（细胞生物学专业论文）mmp2对人源黑色素瘤a375细胞粘附和迁移影响的研究.pdf

i ，： 0 j i j 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究 工作所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人 承担。 学位论文作者签名： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其它复制手段保存、汇编本学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：丛尘 1， 日 期：型丝：么：箩 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：链 日 期：丝：笸：芒 点z 爪厶 电话：应型蝉驴 邮编：z 享口2a 墨 ti_一1 互 j 摘要 恶性黑色素瘤因具有高度迁移性和致死性而被人们熟知。明胶酶，即基质金属蛋白 酶2 ( m m p - 2 ) 和基质金属蛋白酶9 ( m m p - 9 ) ，在黑色素瘤迁移过程中参与基底膜降解和 细胞外基质重构，与肿瘤恶性化程度密切相关。明胶酶不仅参与胞外基质与基底膜重构， 在血管发生、侵润和迁移等肿瘤发生过程中发挥了重要作用。随着对明胶酶研究的深入， 人们发现明胶酶不仅由肿瘤细胞分泌并且可以由基质细胞分泌，不仅能与细胞外基质蛋 白相互作用，而且能与包括整合素在内的多种非基质蛋白相互作用。 在黑色素瘤中，整合素a v e 3 ( i n t e g r i n ) 是一类重要的异二聚体跨膜糖蛋白，能 够与含有r g d 片段的配体结合，通过这种结合a v p 3 可以介导细胞外配体与胞内骨架蛋 白和各种信号途径间的信号传递。然而，整合素a v e 3 与m m p 一2 间的识别是通过m m p 一2 羧基端的p e x 区而非r g d 区，对于删p 一2 是否能通过与a v e 3 的这种结合而发挥一定的 信号传递作用目前还没有报道。 在本研究中，我们首先利用明胶酶谱法对a 3 7 5 细胞中明胶酶的表达进行了检测， 证实在人源黑色素瘤a 3 7 5 细胞中删p 一2 和m m p - 9 均有所表达。通过使用m m p 广谱抑制 剂对a 3 7 5 细胞铺展和迁移进行观察发现，m m p 一2 对a 3 7 5 细胞的影响比较显著。通过对 a 3 7 5 细胞铺展过程中删p 一2 和f - a c t i n 进行免疫荧光标记，发现删p 一2 与肌动蛋白细 胞骨架的变化有一定相关性。同时，免疫荧光标记观察发现删p 2 和整合素a v e 3 在a 3 7 5 细胞悬浮、铺展和迁移三种状态下均有共定位现象。通过静止粘附实验我们证实， m m p 2 能够影响整合素a v e 3 与其配体的结合能力。这些结果表明，m m p 一2 在a 3 7 5 中 可能通过整合素a v e 3 而发挥某些信号作用从而影响肿瘤细胞的发展。 关键字：基质金属蛋白酶2 ；明胶酶；黑色素瘤；整合素a v e 3 1 i - i a b s t r a c t m a l i g n a n tm e l a n o m a sa r en o t o r i o u sf i wt 1 1 e i rt e n d e n c yt om e t a s t a s i z e g e l a t i n a s e s a l s o k n o w na st h em a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s ( m m p ) 一2a n d 9 ，h a v eb e e nl o n gr e c o g n i z e dr e l a t e dt o t h em a l i g n a n c yo fm e l a n o m aa s m a j o rc o n t r i b u t o r st ot h ee s s e n t i a ls t e p si nm e l a n o m a p r o g r e s s i o n ，t h ed e g r a d a t i o no fb a s e m e n tm e m b r a n e sa n dr e m o d e l i n go ft h ee x t r a c e l l u l a r m a x t r i x ( e c m ) b e s i d e s ，g e l a t i n a s e sh a v ea l s ob e e ni d e n t i f i e da si m p o r t a n tp r o t e o l y t i c e x e c u t o r sa n d r e g u l a