毕业论文-花椒油抑菌实验研究.doc

本科毕业论文题 目 花椒油抑菌实验研究 学 院 理学院 专 业 应用化学 毕业届别 201 届 姓 名 指导教师 职 称 讲 师 花椒油抑菌实验研究目 录摘要1关键词1Abstract1Key words1前言11 材料与方法21.1 材料、药品及仪器21.2 花椒油的提取 31.2.1 水蒸气蒸馏法31.2.2 回流萃取法 31.3 花椒油抑菌活性测定 31.3.1 花椒油抑制细菌活性测定31.3.2 花椒油抑制真菌活性测定41.4 花椒油最低抑菌浓度(MIC)测定 41.4.1 花椒油最低抑制细菌浓度(MIC)测定 41.4.2 花椒油最低抑制真菌浓度(MIC)测定 41.5 动态测定菌种OD值41.5.1 动态测定细菌OD值41.5.2 动态测定真菌OD值41.6 花椒油抑制真菌孢子萌发的测定 41.7 花椒油抑制真菌形态观察 51.7.1 菌丝的培养 51.7.2 真菌扫描电镜片的制作及观察 52 结果与分析52.1 花椒油抑菌活性测定结果与分析 52.2 花椒油最低抑菌浓度(MIC)112.3 花椒油动态测定菌种OD值 132.4 花椒油抑制真菌孢子萌发结果与分析142.5 花椒油抑制真菌扫描电镜观察结果与分析153 讨论164 结论16参考文献17致谢19花椒油抑菌实验研究(甘肃农业大学理学院应用化学专业)摘要：以3种细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌)、3种真菌(粉红单端孢、互隔交链孢、硫色镰刀菌)为指示菌,采用不同方法提取到的花椒油对该类菌进行抑菌效果研究。结果显示:花椒油对6种指示菌的抑制作用显著,其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、硫色镰刀菌的最低抑菌浓度低至6.25%,对枯草杆菌、粉红单端孢、互隔交链孢最低抑菌浓度低至3.125%。测定孢子萌发发现:花椒油浓度越大，孢子萌发率越小，芽管长度越短。通过扫描电镜观察发现:花椒油对硫色镰刀菌菌丝的生长具有一定的抑制作用,处理菌丝末端变细、断裂,对照菌丝观察不到类似的现象。关键词：花椒油；抑菌；细菌；真菌Research on Antibacterial Experiment of Zanthoxylum OilWang Junchao(Major in Application chemistry in the College of Science of Gansu Agriculture University,Gansu Lanzhou,730070)Abstract: Three bacteria (Escherichia coli, Bacillus subtitles, Staphylococcus aureus); three fungi (Trichothecium roseum, Alternaria alternata, Fusarium sulphureum) to the indicator bacteria, using different methods to extract pepper the oil that type of bacteria to the antibacterial activity. The results showed that pepper oil on the inhibition of the six kinds of indicator bacteria, and its minimum inhibitory concentration for E. coli, Staphylococcus aurous, Sulfur color fusarium as low as 6.25%, Bacillus subtitles, pink trichothecene each other separated The