dna损伤修复与抗肿瘤药物研究.ppt

冯冰虹教授,DNA损伤修复与抗肿瘤药物研究,2,基因突变（genemutation）:在生物进化过程中，由于生物体内外环境多种因素的影响，使遗传物质的结构改变而引起遗传信息的改变，均可称为突变。从分子水平来看，突变主要表现为DNA分子上碱基的改变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤（DNAdamage）。,突变的意义,3,（一）突变是进化、分化的分子基础。（二）只有基因型改变，而无可察觉表型改变的突变（基因多态性：用于描述个体之间的基因型差别现象）。（三）致死性的突变（利用此特性消灭有害病原体）。（四）突变是某些疾病的发病基础。,4,第一节DNA损伤的因素和类型,一、引起DNA损伤的因素,5,自发突变：频率：10-9,诱变因素,病毒等,DNA损伤的后果,6,（一）DNA的自发性损伤,7,1、DNA的复制错误,（二）环境造成的DNA损伤,8,1、紫外线引起的DNA损伤,胸腺嘧啶二聚体DNA之间交联DNA与蛋白质交联DNA链断裂,9,2、电离辐射引起DNA损伤,10,3、烷化剂引起DNA损伤,11,4、碱基类似物、修饰剂引起碱基对的改变,（1）碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物,5-氟尿嘧啶（5-FU）、5-溴尿嘧啶（5-BU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）。,（2）某些化学物质能专一修饰DNA链上碱基,亚硝酸盐：使C脱氨变成U，经复制使G-CA-T羟胺：使T脱甲基变成C，结果A-TG-C黄曲霉素B：专一攻击DNA上碱基，导致序列变化,这些均为诱发突变的化学诱变剂或致癌剂,二、DNA损伤的类型,12,单点突变、多点突变转换、颠换,链内共价交联链间共价交联,电离辐射、某些化学试剂使链内磷酸二酯键断裂,单个碱基、多个碱基、一段序列的插入或缺失,DNA分子内发生较大片段的交换。,1.碱基和糖基破坏,损伤因素,酸、热去嘌呤作用、碱基修饰剂、自由基、活性氧、紫外线,损伤类型,碱基丢失/插入、碱基置换、DNA片段缺失/插入,13,2.错配,损伤因素,碱基类似物、碱基修饰剂、自发脱氨基,常见错配类型,UT,14,3.DNA链断裂,损伤因素,电离辐射、化学物质诱导,损伤类型,单链断裂、双链断裂（最严重损伤，不能原位修复，易致畸),15,4.DNA交联,化学物质诱导(如丝裂霉素),损伤因素,损伤类型,链内交联同一DNA链上碱基共价结合嘧啶二聚体DNA链上相邻的两个嘧啶碱基之间共价结合，形式有TT、CT、CC,链间交联,不同DNA链之间的碱基共价结合,DNA-蛋白质交联,DNA与蛋白质以共价键结合,16,DNA交联示意图,17,第二节DNA损伤的修复的机制,18,常见的DNA损伤及其修复机制,19,修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复(lightrepairing)切除修复(excisionrepairing)重组修复(recombinationrepairing)SOS修复错配修复,修复的主要类型,一、DNA损伤的修复的概念和类型,20,二、DNA损伤的修复的机制,光复活酶与DNA链上嘧啶二聚体部位结合受波长为260-380nm的近紫外线作用激活使二聚体解聚酶从DNA链上解离，DNA恢复正常结构,（一）回复修复,酶学光复活,21,光修复酶(photolyase),UV,22,23,嘌呤直接插入O6-甲基鸟嘌呤-DNA的甲基转移单链重接（单链断裂修复）,24,2019/12/12,25,25,（二）切除修复,定义,在多种酶的作用下，先将损伤区域切除，然后利用互补链为模板，合成一段正确配对的碱基顺序来修补,切除过程,切除方式,碱基切除修复、核苷酸切除修复,识别并切除修复合成并连接,26,2.1碱基切除修复（base-excisionrepair,BER）,所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能特异性切除受损核苷酸上的N-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点（AP位点）。,27,DNA分子中一旦产生了AP位点，AP核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链碱基切除修复(base-excisionrepair)。,28,.糖甘水解酶识别改变了的碱基，把碱基从N-糖苷键处切下来，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。