t o r s i nv a r i o u s p h y s i o l o g i c a l a n d p a t h o l o g i c a l s t a t e s i n c l u d i n g a n g a o g e n e s l s , t u m o ri n v a s i o na n dm i g r a t i o n a c c o r d i n gt or e c e n tr e s e a r c h e s ，t h eg e l a t i n a s e s a r en o to n l ye x p r e s s e di nt u m o rc e l l sb u ta l s oi ns t r o m a lc e l l s ，a n dt h e yh a v eb e e ns h o w nt o i n t e r a c tw i t hab r o a dr a n g eo f n o n - m a t r i x p r o t e i n si n c l u d i n gi n t e g r i n sb e s i d e sp r o t e i n si ne c m i nm i g r a t i n gm e l a n o m a ，i n t e g r i na v l 3 3i st h em a i nt r a n s m e m b r a n er e c e p t o rt h a tb i n d s t or g d - c o n t a i n i n gl i g a n d st op r o v i d ed y n a m i ci n t e r a c t i o n sb e t w e e ne x t r a c e l l u l a rl i g a n d sa n da c t i n c y t o s k e l e t o na n ds i g n a l l i n gm a c h i n e r i e s h o w e v e r , t h er e c o g n i t i o nb e t w e e nm m p 2a n d i n t e g r i na v l 3 3i sn o tt h er g db u tt h ep e xs e q u e n c eo fm m p 2 ，b u tn od a t aa r ea v a i l a b l eo n t h ep o s s i b l er o l eo fm m p - 2i ns i g n a l l i n gt h r o u g hi t si n t e r a c t i o nw i t h a v l 3 3 i n0 1 1 1 s t u d y ，w ef o u n dc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o no fb o t hm m p 2a n dm m p 9i nh l l m a n m e l a n o m aa 3 7 5b yg e lz y m o g r a p h y u s i n ga ni nv i t r om o d e lo f2 - dm i g r a t i o na n db r o a d s p e c t r u mm m pi n h i b i t o r , w ed e m o n s t r a t e dt h a tm m p - 2 ，b u tn o tm m p 9 ，i sa k e ye n z y m ef o r a 37 5c e l l s s p r e a d i n ga n dm i g r a t i o n r e s u l t so fo b s e r v i n gt h e d i s t r i b u t i o no fm m p 2a n d f a c t i nd u r i n ga 37 5c e l l ss p r e a d i n gi n d i c a t e dac o n n e c t i o nb e t w e e nt h ep r o t e i n a s ea n da c t i n c y t o s k e l e t o n i ns u p p o r to ft h e s ed a t a , m m p 2a n da v l 3 3w e r es p e c i f i c a l l yc o l o c a l i z e da tt h e l e a d i n ge d g eo fa 3 7 5c e l l s f i n a l l y ，w ef o u n dt h a tb o t