cross-linked bacilli to the minimum inhibitory concentration as low as 3.125%. Determination of spore germination: the greater the concentration of pepper oil, the smaller the rate of spore germination, germ tube length is shorter. Found by scanning electron microscopy, the pepper oil has a certain inhibition of mycelia growth of sulfur-color fusarium processing mycelium end of the thinning, breaking, controlled the mycelium is not observed a similar phenomenon.Key words: Zanthoxylum oil; bacteriostat; Bacteria; Fungi前言食品在贮藏、运输过程中由于微生物污染而引起腐败变质，全世界每年约有10%20%的食品因变质而失去应用价值,而防腐剂具有抑菌和杀菌作用，在食品中添加可提高食品的保藏期,延长货架期。随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，人们对防腐剂的需求越来越向“天然”、“绿色”等理念转变。近年来,大量研究结果表明，一些天然植物及其提取物具有防腐和抑菌的作用。目前,从香辛料、调味品中提取有效抑菌成分是天然防腐剂研究的热点之一，花椒属于芸香科落叶灌木植物，是主要调味品，花椒精油具有一定的防腐抑菌作用,可作为天然食品防腐剂开发利用2-4。本文以花椒精油为研究对象,以大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌三种细菌及粉红单端孢、互隔交链孢、硫色镰刀菌三种真菌为指示菌，通过抑菌试验来研究花椒精油的抑菌效果。该研究为花椒挥发油作为防腐剂开发提供初步理论基础和技术支持。1 材料与方法1.1 材料、药品及仪器1.1.1 材料与试剂干花椒(品种:伏椒,购于兰州市安宁区桃海市场)；牛肉膏、琼脂、蔗糖、戊二醛溶液、无水乙醇、无水硫酸钠、吐温-80、Na2HPO412H2O、NaH2PO4H2O、NaNO3、 MgSO4、KClO、FeSO4均为AR。 1.1.2 菌种 细菌:大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitles)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；真菌:粉红单端孢(Trichothecium roseum)、互隔交链孢(Alternaria alternata)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)。以上菌种均由甘肃农业大学食品科学与工程学院315实验室提供。 1.1.3 仪器 JJ-2型组织捣碎匀浆机(金坛市顺华仪器有限公司)；40目标准筛(浙江上虞市水仙仪器有限公司)；HX-502T型电子天平(慈溪市天东衡器长)；KDM型调温电热套(山东甄城新华电热仪器厂)；AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；THZ-100型恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司、昆山一恒仪器有限公司)；ZQ-X100A恒温培养振荡箱(上海一恒科学仪器有限公司、昆山一恒仪器有限公司)；DHP-9162B型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；SW-CJ-2FD结净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；CX21FS1C型生物显微镜(奥林巴斯(广州)工业有限公司)；722型紫外可见分光光度计(上海精科实业有限公司)。