,29,由AP磷酸内切酶将受损核甘酸的糖苷-磷酸键切开,5,3,30,DNA连接酶连接,利用DNA聚合酶I在切除损伤部位，补上核苷酸,31,2019/12/12,32,32,核苷酸切除,被切除的不是单个碱基，而是一段寡核苷酸。是细胞内更为重要的一种修复方式,切除修复的特点,是DNA修复的一种普遍形式,33,2.2核苷酸切除修复（Nucleotideexcisionrepair,NER）,是机体正常细胞针对DNA链上较大损伤的修复过程，它由多种DNA修复酶组成。,34,2.2核苷酸切除修复（Nucleotideexcisionrepair,NER）,损伤发生后，首先由DNA切割酶(excinuclease)在己损伤的核苷酸5和3位分别切开磷酸糖苷键，产生一个由1213个核苷酸(原核生物)或2729个核苷酸(人类或其他高等真核生物)的小片段，移去小片段后由DNA聚合酶(原核)或（真核)合成新的片段，并由DNA连接酶完成修复中的最后一道工序。,35,识别损伤部位,损伤的两边切除几个核苷酸,DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链,DNA连接酶将切口补平,36,（三）重组修复,定义,重组酶系将未受损伤的DNA片段移到损伤部位，提供正确的模板，进行修复,分类,同源性重组,两段双链DNA同源性大于200bp，大肠杆菌及酵母中RecA蛋白、人细胞中Rad51是关键,非同源性重组,同源性低，DNA双链断裂的主要修复方式，关键分子是DNA-PK及XRCC4，非精确修复,37,2019/12/12,38,38,复制中出现损伤,重组修复,DNA聚合酶填补缺损,39,2019/12/12,40,40,（四）错配修复（mismatchrepair，MMR）,DNA错配修复是细胞复制后的一种修复机制,具有维持DNA复制保真度,控制基因变异的作用。错配修复实际上是一种特殊的核苷酸切除修复，它专门用来修复在DNA复制中出现的新合成DNA链上的错配的碱基。但如何避免将DNA链上正确的碱基切除呢？这就需要将oldstrand和newstrand区分开来。,41,原核生物利用甲基化区分oldstrand和newstrand，因此原核细胞中的错配修复也称甲基化指导的错配修复（methyl-directedmismatchrepair）。,42,错配修复系统识别母链靠Dam甲基化酶（Dammethylase），它能使位于5GATC序列中A的N6位甲基化。一旦复制叉通过复制起始位点，母链就会在开始DNA合成前的一小点时间（几秒钟至几分钟）内被甲基化。刚合成的DNA新链上的GATC序列还没有来得及甲基化，而作为模板的oldstrand早已被甲基化了，利用这种差别区分oldstrand和newstrand。,43,此后，一旦发现错配碱基，错配修复系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA链即将未甲基化的链切除，并以甲基化的链为模板进行修复合成。GATC中A甲基化与否常用来区别新合成的链（未甲基化）和模板链（甲基化）。这一区别很重要,44,错配修复（mismatchrepair）,Dam甲基化酶使母链位于5GATC序列中腺苷酸甲基化甲基化紧随在DNA复制之后进行根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基通过3个蛋白质（MutS、MutH和MutL）校正,45,根据母链甲基化原则找出错配碱基的示意图,1.MutS发现错配碱基,2.在水解ATP的作用下，MutS，MutL与碱基错配点的DNA双链结合,3.MutS-MutL在DNA双链上移动，发现甲基化DNA后由MutH切开非甲基化的子链,46,甲基化指导的错配修复示意图,错配碱基位于切口3下游端，,错配碱基位于切口5上游端，,47,（五）SOS修复,定义,DNA损伤时应急产生的修复作用，解除修复系统抑制，使其产物(多种修复蛋白)参与修复,48,SOS修复中LexA-RecA操纵子的作用机理,49,当细菌DNA遭到破坏时，细菌细胞内会启动一个被称为SOS的诱导型DNA修复系统。在正常情况下，DNA损伤的修复基因的操纵子被LexA蛋白所阻遏。SOS修复系统受到LexA阻遏蛋白的抑制，平时该蛋白表达水平很低。SOS体系的诱导表达过程其实就是LexA阻遏蛋白从这个基因的上游调控区移开的过程。,阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答,50,当有紫外线照射时，细菌体内的RecA蛋白水解酶被激活，催化LexA阻遏蛋白裂解失活，从而导致与DNA损伤修复有关的基因表达。