hm m p 2a n dm m p 9c a na l j f e c t 廿l e l i g a n d - b i n d i n go fa v l 3 3b ya d h e s i o ns y s t e m s a l t o g e t h e r , t h e s ed a t ap r o v i d et h ee v i d e n c ef o r t h ei m p l i c a t i o no fm m p - 2i nh u m a nm e l a n o m am o t i l i t y , p r o b a b l yt h r o u g ht h ei n t e r a c t i o no f m m p - 2w i t hi n t e g r i n a v l 3 3t h a ta c ta sal i n k e ro f m a n ys i g n a l i n gp a t h w a y s k e yw o r d s ：m a r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e - 2 ；g e l a t i n a s e s ；m e l a n o m a ；i n t e g r i na v l 3 3 l l l j 二 i 目录 摘要i a b s t r a c t i i 目录i i i 引言1 一、明胶酶1 ( 一) 基质金属蛋白酶1 ( 二) 明胶酶分类及结构特征5 ( 三) 明胶酶的表达调控6 ( 四) 明胶酶的作用6 二、整合素7 ( 一) 整合素概况7 ( 二) 整合素的功能9 三、明胶酶与整合蛋白a v p 3 1 0 ( 一) 明胶酶与细胞表面蛋白1 l ( 二) 删p 一2 与整合蛋白a v e 3 1 1 四、本论文研究的内容与意义1 2 第一部分材料与方法1 3 一、实验材料1 3 ( 一) 细胞及其培养试剂1 3 ( 二) 抗体1 3 ( 三) 其它试剂1 3 ( 四) 仪器设备1 4 二、实验方法1 4 ( 一) 细胞的培养及冻存1 4 ( 二) 明胶酶谱法1 4 ( 三) 琼脂糖滴剂中的迁移实验1 5 ( 四) 免疫荧光分析1 5 ( 五) 体外静止粘附实验1 6 ( 六) 统计分析1 7 第二部分结果与分析1 8 一、明胶酶在a 3 7 5 细胞中的表达情况1 8 二、明胶酶抑制剂对a 3 7 5 细胞铺展和迁移的影响1 8 ( 一) 明胶酶对a 3 7 5 细胞铺展的影响1 8 ( 二) 明胶酶抑制剂对a 3 7 5 细胞迁移的影响2 0 三、删p 一2 与肌动蛋白细胞骨架的相关性2 1 四、合整素a v b 3 与m m p 一2 的相关性2 3 五、m m p s 抑制剂对a v e 3 介导的a 3 7 5 细胞黏附的影响2 5 第三部分讨论2 6 一、m m p 一2 对a 3 7 5 细胞的迁移和铺展有重要作用2 6 二、删p - 2 可能通过影响肌动蛋白细胞骨架来影响a 3 7 5 细胞迁移与铺展2 6 三、m m p 一2 与整合素a v e 3 的共定位进一步证明其影响骨架的可能性2 7 l i l 四、m m p 一2 可能影响整合素a v l 3 3 与其配体的结合能力2 7 结论和主要创新点2 9 参考文献3 0 致谢3 7 在学期间公开发表论文及著作情况3 8 i v 东北师范大学硕士学位论文 引言 一、明胶酶 长期以来，肿瘤对人们生命的威胁主要是源于其侵润转移等恶性化生长而非原发部 位生长。黑色素瘤通常起源于皮肤、黏膜、眼和中枢神经系统色素沉着区域的黑色素细 胞，是目前最具侵润和迁移能力的恶性实体瘤之一。在黑色素瘤脱离原发部位，侵润周 边组织并且穿过基底膜从而进入淋巴或血液循环转移到新组织的复杂过程中，细胞外基 质和基底膜的降解是十分关键的一步。前人研究表明，多种蛋白酶系统，如天冬氨酸蛋 白酶、半胱氨酸蛋白酶n 一1 和基质金属蛋白酶口3 都在恶性黑色素瘤发展的过程中发挥作 用，其中删p s 因其功能的显著性而被广泛关注h 5 1 。明胶酶，即基埘p 一2 和删p 一9 ，是 发挥降解细胞外基质功能的最主要的两种基质金属蛋白酶埔1 。近年来，随着对删p s 分 子功能的进一步研究盯1 ，其在肿瘤发展过程中的信号作用成为关注的焦点哺。1 。 ( 一) 基质金属蛋白酶 1 基质金属蛋白酶的结构 m e t a l l o p r o t e l n a s e 1 _ r x k r r m b l t m 口 - g p i m 1 1 基质金属蛋白酶家族的结构示意图( 引自g i l l i a nm u r p h y n 3 1 ) 。 s s ，疏水信号肽序列：p r o ，前肽区：f n i i ，2 型纤粘连蛋白结合区：l 1 ，l 2 ，铰链区：h e m o p e x i n ， 类血红素结合蛋白序列；m b ，质膜：t m ，跨膜区：c y s r ，半胱氨酸富集区：i g ，类免疫球蛋白区：g p i ， 糖基磷脂酰肌醇结合区：c t ，羧基末端区：c ，半胱氨酸。 