（中医内科学专业论文）青蒿鳖甲汤干预bmscs对amlpcr患者bmnc来源dcs诱导的影响.pdf

贵阳中医学院硕士学位论文相关声明 原创性声明 ，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表论文中撰写过的研究成果，也不包含为获得贵阳中医学院或其他 单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均 已在论文中作了明确说明。 作者：刍、渗涉作者：匆、汐妒 日期：勿卜年f 月诏日 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文；学校可根据国家或贵州省有 关部门规定送交学位论文。 作者签名：乙，涉够每师签 日期：砂p 年朗狮 ，、 目录 摘要1 摘要4 言8口u 9 文献研究9 l 基质细胞在微小残留白血病治疗中的地位9 2 透毒法是微小残留白雪病的重要治法1 3 实验研究1 8 l 材料和方法2 0 2 结果! 2 2 3 讨论3 2 4 结论3 4 总结与展望3 5 参考文献3 6 附录一缩略语表4 0 附录二综述4 l 附录三致谢5 2 附录五个人简介5 3 贵阳中医学院学位论文 摘要 的：本实验以体外培养的方法，将达到完全缓解标准的急性髓细胞自血病 髓中分离出去t 细胞的骨髓单个核细胞( t d b 心c ) 、b m s c s 分别与青蒿鳖 药血清培养，再将与含药血清共同培养过的t d - - b m n c 来源的d c s 与b m s c s 养，观察含药血清对树突状细胞( d c ) 分化成熟的影响。用此法诱导分化 的树突状细胞( d c ) 与纯化的正常人和缓解期患者外周血t 细胞共同培养，得到 激发t 细胞，用激发的t 细胞与白血病细胞株( k 5 6 2 ) 共同培育，以m t t 法测定该 t 细胞对k 5 6 2 细胞株的杀伤活性，探讨青蒿鳖甲汤能否通过干预a m l - c r 患者 b m s c s 从而对其骨髓单个核细胞来源的d c 诱导作用产生影响。 方法：1 应用洗涤细胞、离心程序在a m l - c r 患者的骨髓中分离出b m s c s ， 加入青蒿鳖甲汤不同剂量含药血清组的2 5 c m 2 培养瓶中，放置在3 7 c ，5 c 0 ：条 件下培养，于接种3 d 后首次半量换液，以后隔日换液，在倒置显微镜下观察细 胞形态及生长情况并拍照；2 应用绵羊红细胞玫瑰花结程序从a m l - c r 患者骨髓 中分离出去t 细胞的骨髓单个核细胞( t d b 删c ) ，用含1 0 9 6 f b s 的r p m l l 6 4 0 培养 液调整t d - b m n c 细胞浓度后加入2 4 孔板中培养，培养9 d ，隔日换液1 次，以 不同浓度中药含药血清、中药含药血清联合细胞因子( 啡c s f 、i l - 4 、t n f - a ) 、 细胞因子、空白血清组分别培养；在培养过程中观察细胞的形态，并拍照。3 用f i t c 标记的c d 2 9 、c d 4 4 及c d - - i a 、h l a d r 、c d 8 6 抗体分别标记b m s c s 及d c s ， 用流式细胞仪检测各组各抗体的表达率。4 收集培养9 d 后的b m s c s 与d c s ，用 r p m i l 6 4 0 调整细胞浓度至1 x 1 0 6 m 1 混合培养5 d ；5 分别收集纯化的同种异体t 细胞、a m l c r 患者自体t 细胞、b m s c s 与a m l c r 患者t d b 心c 来源的d c 以i 0 ： 1 比例加入2 4 孔培养板培养5 d ，培养基中加入1 0 0 u m 1 的i l - 2 进行同种异体t 细胞及自体t 细胞的激发。6 激发后的各组t 细胞与k 5 6 2 细胞分别以1 0 ：l 、 2 0 ：1 、4 0 ：1 效：靶比例培养2 4 h ，m t t 法检测不同条件培养的d c 诱导t 细胞 的杀伤效应。 结果： 1 用倒置显微镜观察发现青蒿鳖甲汤含药血清组、含药血清联合细胞因子 组、细胞因子组b m s c s 、d c 的形态无差别。 2 从b m s c s 的免疫分子检测显示，a m l - c r 患者骨髓基质细胞经青蒿鳖甲汤 1 贵阳中医学院学位论文 含药血清培养可获得具备典型特征和细胞表型的b m s c s ，含药血清与细胞因子在 诱导c d 2 9 、c d 4 4 表达方面无协同作用，是否细胞因子对b m s c s 的分化无影响， 是否对兔子内环境有干预作用，均有待于进一步研究。 3 从d c 的免疫分子检测显示，蛾i l - c r 患者骨髓单个核细胞经青蒿鳖甲汤 含药血清诱导培养可获得具备典型特征和细胞表型的d c 。从本实验的总的趋势 看，青蒿鳖甲汤含药血清配合细胞因子培养诱导d c ，其特异性表面抗原的表达 高于青蒿鳖甲汤含药血清及细胞因子培养诱导的d c ，说明细胞因子和青蒿鳖甲 汤含药血清在诱导t d - b m n c 转化d c 上有协同作用，可能为含药血清改善了细胞 因子的功能和内环境，促进了d c 的诱导、分化。 4 在本实验中，各组激活t 细胞对k 5 6 2 细胞均有杀伤作用，各效靶比中 各组别对k 5 6 2 细胞的杀伤率普遍优于空白组；表明青蒿鳖甲汤干预的含药血清 诱导的d c 有效的提呈了肿瘤抗原；并活化t 细胞，致使它成为抗原特异性的c t l ， 能够特异性的杀伤k 5 6 2 肿瘤细胞。