1.2 花椒油的提取选用干燥的花椒果实,用组织捣碎匀浆机粉碎,过40目筛。1.2.1 水蒸气蒸馏法称取花椒粉末30.00g，置于500mL圆底烧瓶中，加200mL蒸馏水与数粒玻璃珠，振荡混合。连接挥发油提取器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。加热至沸腾，并保持微沸3h，停止加热，放置片刻，用胶头滴管将油层吸出放入小瓶中，加入少许无水Na2SO4干燥，4冰箱保存备用5-6。1.2.2 回流萃取法乙酸乙酯萃取的花椒精油:称取花椒粉末30.00g，置于500mL圆底烧瓶中，加100mL乙酸乙酯与数粒玻璃珠，振荡混合后连接回流冷凝管，在80恒温水浴锅中加热回流2h，用减压过滤法滤出提取液。向残渣中再加入80mL乙酸乙酯，重复提取，用减压过滤法滤出提取液。将两次提取液合并，水浴加热浓缩至乙酸乙酯不再蒸出，放入小瓶中，加入少许无水Na2SO4干燥， 4冰箱保存备用7-8。乙醚萃取的精油:将乙酸乙酯换成乙醚，操作方法同1.2.2，恒温水浴温度改为30。1.3 花椒油抑菌活性测定1.3.1 花椒油抑制细菌活性测定配制牛肉膏蛋白胨固体培养基1000mL，将配制好的培养基、培养皿、自来水、移液枪头、直径3mm的滤纸片、纱布、三角瓶、三角耙放入灭菌锅内高压灭菌30分钟，将灭菌后材料转移至超净工作台。将灭菌后的培养基趁热倒入已灭菌干燥的培养皿内，每皿约12mL，将滤纸片分别浸没在水蒸馏提取、乙酸乙酯萃取、乙醚萃取得到的精油中，对照的滤纸片浸没在无菌水、乙酸乙酯、乙醚中10分钟后取出，自然风干，标记备用。取培养好的三种细菌(大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌)，加入5mL无菌水与23滴吐温-80，双层纱布过滤后，涡旋混合均匀，备用。待牛肉膏蛋白胨冷却后，用移液枪向其中滴入100L菌悬液，用三角耙涂布均匀。处理的培养皿放入分别用无菌水、乙酸乙酯、乙醚萃取得到的花椒油中浸泡的滤纸片，对照的培养皿放入分别用无菌水、乙酸乙酯、乙醚浸没的滤纸片，将培养皿标记后，置于37恒温培养。两天后，用十字交叉法测量抑菌圈直径，以平均值代表菌落大小，计算抑菌率。抑菌率(%)=(处理抑菌圈直径-CK直径)/处理抑菌圈直径100%，每个处理平行2次，每次2个重复9-15。1.3.2 花椒油抑制真菌活性测定花椒油抑制真菌(粉红单端孢、互隔交链孢、硫色镰刀菌)活性测定方法同1.3.1，培养基为马铃薯蔗糖培养基(PDA)，培养温度为28，培养时间为5天。5天后，用十字交叉法测量抑菌圈直径，以平均值代表菌落大小，计算抑菌率。1.4 花椒油最低抑菌浓度(MIC)测定1.4.1 花椒油最低抑制细菌浓度(MIC)测定配制牛肉膏蛋白胨液体培养基和0.5mg/mL的MTT(噻唑蓝)显色剂，用无水乙醇对花椒油进行梯度系列二倍稀释(50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.5625%、0.78125%)。将96孔培养板紫外照射10分钟后，每孔加入100L牛肉膏蛋白胨液体培养基、20L菌悬液和20L 0.5mg/mL的MTT，每个浓度设三个平行，最后一列为对照，加入100L无水乙醇。37下恒温培养2448h。观察显色剂颜色变化，记录其最低抑菌浓度。1.4.2 花椒油最低抑制真菌浓度(MIC)测定花椒油最低抑制真菌(粉红单端孢、互隔交链孢、硫色镰刀菌)浓度测定方法同1.4.1，培养基为查氏培养基，培养温度为28。观察显色剂颜色变化，记录其最低抑菌浓度。