u d p s 是一类能够分解细胞外基质蛋白的内肽酶，因其需要c a + + 、z n + + 等金属离子 作为辅助因子而得名，目前已知的删p s 至少有2 6 种m 1 。m m p s 家族成员具有相似的 东北师范大学硕士学位论文 结构，一般由5 个功能不同的结构域组成：( 1 ) 疏水信号肽序列：( 2 ) 大约8 0 个 氨基酸构成的前肽区，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后， 删p s 酶原被激活：( 3 ) 大约1 7 0 个氨基酸构成的催化活性区，有锌离子结合位点， 对酶催化作用的发挥至关重要：( 4 ) 长度多变的铰链区，富含脯氨酸：( 5 ) 大约2 0 0 个氨基酸的类血红素结合蛋白序列，该序列与m m p s 底物特异性有关( 如图1 1 所示) 。 其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性，其它结构则因m m p 类型的不同而各有 特点。如m m p - 7 ( m a t r il y s i n1 ) ，m m p 一2 6 ( m a t r il y s i n2 ) a n dm m p 一2 3 缺乏铰链区和 类血红素结合蛋白序列，而删p 一2 3 拥有特殊的半胱氨酸富集区和类免疫球蛋白区n 朝。 前人已对人源m m p s 的结构特征及其染色体定位有了较详细的研究( 如表1 ) 。 掩硼越m j 钔x 蟮删t h o r 出埘n 罚p 酷l t 雌 融2 矿嫩 喇p c h 翻瑚啪i 执擀- l n 勰p 。刚细啦 ：? 。n 辐mc s l l r 掰辩 c | l f 搬披1 _ 珥 坎2 矩 cyt钳谯-isimmaf n ) 。- 伽j e l 曲肇 i 黜r 耵m a i 。o i 抽窜嘶| ： c o d a 零憎靶l i 电m r 口p 拍l 稍d 碍脚脯l ： ( 娴a 嚣赞2 c h 暑吼】s e3 锚| l i n 蕾拦 h 臼s e c 山乜j e 8 囊“啊一y 譬b s h o f n 芒l v 钳n1 s m x n e l 归a2 搿一l i b 两l 墨 m a u a y s a n1 t r 诅v j 韵2 s u m a e l 嗣a3 m 曩n h - f - t 朝譬m m ) t r 锄l 耵t m h 艟q ，p o m 可1 m ，帅 帕r 2 一m 吼毫p h r 3 一髂种 盯s _ m 附中 疆) c 纠| 耐i 钾耐 盯4 m m 扩 m t & - m m p 0 曲| 6 口呻t i | 髀e i 栩，e e n a m y m a b m p 一与r n m m p - 1 1 1 q z 2 _ q 童3 - + m m i x |l l q 奎1 蝣 +- - 删卜1 3i l q 黝 - _ m m p - 21 6 q 1 3 -4- m m p - 9 珈1 1 2 q 1 3 1 +_+ m m p - 3 1 1 4 2 j i - m m p - i o”q 2 捧q 趋 - m m p - ?1 1 q 2 1 蝣 - - 嘲社2 6 ”p l s m m f - i l 2 2 q 1 1 2l j ( ) 1 4 q 1 1 - q 1 2 1 s q l 啦l 誊q 2 1 勰q 1 1 2 洲卜1 7 1 2 q 2 3 + 蝴p - 2 s 1 6 p 1 3 , 3 _ - _ 枷卜1 21 1 q 2 2 2 - q 2 2 3 i m p - , 1 9 1 2 q 1 4 _ 嘲卜2 01 1 q 2 2 3 - 嘲f l 2 1t o 黼p - 2 3 1 p 3 s 3 - - 赫d f l 2 7 1 1 q , 2 4 ， - 嘲扛：揸 1 7 霹1 1 一 表1 人源基质金属蛋白酶的结构及染色体定位( 引自g i l l i a nl h u r p h y 3 1 ) 。 s s ，疏水信号肽序列；p r o ，前肽区；c s ，c y s t e i n es w i t c hm o t i f ；r x r k r ，蛋白转化酶 识别序列：f n 2 ，2 型纤粘连蛋白结合区：l k ，铰链区：t m ，跨膜区：g p i ，糖基磷脂酰肌醇结合区：c y t ， 羧基末端区：c y r - i g ，半胱氨酸富集区和类免疫球蛋白区：( ) 表示疏水信号肽序列和前肽区有不 同程度的序列缺乏。 