RecA蛋白：是SOS反应的最初的发动因子。在单链DNA和ATP存在时，RecA蛋白被激活，表现出水解酶活性，分解LexA阻遏物。,51,表达RecA蛋白与这些缺口处单链DNA相结合，被激活成蛋白酶。具有蛋白酶活性的RecA蛋白将LexA蛋白切割成没有阻遏作用的和具有与操纵区DNA结合活性的两个片段，导致SOS体系的高效表达，使DNA得以修复。,52,SOS反应,紫外线,与DNA损伤修复有关的酶和蛋白质,DNA,53,当修复完成后，活化信号消失，RecA蛋白回复到非蛋白水解酶的形式，LexA蛋白开始逐步积累，并重新建立起阻遏。RecA蛋白的合成停止，DNA恢复复制，RecA蛋白被稀释到原来的本底水平。,54,三、DNA修复的细胞周期检查点控制,真核生物细胞DNA受到损伤时细胞除了诱导修复基因的转录外，还可暂时阻断细胞周期，防止受损DNA继续复制，如无法修复，则可诱导细胞进入凋亡。这些都是细胞通过细胞周期检查点控制（checkpointcontrol，又称关卡控制）对DNA损伤的应答反应。,55,酵母细胞的细胞周期检查点控制机制,56,哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制,57,四、DNA损伤应答的研究进展,（一）乙酰转移酶Tip60在DNA损伤应答中作用的研究进展Tip60(Tatinteractiveprotein)是进化上极为保守的乙酰转移酶，它在细胞周期阻滞、凋亡、DNA损伤修复等众多生理学过程中都发挥着重要的作用。作为许多转录因子的共调节因子，Tip60既可以激活也可以抑制特定基因的转录。当发生DNA损伤时，它被招募到损伤位点，参与DNA损伤应答的感受、信号转导和修复过程中。除此之外，Tip60还与许多病理过程有关，尤其是在肿瘤发生中起着关键作用。,58,Tip60可以p53依赖和不依赖两种方式参与DNA损伤应答：,59,（二）调控DNA损伤修复基因的miRNA,60,61,62,第三节DNA损伤和修复的基因,63,一、甲基化损伤修复相关基因,甲基转移酶（MGMT）把O6-甲基鸟嘌呤的甲基转移到自身的半胱氨酸残基上，修复甲基化的DNA。MGMT突变可作为甲基化损伤的基因型标记物。,64,二、切除修复相关的酶和基因,尿嘧啶糖基化酶为主要的始动因素，可作为DNA损伤的生物标记物。大肠杆菌Uvr基因家族、人ecrr基因和切除修复基因等,65,三、错配修复相关基因,MSH2、MLH1等蛋白参与错配修复，而错配修复的缺陷往往是癌变的第一步。错配修复基因：Muthls系统、人类的hmsh2/3、hpmsl1/2、Mutsa、msh6。错配修复基因的微卫星序列的不稳定性（microsatelliteinstability，MI）,66,四、DNA聚合酶,DNA聚合酶参与辐射损伤和化学损伤的修复，并对细胞的生长具有调节作用。DNA聚合酶的突变可导致碱基切除修复功能的缺陷。,67,五、DNA加合物,英文名称：DNAadduct定义：DNA分子与化学诱变剂间反应形成的一种共价结合的产物。这种结合激活了DNA的修复过程。如果这种修复不是发生在DNA复制前，会导致核苷酸的替代、缺失和染色体的重排。DNA加合物可作为DNA损伤的暴露标记物和效应标记物，其去除的速度也可作为DNA修复功能的生物标记物。,68,DNA损伤和修复的生物学意义,避免基因组的不稳定性、癌症和细胞死亡是至关重要的。DNA修复途径可以识别和修复特异的DNA损伤，保证生物物种的遗传稳定性。,69,第四节与DNA修复有关的人类遗传疾病,着色性干皮病(Xerodermapigmentosum)布伦氏症候群(Bloomssyndrome)遗传性大肠癌(Hereditarynonpolyposiscoloncancer；HNPCC),70,71,着色性干皮病(Xerodermapigmentosum),是一种隐性遗传性疾病，有些呈性联遗传。因核酸内切酶异常造成DNA修复障碍所致。临床以光暴露部位色素增加和角化及癌变为特征。1.幼年发病，常有家族发病史。2.面部等暴露部位出现红斑、褐色斑点及斑片，伴毛细血管扩张，间有色素脱失斑和萎缩或疤痕。皮肤干燥。数年内发生基底细胞癌、鳞癌及恶性黑素瘤。3.皮肤和眼对日光敏感。4.病情随年龄逐渐加重，多数患者于20岁前因恶性肿瘤而死亡。5.组织病理晚期出现表皮非典型性增生、日光角化及鳞癌和基底细胞癌等恶性肿瘤。,72,着色性干皮病患儿脸部特征,73,着色性干皮病背部,着色性干皮病组织切片,74,着色性干皮病的并发症,75,着色性干皮病的治疗,避免紫外线照射避免肿瘤致病因子对症治疗,76,遗传性大肠癌的临床特征,发病早(45岁)肿瘤好发部位肠外肿瘤的