1.5 动态测定菌种OD值1.5.1 动态测定细菌OD值配置牛肉膏蛋白胨液体培养基，向20mL试管中加入10mL牛肉膏蛋白胨液体培养基， 20L菌悬液和20L花椒油，对照试管中不加花椒油。37恒温培养箱中振荡培养，每隔1天用紫外分光光度计在600nm处测定OD值，每个菌种5个重复。 1.5.2 动态测定真菌OD值动态测定真菌(粉红单端孢、互隔交链孢、硫色镰刀菌)OD值方法同细菌1.5.1，培养基为查氏培养基，培养温度为28，紫外分光光度计测定波长为505nm。1.6 花椒油抑制真菌孢子萌发的测定向150mL三角瓶中加入50mL马铃薯蔗糖液体培养基(PDB培养基)，再滴加水蒸气蒸馏得到的花椒油，使其最终浓度分别为0、200、400、800L/L，然后再加入300L硫色镰刀菌孢子悬浮液。26摇床培养(90r/min)8h后，用电子显微镜(40倍镜下)观察孢子的萌发和芽管长度，计算孢子萌发率17。1.7 花椒油抑制真菌形态观察1.7.1 菌丝的培养向培养皿中倒入约15mL PDA培养基，冷凝后，加入100L菌悬液，用三角耙涂布均匀。将在水蒸气蒸馏得到的花椒油中浸泡的滤纸片贴在涂有菌悬液的培养基上，对照的滤纸片是浸泡在无菌水中，37恒温培养箱中培养5天，每个处理重复3次。1.7.2 扫描电镜的观察配制0.1M 、PH 7.0的PBS溶液，2.5%戊二醛固定液(用PBS溶液稀释)。取1.7.1处理的菌丝块及对照菌丝块(0.4mm0.4mm)若干，在4冰箱中用2.5%戊二醛固定2h，弃去固定液，用0.1M、PH7.0的PBS溶液漂洗3次，每次15min。然后用梯度浓度(50%、70%、80%、90%和95%)的乙醇溶液处理两次，每次20min。再用乙醇与乙酸异戊酯的混合液处理样品30min，纯乙酸异戊酯处理样品1h。用离子溅射金属镀膜法进行抽真空真金镀膜两次，使样品可以导电，最后在m级扫描电镜下观察硫色镰刀菌的形态18-19。2 结果与分析2.1 花椒油抑菌活性测定结果与分析2.1.1 花椒油抑制细菌活性由表1-3可知水蒸气蒸馏、乙醚萃取、乙酸乙酯萃取的花椒油对大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌三种细菌都有较好的抑菌效果，抑菌率都为100%。表明三种方法萃取得到的花椒油对三种指示细菌都有一定的抑菌作用20。由图1可知，显著性差异大小为乙醚水乙酸乙酯，表明乙醚蒸馏制取的花椒油对大肠杆菌抑制效果强于水蒸气蒸馏制取的花椒油，又强于乙酸乙酯蒸馏制取的花椒油。由图2可知，抑菌圈直径显著性差异大小为乙醚乙酸乙酯，水的显著性差异与乙酸乙酯相当，表明乙醚蒸馏萃取得到的花椒油对枯草杆菌抑制效果强于水蒸气蒸馏制取的花椒油和乙酸乙酯蒸馏制取的花椒油后两者抑菌效果无明显差异。由图3可知，抑菌圈直径显著性差异大小为乙醚乙酸乙酯，水的显著性差异介于两者之间或与两者相当，表明乙醚蒸馏制取的花椒油对金黄色葡萄球菌抑制效果强于乙酸乙酯蒸馏制取的花椒油，水蒸气蒸馏制取的花椒油对金黄色葡萄球菌抑制效果介于两者之间或与两者相当21。综合上述三点可知乙醚蒸馏制取的花椒油对细菌的抑制效果更强。表1 花椒挥发油对大肠杆菌抑菌圈花椒油制备方法项目抑菌圈直径/mm平均抑菌圈直径/mm抑菌率水蒸气蒸馏CK-0-花椒油+12.8+13.8100%+14.8乙醚蒸馏CK-0-花椒油+22.6+23.0100%+23.4乙酸乙酯蒸馏CK-0-花椒油+10.1+9.8+10.0100%注：“-”表示无抑菌圈；“+”表示有抑菌圈；“+”后数字表示抑菌圈直径/cm；抑菌率(%)=(处理抑菌圈直径-CK直径)/处理抑菌圈直径*100%abc图1 花椒油对大肠杆菌抑菌圈直经表2 花椒挥发油对枯草杆菌抑菌圈花椒油制备方法项目抑菌圈直径/mm平均抑菌圈直径/mm抑菌率水蒸气蒸馏CK-0-花椒油+12.8+11.6100%+10.3乙醚蒸馏CK-0-花椒油+20.6+19.9100%+19.1乙酸乙酯蒸馏CK-0-花椒油+15.8+13.8+14.8100%ab b图2 花椒油对枯草杆菌抑菌圈直径表3 