2 基质金属蛋白酶的分类 m m p 根据其序列的同源性，作用底物的特异性和细胞定位可以进行如下分类n t l 5 1 ： 胶原酶( c o l l a g e n a s e s ) ：删p l ，帅一8 ，m m p 一1 3 ，删p - 1 8 明胶酶( g e l a t i n a s e s ) ：删p 一2 ，删p 一9 2 各种蛋白成分和多种细胞外蛋白( 图1 2 ) ，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿 瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为 是该过程中主要的蛋白水解酶n 射。 lc o l l a g e n a s e si i g e l a t i n a s e s i l 1 品面i i 爵云一i 竺曼竺呈坠竺曼! ! 曼竺! ! 苎i 。五磊i 亍i i 一 婚 p 1 3m m p - 1 8 m t - m m p l “t m m p 2m t - m m p 3 图1 2 已知l 岫l p s 的细胞外基质作用底物多样性图解( z j l 自a b i g a i ll u s ) 。 3 基质金属蛋白酶的表达调控 删p s 的活性受到三个水平的调节：多种转录调节因子可影响m m p s 的基因转 录水平；多种蛋白水解酶可对无活性的m m p s 酶前体进行翻译后修饰，从而将其激 活；内源性的m m p s 特异性抑制因子( t i m p ) 可影响m m p s 的活性( 图1 3 ) 5 1 。 t i m p s 是m m p s 的天然组织抑制剂，在正常组织中，t i m p s 与m m p s 的是呈1 ：1 的比 例而存在的，从而抑制m m p s 对胞外基质的水解作用。而在非正常组织中，如恶性肿瘤 组织中，m m p s 的含量远远大于其组织抑制剂t i m p s ，则m m p s 便会发挥其水解胞外基质 成分的作用，使肿瘤细胞恶性化，并向周边组织浸润侵袭。黑色素瘤细胞能够表达多种 删p s ( 姗p 一1 ，一2 ，- 9 ，- 1 3 及m t i - 删p ) 和m m p s 抑制蛋白( t i m p - i ，- 2 ，- 3 ，- 4 ) 1 。 但是目前对于黑色素瘤在其发展的不同阶段表达m m p s 的具体情况的研究并不多 i s - l s , 对 3 东北师范大学硕士学位论文 于不同类型黑色素瘤在不同发展阶段所表达m m p s 的类型及其相对量并没有清晰的描 述。 ，、 删p + n r r h 协l p g e n e x 4 s t i m u l m o r s lj i n h i b d o r t |i 妇 - - - - 一p a t h w a y , j 一s p e c i f ；c m m p p d t h w a y ，、 m m p + m t 硼咿 t u r n a ；旺姻一 l 二_ = 二_ _ j f p l o - m m 铲 ： 。 _ ： 函i 矗 ：c “蛳 p m 二“1 二乙= = z = o m tm p - - - 皂淼燃 h m - 靠2 争t f p i 2 lj f 。h i i i 。 弋 一 |；n o ? 产 ! 、3 a 豫 ， f u r i ar 0 s ； ， i 、 、 ；r o s 7 1 ! d 扣a 哦啬、。p r o t e i n a s ；s e r 毒i 。 a r a r a t o n 正 $ d c r e a o n p r o ( t l t a 嘲t | 、 r f洲pi 1 、f m 一p 1 图1 3m m p s 表达调控示意图( 引自a b i g a i ll u 副) 。 生长因子，细胞因子，活性氧，一氧化氮等能够影响m m p 和m t - m m p 的转录和蛋白前体( p r o - g m p 和p r o 一盯一m 肝) 的合成，定位于细胞表面的p r o - g t - m g p 和分泌到细胞外的p r o - m m p 能够被活性氧， 丝氨酸蛋白酶等激活，m t - m m p 还能被弗林蛋白酶激活。但是，p r o 一脚p - 1 1 ，p r o - m 肝一2 3a n d p r o - m 肝一2 8 是在细胞内被弗林蛋白酶激活后再以其活性形式分泌到细胞外，而p r o m 肝一2 则是通过 在细胞表面与m t i - m m p 和t i m p 一2 形成三分子复合物而被激活。激活后的m m p s 和k r - m m p s 能够降解 多种细胞外基质蛋白，刺激生长因子和细胞因子，从而对m m p s 的表达调控形成调节性负反馈。这种 循环调控可以在很多阶段受到抑制剂的影响，如细胞内部的r e c k ，细胞外部的t f p i - 2 和已知的四 种t i 肝s 。 