到反应器后的脱氮效率进行了研究，结果证实，硝化菌对反应器的生物强化可以 有效提高反应器的脱氮效果。 向传统的活性污泥中投加某种聚磷菌，经过生物强化后，使聚磷菌成为生物处 理系统中的优势菌群，形成了强化生物除磷工艺【5 9 1 ，对磷负荷的冲击具有更强的抵 抗力。 1 4 4 3 维持生物处理系统的稳定性 微生物的生存及代谢活性受到环境中污染物的化学性质及浓度、环境的理化特 征( p h 、氧化还原电位和温度等) 、微生物对污染物的可利用性等多种因素的影响【6 0 1 生物处理系统容易受到各种因素的影响，从而导致系统的不稳定性，甚至导致系统 的全面崩溃。利用生物强化技术可提高有效微生物浓度，减轻各种外界因素对系统 的冲击。 1 5 本课题研究内容与意义 1 5 1研究内容 ( 1 ) 构建产甲烷功能基因克隆文库，分析基因序列信息，并在此基础上探索功能基 因在种属分析中的可行性，并将优势种属与p c r d g g e 结果进行比较。 ( 2 ) 构建产甲烷功能基因工程菌，探索其生物强化提高厌氧颗粒污泥产甲烷活性的 可行性。 1 5 2 研究目的与意义 利用基因克