花椒挥发油对金黄色葡萄球菌抑菌圈花椒油制备方法项目抑菌圈直径/mm平均抑菌圈直径/mm抑菌率水蒸气蒸馏CK-0-花椒油+14.8+15.3100%+15.8乙醚蒸馏CK-0-花椒油+17.8+21.8100%+25.8乙酸乙酯蒸馏CK-0-花椒油+9.5+10.9+10.2100%baba图3 花椒油对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径图46是不同方式制取的花椒油对细菌的抑菌效果图ABCCBACAB 图4 花椒油对大肠杆菌抑菌效果图 图5 花椒油对枯草杆菌抑菌效果图 图6 花椒油对金黄色葡萄球菌抑菌效果图注：“A”、“B”、“C”分别表示水蒸气蒸馏、乙醚蒸馏、乙酸乙酯蒸馏制取的花椒油处理。2.1.2 花椒油抑制真菌活性由表46可知水蒸气蒸馏、乙醚蒸馏、乙酸乙酯蒸馏制取的花椒油对粉红单端孢、互隔交链孢、硫色镰刀菌三种真菌都有抑菌圈产生。水蒸汽蒸馏制取的花椒油对粉红单端孢，乙醚、乙酸乙酯制取的花椒油对硫色镰刀菌对照组有抑菌圈产生。表明三种方式制取的花椒油对三种指示真菌都有一定的抑菌作用，但抑菌效果不稳定。由图7可知，显著性差异大小为乙醚乙酸乙酯，水的显著性差异介于两者之间或与两者相当，表明乙醚蒸馏制取的花椒油对粉红单端孢抑制效果强于乙酸乙酯蒸馏制取的花椒油，水蒸气蒸馏制取的花椒油对粉红单端孢抑制效果介于两者间或与两者相当。由图8可知，抑菌圈直径显著性差异大小为乙醚乙酸乙酯水，表明乙醚蒸馏制取的花椒油对互隔交链孢的抑制效果与乙酸乙酯蒸馏制取的花椒油相当，强于水蒸气蒸馏制取的花椒油。由图9可知,抑菌圈直径显著性差异大小为乙醚乙酸乙酯，水的显著性差异介于两者之间或与两者相当，表明乙醚蒸馏制取的花椒油对硫色镰刀菌抑制效果强于乙酸乙酯蒸馏制取的花椒油，水蒸气蒸馏制取的花椒油对硫色镰刀菌抑制效果介于两者之间或与两者相当。综合上述三点可知乙醚蒸馏制取的花椒油对真菌的抑制效果更强。表4 花椒精油对粉红单端孢抑菌圈花椒油制备方法项目抑菌圈直径/mm平均抑菌圈直径/mm抑菌率水蒸气蒸馏CK-+4.3+8.5花椒油+9.0+10.558.68%+12.0乙醚蒸馏CK-0-花椒油+21.5+19.0100%+16.5乙酸乙酯蒸馏CK-0-花椒油+9.0-+4.5100%注：“-”表示无抑菌圈；“+”表示有抑菌圈；“+”后数字表示抑菌圈直径/cm；抑菌率(%)=(处理抑菌圈直径-CK直径)/处理抑菌圈直径*100%baA b图7 花椒油对粉红单端孢抑菌圈直径表5 花椒精油对互隔交链孢抑菌圈花椒油制备方法项目抑菌圈直径/mm平均抑菌圈直径/mm抑菌率水蒸气蒸馏CK-0-花椒油-+5.3100%+10.5乙醚蒸馏CK-0-花椒油+12.5+11.8100%+11.0乙酸乙酯蒸馏CK-0-花椒油+11.0+11.5+11.3100%aab图8 花椒油对互隔交链孢抑菌圈直径表6 花椒精油对硫色镰刀菌抑菌圈花椒油制备方法项目抑菌圈直径/mm平均抑菌圈直径/mm抑菌率水蒸气蒸馏CK-0-花椒油+11.0+11.3100%+11.5乙醚蒸馏CK+8.0+8.0+8.0花椒油+27.5+29.372.7%+31.0乙酸乙酯蒸馏CK+7.5+8.3+9.0花椒油+17.5+8.3+12.935.7%abba图9 花椒油对硫色镰刀菌抑菌圈直径图1012是不同方式制取的花椒油对细菌的抑菌效果图CAACBACBB 图10 花椒油对粉红单端孢抑菌效果图 图11 花椒油对互隔交链孢抑菌效果图 图12 花椒油对硫色镰刀菌抑菌效果图注：“A”、“B”、“C”分别表示水蒸气蒸馏、乙醚蒸馏、乙酸乙酯蒸馏制取的花椒油处理。2.2 花椒油最低抑菌浓度(MIC) 2.2.1 花椒油最低抑制细菌浓度(MIC)死细胞产生的一种物质可以使MTT显色剂由黄色变为一种蓝紫色物质，颜色越深表明死细胞越多。由表7可知在花椒油浓度为6.25%100%范围内三种细菌生长完全被抑制。花椒油对大肠杆菌的MIC为6.25%，枯草杆菌的MIC为3.125%，金黄色葡萄球菌的MIC为6.25%9。