4 东北师范大学硕士学位论文 ( 二) 明胶酶及其结构特征 明胶酶( g e l a t i n a s e s ) 因其对明胶的降解能力而得名，主要有两种形式，明胶酶 a ( 即删p 一2 ) 是一种分子量为7 2 k d 的非糖化蛋白，而明胶酶b ( 即删p 一9 ) 是一种分子 量9 2 k d ，在前肽区和催化区被糖化的蛋白 1 9 】o 明胶酶具有删p s 家族共有的五个基本结 构域：疏水信号肽序列，前肽区，催化活性区，铰链区和类血红素结合蛋白序列扭们。 此外，明胶酶在锌离子结合位点前还具有一个由5 8 个氨基酸残基组成的胶原结合片段 ( c b d ，c o l a g e n b i n d i n gd o m a i n ) 2 。 图1 4 人源姗p 一2 前体与其组织抑制剂t i m p 一2 相互作用的三维结构图( 引自6 i l l i a n m u r p h y 1 ) 。 绿色区域代表前肽区，红色区域代表催化活性区，蓝色区域代表2 型纤粘连蛋白结合区，橙 色区域代表类血红素结合蛋白序列，t i g p 一2 则由粉色区域表示。锌离子存在于绿色区域，钙离子存 在于蓝色区域，二硫键存在于橙色区域中。 删p 一2 和v 1 p - 9 在结构上也存在一定差异。删p 一2 酶原除有锌离子结合位点外，在 催化活性区和羧基末端共具有3 个钙离子结合位点，它们发挥着保持活性区空间结构和 稳定酶活性的作用卫朝。目前，删p 一2 的结构研究已经比较清楚，删p 一2 前体与其组织 抑制剂t i m p - 2 相互作用的三维结构如图1 4 所示。m m p - 9 在催化活性区和羧基末端之 间特有一个五型胶原样插入区，这一区域的功能尚不清楚，但此区聚集了m , i p - 9 的大多 5 东北师范大学硕士学位论文 数氧连接多糖 2 4 , 2 s o 此外，导致m m p 2 和m m p 9 底物之间差异的关键原因是它们在催化活 性区内的结构差异：一3 。 ( 三) 明胶酶的表达调控 与众多埘p s 成员相似，明胶酶在基因水平上受生长因子、细胞因子、激素、致癌 基因和肿瘤促进因子等调节汹1 。在蛋白质的水平上，需要在其他蛋白酶的作用下从酶原 状态转变为有活性的酶，并受其天然抑制剂t i m p s 的调控啪1 。但与众多其它m m p s 家族 成员相比，明胶酶的表达调控也有其特殊的一面。 1 基因水平的调控 m m p 一2 和m m p 一9 在基因表达水平，尤其是生理环境改变时在表达量上的波动程度有 显著不同，m m p 一2 的表达比较稳定，在各种生理环境下只有微量的上升或下调，而m m p - 9 的表达量则会在生长因子，细胞因子和其它刺激信号的作用下发生明显的变化啪1 。其原 因在于删p 一2 与m m p 一9 等其他m m p s 成员不同，在启动子区缺少许多可诱导的启动元件， 如a p - 1 和e t s 转录因子的结合位点口。 2 蛋白水平的调控 删p 一2 的激活主要是通过在细胞表面与m t l - m m p 和t i m p - 2 形成三分子复合物。t i m p - 2 的氮端与膜型金属蛋白酶m t 。一删p 结合的同时，碳端与删p 一2 酶原的类血红素结合蛋白序 列结合，这种结合使m t 广m m p 丧失活性，但临近的未与t i m p - 2 结合的m t 卜删p 可将删p 一2 剪切成具有部分活性的6 4 - k d a 片段，具有部分活性的删p 一2 片段可以经具有完全活性的 删p 一2 进一步剪切而形成6 2 - k d a 的成熟的删p 一2 2 瑚1 。此外，删p 一2 也可以被其它多种蛋 白酶直接或通过m t 广m m p 间接的激活。 m m p 一9 的激活主要是通过血纤维蛋白溶酶原m m p 一3 途径实现的。尿激酶血纤维蛋白 溶酶原激活物( u p a ) 与其细胞表面受体( u p a r ) 结合后具有酶活性从而将血纤维蛋白溶 酶原剪切为血纤维蛋白溶酶，有活性的血纤维蛋白溶酶可以将p r o m m p - 3 转化为删p 一3 ， 从而通过脚p 一3 激活姗p 一9 1 。此外，砌p 一9 也可以被其它多种蛋白酶直接激活。 ( 四) 明胶酶的作用 细胞外基质与基底膜的重构是肿瘤发生发展的关键步骤之一1 。基质和基底膜的主 要成分是胶原，胶原成分的破坏有利于肿瘤的侵润和转移汹1 。明胶酶( 又称i v 型胶原酶) 不仅能降解多种胶原、纤维蛋白和弹性蛋白，并具有明胶溶解作用，因此它在多种恶性 肿瘤中都有过表达现象。明胶酶不仅能参与胞外基质与基底膜重构嫡1 ，在血管发生、侵 润和迁移等肿瘤发生发展过程中发挥了重要作用阳1 。无论是在黑色素瘤发生早期还是恶 性迁移阶段，明胶酶的表达量都有明显增加，但是两种明胶酶的作用有所不同。 m m p - 2 的表达量不仅与黑色素瘤早期的发生和转移相关m 1 ，与人的黑色素瘤的预后 也有明显的相关性汹1 。一方面，肿瘤细胞分泌的有活性的m m p - 2 能通过调节肿瘤细胞在 东北师范大学硕士学位论文 细胞外基质中的粘附和扩散促进黑色素瘤向周边组织的侵润和向远方组织的迁移引。