青蒿鳖甲汤与细胞因子有协同作用，可能青 蒿鳖甲汤含药血清诱导、强化的骨髓基质细胞分泌了多种的细胞因子，这些因子 改变了机体的内环境，最终影响了d c 细胞对k 5 6 2 的杀伤作用；从实验数据来看 异体t 细胞杀伤率优于自体的t 细胞的杀伤率，可能是白血病肿瘤免疫逃逸机 制主要是白血病缓解后患者t 细胞的细胞毒功能受损严重有关，有待进一步大 样本实验研究。各组别对k 5 6 2 细胞均有杀伤作用，但就本实验而言，效靶比与 杀伤率之间没有一定的规律可循，这与文献报道的杀伤作用随效靶比的增加而增 加不符，有待以后的实验进一步研究。 5 从本实验数据看，青蒿鳖甲汤含药血清低剂量组培养诱导b m s c s 、d c 的特异性细胞表面抗原表达率高于中、高剂量组，抗原表达不因剂量增加而升高， 说明低剂量青蒿鳖甲汤含药血清可能是此项实验的最佳浓度，但是在各组激活t 细胞对k 5 6 2 细胞的杀伤作用中，青蒿鳖甲汤低、中、高剂量之间的却无一定规 律可循，因此低剂量青蒿鳖甲汤含药血清是否为最佳浓度仍有待于进一步研究。 结论： 1 急性髓系白血病完全缓解患者骨髓经青蒿鳖甲汤含药血清诱导培养可获 得具备典型特征和细胞表型的b m s c s 。 2 急性髓系自血病完全缓解患者t d - b m n c 经青蒿鳖甲汤含药血清诱导培养 2 3 d c s 后，d c s 皤 和， 。毒 ” 。 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：i nt h i se x p e r i m e n t ，i nv i t r om e t h o d st oa c h i e v ec o m p l e t e r e m i s s i o nc r i t e r i ai np a t i e n t sw i t ha c u t em y e l o i dl e u k e m i ab o n em a r r o w tc e l l si nt h es e p a r a t i o no ft d b 心c ，b m s c s ，r e s p e c t i v e l yq i n gh a ob i e j i as o u pc u l t u r ec o n t a i n i n gs e r u m , t h e nw i l lb ec o 。c u l t u r e dw i t hs e r u m - o f f t d b e n cs o u r c e so fd c sc o - c u l t u r e dw i t hb m s c sw a so b s e r v e dw i t hs e r u mo n d cd i f f e r e n t i a t i o na n dm a t u r a t i o ne f f e c t s u s et h i s m e t h o di n d u c e d d i f f e r e n t i a t i o no fd ca n dp u r i f i c a t i o no fn o r m a ls u b j e c t sa n dp a t i e n t s i nr e m i s s i o nw e r ec u l t u r e dp e r i p h e r a lb l o o dtc e l l s ，tc e l l s a r e s t i m u l a t e dw i t htc e l l ss t i m u l a t e dw i t hk 5 6 2c o m m o nt r a i n i n gt om t tm e t h o d f o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h etc e l lk i l l i n ga c t i v i t yo fk 5 6 2c e l l l i n e t oe x p l o r et h eq i n gh a ob i ej i at a n gc a ni n t e r f e r ew i t ha m l c rp a t i e n t s b yb m s c st ot h e i rb o n em a r r o wm o n o n u c i e a rc e l l sd e r i v e dd ci n d u c e di m p a c t m e t h o d s ：1 a p p l i c a t i o nw a s h i n gc e l l s ，c e n t r i f u g ep r o g r a mi na m l c r p a t i e n t sw i t hb o n em a r r o wi s o l a t e db m s c s ，a d d i n gq i n gh a ob i ej i as o u p d i f f e r e n td o s e sc o n t a i n i n gs e r u mg r o u p2 5 c m 2c u l t u r ef l a s k ，p l a c e di n3 7 5 c 0 2u n d e rt h ec o n d i t i o n so fc u l t u r e ，t h ei n o c u l a t i o n3 dm e d i u mw a s c h a n g e da f t e r t h ef i r