表7 花椒油最低抑菌浓度MIC(细菌)花椒油浓度细菌菌种序号100%50% 25% 12.5%6.25%3.125%1.5625%0.78125%大肠杆菌1BBBBB-2BBBBBB-3BBBBBB-4-枯草杆菌5BBBBBB-6BBBBBB-7BBBBBB-8-金黄色葡萄球菌9BBBBB-10BBBBB-11BBBBB-12-注：“B”表示颜色显蓝色；“-”表示颜色无变化。由图13可知,一定范围同浓度下，花椒油对枯草杆菌的抑制效果强于对大肠杆菌的抑制效果，又强于对金黄色葡萄球菌的抑制效果。图13 花椒油对细菌抑菌浓度2.2.2 花椒精油最低抑制真菌浓度(MIC)由表8可知在花椒油浓度为6.25%100%范围内三种真菌生长完全被抑制，且花椒油浓度越大对真菌的抑制作用越强。花椒油对粉红单端孢的MIC为3.125%，对互隔交链孢的MIC为3.125%，对硫色镰刀菌的MIC为6.25%。表8 花椒油最低抑菌浓度MIC(真菌)花椒油浓度真菌菌种序号100%50%25%12.5%6.25%3.125%1.5625%0.78125%粉红单端孢1VVVBBB-2VVVBBB-3VVVVBB-4-互隔交链孢5VVVVBBB-6VVVVBBB-7VVVVBB-8-硫色镰刀菌9VVVVBB-10VVVVBB-11VVVVB-12-注：“V”表示颜色显紫色；“B”表示颜色显蓝色；“-”表示颜色无变化。由图14可知，一定范围同浓度下，花椒油对互隔交链孢的抑制效果强于对粉红单端孢的抑制效果，又强于对硫色镰刀菌的抑制效果。图14 花椒油对细菌抑菌浓度2.3 花椒油动态测定菌种OD值结果与分析2.3.1 花椒油动态测定细菌OD值 有研究表明，细菌的OD值在0.21范围时可以作为测量细菌浓度的有效指标，细菌菌液的吸光度与菌液浓度成正相关，即OD值越大表明细菌增值越多。由表10可知随着培养时间的延长，细菌的增殖量越多。由图15可知随着培养天数增加细菌OD值增大趋势变化不大，表明花椒油对细菌的抑制作用不明显.表10 花椒油对细菌动态OD值培养天数大肠杆菌枯草杆菌金黄色葡萄球菌10.2590.2970.29820.3980.4030.39730.5690.6190.41640.7300.6350.51050.8830.8430.637图15 花椒油对细菌动态OD值2.3.2 花椒油动态测定细真菌OD值 有研究表明，真菌孢子数与其对应的OD值有极显著的直线回归关系，即OD值越大表明细菌增值越多。由表11可知随着培养时间的延长，细菌的增殖量越多。由图16可知随着培养天数增加真菌OD值增大趋势放缓，表明花椒油对真菌有明显的抑制作用。表11 花椒油对真菌动态OD值培养天数粉红单端孢互隔交链孢硫色镰刀菌10.1130.5160.16520.3740.5600.23330.4480.6310.61240.4680.7550.70550.5700.9010.783图16 花椒油对真菌动态OD值2.4 花椒油抑制真菌孢子萌发结果与分析由表12可知，随着培养液中花椒油浓度的增大，孢子萌发率在降低，当花椒油浓度由200L/L增大为400L/L时，孢子萌发率成指数降低。表明在一定浓度范围，花椒油对硫色镰刀菌有抑制作用，花椒油浓度达到800L/L能完全抑制硫色镰刀菌生长24。表12 花椒油作用硫色镰刀菌孢子萌发率培养基中花椒油浓度孢子总数/个萌发孢子数/个孢子萌发率平均孢子萌发率022421495.93%96.84%21020698.10%20019396.50%200L/L24020384.58%83.94%20417686.27%22618380.97%400L/L204 2110.29% 9.35%248 23 9.27%200 17 8.50%800L/L232 4 1.72% 2.03%210 5 2.38%200 4 2.00% 由图17可知花椒油浓度越大硫色镰刀菌菌丝越短、形态越小,表明花椒油浓度增大对硫色镰刀菌的抑制作用有利。