另 一方面，基质细胞表达的m m p - 2 通过调节肿瘤细胞的生长环境而影响黑色素瘤的发展 h 州3 1 。例如，巩膜纤维原细胞在肿瘤细胞影响下分泌的删p 一2 在眼黑色素瘤穿过巩膜的 扩散过程中发挥了主要作用1 。 m m p 一9 对肿瘤的影响是促进还是抑制取决于肿瘤发展的具体阶段n 郇。在原发性的黑 色素瘤中，m m p - 9 的过表达主要发生在肿瘤的水平生长阶段而非垂直生长阶段h 钔。在恶 性黑色素瘤中删p 一9 在肿瘤转移的早期发挥作用而；i i e a 侵其他组织的晚期阶段h7 删。此 外，有研究表明利用组成性表达m m p 一9 的细胞系进行黑色素瘤迁移模拟实验，肿瘤细胞 的扩散得到了提高，而在m m p - 9 缺失的小鼠中，黑色素瘤的迁移受到抑制h 矾鲫。该结果 说明无论是肿瘤细胞还是基质细胞分泌的m m p - 9 对肿瘤迁移都有促进作用。 二、整合素 ( 一) 整合素概况 1 整合素的分类 图2 1 整合素家族的组成( 引自哺) 整合素是一类重要的细胞表面粘附分子，是由a 亚基和p 亚基通过非共价键连接构 7 东北师范大学硕士学位论文 成的异源二聚体糖蛋白受体。迄今为止，脊椎动物中已经发现a 亚基1 8 种，b 亚基8 种，共同组成了2 4 种不同的整合素分子嘞1 。虽然a 亚基与b 亚基间没有同源性，但不 同的a 亚基间有很高的相似性，不同的p 亚基中也有相对保守的区域。根据整合素分子 的亚基构成和配体结合特异性可以将整合素家族分为以p 1 亚家族，b 2 亚家族和亚 家族为主的几类( 如图2 1 ) 。 2 整合素的结构特征 q 亚基的n 端有一个含7 次重复序列( a s p x a s p x a s p x - g l y - x x a s p ) 的b 推 动结构。在该结构的后三到四个序列处有钙离子结合位点，与配体的结合有关。紧接着 b 推动结构的是t h i g h 区，c a l f - 1 区和c a l f - 2 区。有9 种q 亚基在d 推动结构内含有 一个由大约2 0 0 个氨基酸构成的含有镁离子结合位点的插入区( i d o m a i n ) ，该区域与 胶原的结合有关。含有该插入区的整合素中，a id o m a i n 具有相当高的同源性，但a 链 的胞质区却比较多变，只有近膜区含有较稳定的g f f k r 序列，与整合素活性的调节有关 ( 如图2 2 a ) 。 a b 膏tt i d j 2 蛐l 口烈前a 瞄1l 3 l ll 玉je 】7 一囊盱1ic a l f - 2 p s i 广咐蚺d 翻m _ 衲- - t - e g f涮i 翻i m - 辆l l d o m - i 鸭d o m - 矾 8 r = 一i 二i k ed o 鬲蟊l 二二- l “啊吲一零嘲囝 图2 2 整合素的结构模式图( 引自m i c h a e ls t e f a n i d a k i s ) a 为q 链和b 链的一级结构。1 8 种a 链中有9 种含有qi d o m a i n ，所有b 链均含有bi - d o m a i n 。 红色星代表镁离子结合位点，灰色星代表钙离子结合位点：b ，c 分别为无活性和有活性的含有a i d o m a i n 的整合素的3 维模式图。i - d 代表i d o m a i n ，i - f _ j 3 f 代表整合素与表皮生长因子结合区， b t h 代表1 3 链尾部 1 3 亚基由以下几个部分构成：p s i 区；多变区，其内部的i - i i k e 区含有镁离子和 8 东北师范大学硕士学位论文 钙离子的结合位点；四个富含半胱氨酸的表皮生长因子结合区；b 链碳末端区域，该区 域的胞质区末端具有高度同源性，能与含有p t b 片段的蛋白结合( 如图2 2 a ) 。 可溶性的整合素分子通常以紧凑的折叠构象存在晦3 3 ( 如图2 2 b ) ，整合素和其配体 的结合能力与整合素分子三维构象的折叠程度直接相关。在折叠构象下整合素只能与一 些小型配体结合，随着三维折叠结构的伸展，配体结合位点暴露，整合素与其配体的结 合能力也相应的增强嘲1 ( 图2 2 c ) 。 3 整合素的配体 整合素作为一种重要的细胞表面粘附分子，其配体的种类十分广泛，每种整合素都 有自己相对应的配体，一种整合素可以与多种配体结合，一种配体也可以与多种整合素 结合。整合素的生理配体主要有两部分，一部分是细胞免疫球蛋白超家族成员，如细胞 间粘附分子i c a m s 和血管细胞粘附分子v c a m s ，另一部分是细胞外基质( e c m ) 蛋白，如纤 粘连蛋白( f i b r o n e c t i n ) 、玻粘连蛋白( v i t r o n e c t i n ) 、层粘连蛋白( 1 a m i n i n ) 和胶原 蛋白( c o l l a g e n ) 等。 整合素生理配体的识别序列主要有r g d 、g f o g e r 和l d v 三种。