s th a l f ，a f t e rt h em e d i u mw a sc h a n g e de v e r yo t h e r d a y ，i nt h ei n v e r t e dm i c r o s c o p et oo b s e r v ec e l lm o r p h o l o g ya n dg r o w t ha n d p h o t o g r a p h e d ；2 a p p l i c a t i o no fs h e e pr e db l o o dc e l lr o s e t t ep r o g r a m f r o m a m l c rp a t i e n t si nt h es e p a r a t i o no f b o n em a r r o wt c e l l si nt d m n c ， c o n t a i n i n g1 0 f b si nr p m i 1 6 4 0c u l t u r em e d i u mt oa d j u s tt h ec o n c e n t r a t i o n o ft d b m n cc e l lc u l t u r ea f t e rt h ea c c e s s i o no f2 4w e l lp l a t e s ，c u l t u r e d 9 d ，1m e d i u mw a sc h a n g e de v e r yo t h e rd a y ，w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s o fc h i n e s eh e r bm e d i c i n e ，c h i n e s eh e r bm e d i c i n ec o m b i n e dc e l lf a c t o r ( g m c s f ，i l 一4 ，t n f - a ) ，c y t o k i n e s ，b l a n ks e r u m w e r ec u l t u r e d ；i nt h et r a i n i n g p r o c e s so ft h em o r p h o l o g yo f c e l l sw a so b s e r v e d ，a n dp h o t o g r a p h e d 3 7w i t h f i t c c d 2 9 ，c d 4 4a n dc d - i a ，h l a d r ，c d 8 6a n ti b o d i e sw e r el a b e l e db m s c sa n d d c s ，e a c hg r o u pw a sd e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r ye x p r e s s i o no ft h ea n t i b o d y 4 g r o u pa f t e rt h ek 5 6 2c e l l sa n dt h e e f f e c to fe a c ho f1 0 ：1 ，2 0 ：1 ，4 0 ：l ：t a r g e t r a t i oo fc u l t u r e d2 4 h ，m t ta s s a yo fd cc u l t u r e di nd i f f e r e n tc o n d i t i o n s i n d u c e dtc e l lk i l l i n ge f f e c t r e s u l t s ： 1 w i t ht h ei n v e r t e dm i c r o s c o p e ，o b s e r v e dt h a tt h eq i n gh a ob i ej i a s o u pc o n t a i n i n gs e r u mg r o u p ，aj o i n t d r u g c o n t a i n i n gs e r u mc y t o k i n e ， c y t o k i n eg r o u po fb m s c s ，i ) cf o r mo fn o n d i s c r i m i n a t o r y 。? ： 2 b m s c si m m u n ef r o mt h ee l e m e n t so ft h ei n s p e c t i o ns h o w e dt h a tc ra m l t ot h eb o n em a r r o wc e l l st h eq u a l i t yo ft h eq i n gh a ob i ej i as o u pi nt h e t r a i n i n ga v a il a b l ef o rat y p i c a l f e a t u r e s a n df o r mo fc e l l b m s c s ， i n c l u d i n gd r u gs e r u mc e l l sf a c t o ri nt h eg u i d ec d 2 9c d 4 4e x p r e s s i o n ，n o c o o p e r a t i v e ，t h ef a c t o ro ft h ep o l a r i z a t