L=187mL=170m40404040L=4309mL=1709mL=265mL=295mL=211m800L/L0200L/L400L/L 图17 各浓度花椒油处理下硫色镰刀菌形态2.5 花椒油抑制真菌抑菌扫描电镜观察结果与分析由图18可观察到:硫色镰刀菌菌丝呈圆柱状堆积排列，立体感较强，多数菌丝表面较光滑，粗细不均匀，节点连接处较细。对照组菌丝较长，无可见节点，菌丝的电子密度较低且分布均匀，反差明显；花椒油处理的菌丝粗细不均匀，节点连接处较细，且节点多，一部分发生了断裂，多数菌丝的电子密度较高且不一致，反差不明显25。表明花椒油对硫色镰刀菌有明显的抑制作用。CK花椒油CK花椒油 CK花椒油CK花椒油 图18 硫色镰刀菌扫描电镜形态3 讨论3.1 不同方法萃取的花椒油抑菌效果 乙醚萃取得到的花椒油对细菌与真菌的抑制效果强于乙酸乙酯萃取和水蒸气蒸馏法得到的花椒油，后两种方法抑菌效果相差不大。考虑到花椒油作为防腐剂应用食品工业、推荐采用水蒸气蒸馏法萃取得到的花椒油。 3.2 花椒油对细菌和真菌的最低抑菌浓度对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、硫色镰刀菌可选用浓度不低于6.25%的花椒油抑制其增值，对枯草杆菌、粉红单端孢、互隔交链孢可选用浓度不低于3.125%的花椒油抑制其繁殖。3.3 花椒油对细菌和真菌动态OD值的影响 通过对花椒油处理的不同培养天数细菌和真菌的OD值的测定，发现随着培养天数增加，其OD值增大，即菌的增殖量持续增加。随着培养天数增加细菌OD值增大趋势变化不大，说明花椒油对细菌的抑制作用不太明显；真菌OD值增大趋势放缓，说明花椒油对真菌有明显的抑制作用。3.4 花椒油抑菌效果通过花椒油对硫色镰刀菌的孢子萌发和芽管伸长及菌丝生长的影响， 发现随着花椒油浓度的增大， 孢子的萌发率在降低， 芽管的长度在缩短。纯花椒精油处理过的菌丝形态发生了一定的改变，菌丝末端出现了节点，有一些发生了断裂。这说明花椒油对硫色镰刀菌的生长具有一定的抑制作用。 4 结论（1）通过不同方法萃取得到的精油进行抑菌实验发现，乙醚萃取得到的精油抑菌效果最强，考虑到花椒油作为防腐剂应用于食品工业，推荐采用水蒸气蒸馏法萃取得到的花椒油； （2）花椒油的最低抑菌浓度：枯草杆菌、粉红单端孢、互隔交链孢的MIC为3.125%，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、硫色镰刀菌的MIC为6.25% 。（3）随着培养时间的延长，细菌OD值增加的速度无变化，表明花椒油对真菌的抑制作用表现为：随着时间的延长，抑菌作用不变；真菌OD值增加的速度在减缓，表明花椒油对真菌的抑制作用表现为：随着时间的延长，抑菌作用在增强。（4）通过不同浓度花椒精油（水蒸气蒸馏得到）对F.sulphuruem 孢子萌发和芽管伸长的研究发现：随着花椒精油浓度的增大，其抑菌效果越显著，纯花椒精油在在测定时间内完全抑制了孢子的萌发。表明花椒油对F.sulphuruem抑菌效果良好。（5）通过扫描电镜观察花椒油处理过和未被处理的F.sulphuruem的菌丝发现：对照菌丝较长，无可见节点，菌丝的电子密度较低且分布均匀，反差明显；处理的菌丝粗细不均匀，节点连接处较细，且节点多，一部分发生了断裂，多数菌丝的电子密度较高且不一致，反差不明显。表明花椒油对F.sulphuruem有明显的抑制作用。由此证明水蒸气蒸馏制取的花椒油适合作为一种新型的天然防腐剂抑菌剂进行开发利用。参考文献1 钱骅, 赵伯涛, 夏劲, 等. 九种精油的抗菌活性及其防腐特性研究J. 中国调味品, 2010(4):69-72.2 徐坤. 花椒有抑菌效果探讨J. 中国调味品, 2011(5):25-31.3 崔俊, 李梦楼. 花椒开发利用研究进展J. 林业科技开发, 2008, 22(2):9-14.4 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