含有r g d 序列的配体 有纤粘连蛋白、纤维蛋白原( f i b r i n o g e n ) 和层粘连蛋白，此外，无活性的转化生长因 子b ( t g f b ) 与许多其它e c m 蛋白形成的l a p 复合物也含有r g d 序列嘲1 。目前在许多 生物化学和细胞生物学书中，r g d 序列都被认为是整合素的主要识别序列，但实际上目 前已知的整合素中大约只有三分之一的整合素通过识别r g d 区与其配体结合，一些层粘 连蛋白的同源异构体虽然含有r g d 区却不能被整合素识别。整合素对胶原蛋白的识别 主要是通过三重螺旋的g f o g e r 序列删，或其变异序列。此外，l d v 序列和其变异序列也 是一类较重要的整合素识别序列，如q4 整合素与纤粘连蛋白的选择性剪切区的识别 呻】。b2 整合素与i c a m s 的识别，q4b7 与m a d c a m 的识别等呻1 。 除以上生理配体外，一些由蛋白降解而产生的整合素配体正逐渐被人们所发现，如 x 型胶原蛋白，串珠素( p e r l e c a n ) 和i v 型胶原蛋白的蛋白水解产物伸“嘲。此外， 整合素还能与去整合素( 白眉蝮蛇毒) 、某些细菌以及病毒相互结合，并且这种相互作 用不总是通过常规的整合素配体结合位点完成旧删。 ( 二) 整合素的功能 整合素的主要功能是介导细胞与细胞外基质以及细胞与细胞之间的粘附。整合素的 胞外区能够与多种细胞外基质蛋白和其它类型细胞表面粘附分子相互作用，胞内区能与 细胞内的骨架蛋白、肌动蛋白、q 一辅肌动蛋白、踝蛋白、纽蛋白等相互作用在细胞膜 的胞质面形成粘着斑，从而将细胞外基质与细胞内骨架蛋白连接在一起，维持细胞的形 态，影响细胞的粘附、运动、吞噬等作用。 整合素除了以上粘附作用外，还能介导细胞内外的双向信号传递。由内向外的信号 传导( i n s i d e - o u ts i g n a l i n g ) 主要是指胞内的信号蛋白对整合素与其配体结合能力的 调节，如踝蛋白( t a l i n s ) 、细丝蛋白( f i l a m i n s ) 、粘附结构蛋白( m i g f i l i n ) 、粘着斑 激酶( f a k ) 和整合素连接激酶( i l k ) 呻1 等都能调节整合素的活性。由外向内的信号传导 9 东北师范大学硕士学位论文 ( o u t s i d e - i ns i g n a l i n g ) 是整合素与胞外配体结合后发生分子构象变化而引起的多种 信号蛋白参与的复杂的酪氨酸磷酸化级联反应，能够影响细胞的存活、增生、基因转录 和迁移等拍7 鹄】。 整合素分子通过介导细胞与细胞外基质以及细胞与细胞间的相互作用，参与细胞内 外信号传导，在细胞分化、胚胎发育、凝血、组织修补及细胞粘附等诸多方面发挥着重 要作用。而在恶性肿瘤中，整合素通过介导肿瘤细胞与基底膜、肿瘤细胞与宿主细胞间 的粘附及肿瘤发生发展过程中的多种信号传递，直接或间接的影响了肿瘤的增长、粘附、 浸润、迁移和血管再生等多个环节。其中整合素影响细胞迁移的重要途径之一是通过其 下游多条信号通路调节肌动蛋白细胞骨架( 如图2 3 ) 。 囤一固 圆圈团 lx 人 圆圆圆圆匿圃圆圆 凶丫卤卤iil 囵i 圆圈lii iiiiiil 图2 3 整合素介导细胞迁移的信号通路( 引自w e n j u ng u o 删) 三、明胶酶与整合蛋白a v l b 3 近年来，随着m m p s 抑制剂在肿瘤治疗中研究的深入，越来越多的实验证明删p s 不 只是促进肿瘤的转移，某些m m p s 在肿瘤发展过程中对机体还有保护作用m 1 ，如抑制血 管再生盯1 7 2 1 ，降解并抑制细胞因子m 1 等。同一种m m p 在肿瘤发展的不同阶段作用也有 不同口习。因此，瑚p s 通过与非基质蛋白相互作用而可能发挥的信号作用越来越受关注 【7 6 _ 为】 1 0 东北师范大学硕士学位论文 ( 一) 明胶酶与细胞表面蛋白 明胶酶不仅能降解多种基质蛋白，也能与c d 4 4 、r e c k 、l r p 、i n t e g r i n s 等多种细 胞表面蛋白相互作用啪1 。在黑色素瘤发展过程中，明胶酶与i n t e g r i n 和c d 4 4 的相互作 用发挥了重要作用。 c d 4 4 是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，既能与细胞外基质中的透明质 酸、层粘连蛋白等基质分子结合又能与细胞骨架蛋白结合，参与细胞伪足形成， 并与细胞的迁移运动有关。c d 4 4 与人类各种恶性肿瘤侵润转移关系的研究已有大 量报道。在黑色素瘤中，c d 4 4 或c d 4 4 v 。与透明质酸的相互作用可诱导细胞发生恶 性化c s i 早在9 9 年，q y u 等人就证明c d 4 4 可以通过影响m m p 一9 的活性而调控i v 型胶 原的降解和肿瘤的侵润性迁移陋羽，也有研究表明，c d 4 4 抗体处理后