i o no fb m s c sn oi n f l u e n c eo nt h e r a b b i t ，w h e t h e rt h ei n t e r f e r e n c e ，t ob ear o l et of u r t h e rs t u d y 3 d e t e c t i o no fi m m u n em o l e c u l e sf r o mt h ed cs h o w ，a m l c r p a t i e n t s w i t hb o n em a r r o wm o n o n u c l e a rc e l l sw e r eq i n gh a ob i ej i as o u pi n d u c t i o n o fa v a i l a b i l i t yo fs e r u ma n dc e l l sw i t ht y p i c a lp h e n o t y p eo fd c f r o mt h i s e x p e r i m e n t ，t h eg e n e r a lt r e n d ，q i n gh a ob i ej i as o u pc o n t a i n i n gs e r u m c u l t u r ew i t hc y t o k i n e si n d u c e db yd c i t ss p e c i f i cs u r f a c ea n t i g e nw a s h i g h e rt h a no i n gh a ob i ej i as o u pc o n t a i n i n gs e r u ma n dc y t o k i n e si nc u l t u r e i n d u c e dd c ，s h o w sc y t o k i n e sa n do i n gh a ob i ej i as o u pc o n t a i n i n gs e r u m i nt h ei n d u c t i o no ft d b m n cd cc o n v e r s i o nh a v e s y n e r g ym a yb ei m p r o v e d w i t hs e r u mc y t o k i n ef u n c t i o na n d i n t e r n a l e n v i r o n m e n t ，p r o m o t et h e i n d u c t i o no fd cd i f f e r e n t i a t i o n 5 4 i nt h i ss t u d y ，a c t i v a t i o no ftc e l l si ne a c hg r o u pw e r e ，k i l l i n g e f f e c to nk 5 6 2c e lls ，t h ee f f e c to nt h et a r g e tg r o u p st h a ni nt h ek 5 6 2 c e ll k illi n gr a t ew a sg e n e r a ll yb e t t e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p ；t h a tq i n g h a ob i ej i as o u pi n t e r v e n t i o nc o n t a i n i n gs e r u mi n d u c e do fd ct op r e s e n t t u m o ra n t i g e n se f f e c t i v e l y ；a n da c t i v a t i o no ftc e l l s ，c a u s i n gi t t o b e c o m ea n t i g e n s p e c i f i cc t l ，t os p e c i f i ca n t i k 5 6 2t u m o rc e l l s q i n gh a o b i ej i as o u pa n ds y n e r g i s t i ce f f e c to fc y t o k i n e sm a yq i n gh a ob i ej i as o u p c o n t a i n i n gs e r u mi n d u c e d ，e n h a n c e ds e c r e t i o no fav a r i e t yo fb o n em a r r o w s t r o m a lc e l l so fc y t o k i n e s ，t h e s ef a c t o r sc h a n g et h ee n v i r o n m e n tw i t h i n t h eb o d y ，e v e n t u a l l ya f f e c t i n gt h ed cc e l l st h ek i l l i n ge f f e c to nk 5 6 2 ； f r o mt h ep e r s p e c t i v eo fe x p e r i m e n t a ld a t aw a ss u p e r i o rt oa l l o g e n i ct c e l l k i l l i n go fa u t o l o g o u st - c e l l - k i l l i n g r a t ea sat u m o ri m m u n ee s c a p e m e c h a n i s m so fl e u k e m i ai sm a i n l yl e u k e m i ap a t i e n t s a f t e rr e m i s s i o n c y t o t o x i ctc e l l si ns e v e r ei m p a i r m e n tr e l a t e dt ol a r g es a m p l et e s tf o r f u r t h e rs t u d y t h eg r o u po nt h ek 5 6 2c e llk illi n ge f f e c to fb o t h ，b u to n t h ee x p e r i m e n t ，t h ee f f e c to fa n t i t a r g e tr a t i oa n dt h er a t eh a v e n o c e r t a i nr e g u l a r i t y ，w h i c h i s r e p o r t e d i nt h el i t e r a t u r et a r g e t c y t o t o x i c i t yc o m p a r e dw i t ht h ee f f e c tt h ei n c r e a s eo fd i s c r e p a n c i e sa f t e r t h ee x p e r i m e n t st ob e s t u d i e df u r t h e r 5 f r o mt h ee x p e r i m e n td a t a ，q i n gh a ob i ej i as o u pl o ws e r u mc o n t a i n i n g d r u g sb m s c si n d u c t i o nd o s eg r o u pt r a i n i n g ，d cs p e c i f i c i t yc e l l ss u r f a c e a n t i g e ne x p r e s s i o nr a t ea n dh i g hd o s eg r o u p ，n o tb e c a u s e o f i n c r e a s e d d o s e sa n t i g e n ，q i n gh a ob i ej i as o u pd r u gt h a ts e r u mc o n t a i n i n gl o wd o s e o ft h i se x p e r i m e n ti sp r o b a b l yt h eb e s tc o n c e n t r a t i o n ，b u ti nt h eg r o u p t oa c t i v a t et - c e l l sk 5 6 2c e l lo fc o n v e n t i o n a lt u r t l es h e l ls o u pa n dh i g h ， m e d i u ma n dl o wd o s e so fb e t w e e nw i t h o u tc e r t a i nr u l e s ，s ol o wd o s e s o f q i n gh a ob i ej i as o u pm e d i c a t e dw h e t h e rs e r u mf o ro p t i m a lc o n c e n t r a t i o n s t illn e e d st ob ef u r t h e rs t u d i e d c o n c 】u s io n ： 6 b m s c si m p a c ts o u r c eo fd c st d b m n c ，d c sa c t i v a t etl y m p h o c y t e sc o u l dk i l l k 5 6 2c e l lt u m o rs p e c i f i c i t y k e y , o r d s ：q i n gh a ob i ej i as o u p 、a m l - c r 、b m s c s 、d c 7 妒馨垂弗 。 十 矗” 贵阳中医学院学位论文 1 - 翮f青 微小残留病( m i n i m a lr e s i d u a ld i s e a s ei nl e u k e m i a ，m r d l ) 是指白血 病患者经过正规的放化疗后，根据目前所确定的疗效标准取得完全缓解( c r ) 后体 内仍残存微量白血病细胞的状态，这也是很多c r 期患者及长期处于c r 期的患者 难免复发的原因。目前化疗仍是治疗急性白血病主要的方法，有效、规律的化疗 能杀灭绝大多数白血病细胞，但不能达到完全杀灭。现代医学对微小残留白血病 研究已深入开展，但在治疗上尚缺乏突破，免疫治疗是当前的研究重点。骨髓基 质细胞对白血病细胞的抗原提呈是否有影响，是否对树突状细胞的诱导、功能产 生影响，中药干预基质细胞对d c 是否产生影响值得深入研究。 中医强调辨证与辨病论治相结合的整体观念，在治疗多因素相关的复杂病症 中，中医具有一定的优势。就中医方面来讲急性白血病缓解后微小残留病变的基 本病机为正气虚弱、余毒留伏阴分。而清除伏毒为微小残留病白血病治疗的重要 目标，以期能够延缓白血病的复发，寻找有效的治疗方法及有效的药物、方剂。 中医药的毒副作用较小或无毒副作用，因此从中医角度探讨微小残留病的治疗方 法无疑有着重要意义。中医药的的抗肿瘤免疫治疗的机理，及如何利用中医药调 节抗肿瘤免疫，值得进一步研究。 本课题通过血清药理药方法，研讨青蒿鳖甲汤能否通过干预a m l c r 患者 b m s c s 从而对其骨髓单个核细胞来源的d c 诱导作用产生影响，探求透毒法对急 性白血病的可能治疗机制。 8 贵阳中医学院学位论文 正文 文献研究 微小残留白血病治疗中的地位 血病( m i n i m a lr e s i d u a ld i s e a s ei nl e u k e m i a ，m r d - l ) 是指 白血病患者经过正规的现代治疗后取得完全缓解( c r ) 后体内残存微量白血病细 胞的状态，这也是很多c r 期患者复发的重要原因。而骨髓基质细胞( b o n em a r r o w s t r o m a lc e l l s ，b m s c s ) 和细胞外基质共同组成骨髓微环境，是造血干细胞进行 生长、分化与自我更新的重要场所，是骨髓微环境的重要组成部分，并且跟造血 细胞进行密切的接触，可分泌细胞外基质及多种细胞因子从而参与调节造血n 】。 b m s c s 与m r d - l 的形成有关密切联系，是研究m r d - l 治疗值得重视的内容。 1 1 基质细胞与微小残留白血病的关系 。2 骨髓基质细胞对造血细胞的增值、分化有重要的调节作用，白血病病人不仅 仅有造血细胞的恶性克隆性增值，且其结构和功能都会有改变m 。在异常骨髓 造血微环境中，基质细胞可能也出现异常，从而引起造血细胞的恶性克隆和增殖， 最终导致急性白血病的复发。这可能跟骨髓基质细胞对骨髓造血细胞的增值的调 节作用有关。g r e e n b e r g e r 瞻羽就对经放射线照射的骨髓基质细胞做了一系列的研 究后发现，骨髓基质细胞分泌的细胞因子出现异常，如转化生长因子b ( t g f - b ) 分泌的增多，能导致活性氧的释放增加，而活性氧又可以使p 5 3 的基因点产生突 变，从而导致细胞恶性变。将经过放射线照射的骨髓基质细胞与未经照射的造血 干细胞共同培养后，发现造血干细胞的表型发生变化，并且细胞因子转录出现异 常。 1 1 1 白血病骨髓基质细胞的损害。 有研究显示白血病骨髓基质细胞对正常造血细胞的支持能力是降低的，且主 要是对未成熟的造血祖细胞c d 3 4 + 、c d 3 8 一的支持能力下降，对成熟的造血祖细胞 的支持能力却反而与正常骨髓基质细胞相似。在对慢性粒细胞性白血病的病人的 骨髓基质细胞对正常造血细胞的影响的观察中发现，其对正常造血细胞的支持作 用明显下降，但这种现象与骨髓基质细胞分泌的细胞因子关系不大h 】。在聚合酶 链反应和荧光原位杂交显示的结果中，发现c i v i l 患者的骨髓基质细胞中有 9 贵阳中医学院学位论文 b c r - a b l 基因阳性的恶性巨噬细胞( c d l 4 + ) 存在，进一步将间质细胞( c d l 4 一) 和巨噬细胞( c d l 4 + ) 分开后，c m l 患者的间质细胞可以像正常基质细胞一样支持 造血细胞，但是将c d l 4 + 巨噬细胞分别加入c m l 间质细胞和正常骨髓基质细胞中， 二者对造血细胞的支持作用则均受抑制瞄3 。佐证了白血病患者的骨髓基质细胞对 正常造血细胞的支持能力是降低的。 在应用组织化学、免疫组织化学染色等多种方法观察a l 患者的骨髓活检标 本中，发现a l 患者的网球蛋白是增加的，f n 、酸性粘多糖呈减低趋势，中性粘 多糖在初诊未治患者中是增高的，在难治复发患者中是降低的；根据病情追踪观 察的结果，可以看到未缓解患者和完全缓解后复发的患者骨髓基质中，f n 、酸性 粘多糖、中性粘多糖均有不同程度的改变；基本上骨髓基质f n 与造血细胞增值 在正常对照组中呈正相关，在a l 中则呈负相关。 1 1 2白血病骨髓基质细胞对白血病细胞的保护 白血病病人的骨髓基质细胞对白血病细胞的保护也是导致白血病复发的重 要原因，白血病病人骨髓基质细胞及其分泌的因子能够抑制某些化疗药物诱导的 白血病细胞的程序性死亡，并且能将部分的白血病细胞进行保存，使其处于静止 状态而不易被化疗药物所杀伤，而保存于基质细胞层中的耐药细胞很可能就是白 血病复发的根源。有实验研究表明将白血病细胞放置在骨髓基质细胞表层后，在 电镜下可以见到白血病细胞很快就粘附在基质细胞上，并与之形成紧密的连接， 甚至在基质细胞中形成细胞索嘲，在细胞接触处还可看到桥粒样的结构，其表面 也可以见到明显的变化，最有特点的就是细胞膜可以内陷形成微小的凹窝口1 ，这 就是为白血病细胞的保存提供场所的地方。 1 1 3 骨髓基质细胞支持白血病细胞的增值、分化和迁移 正常的骨髓基质细胞可以分泌多种和造血相关的细胞因子，比如：g m - c s f 、 i l - 6 及i l - 3 等正性的调节因子和t n f 、t g f - b 等负性的调节因子，其分泌细胞 因子途径是多样的，可以是自发的，可以为其他细胞因子诱导所产生，亦可以由 白血病细胞的粘附而诱导产生。但是白血病骨髓基质细胞分泌细胞因子是异常 的，分泌的这些因子对白血病细胞的作用亦是极其复杂的，它既可以是支持作用， 亦可为抑制作用，或者协同或者拮抗，还可以被逐级放大，形成复杂的细胞因子 网络。有研究显示，a l 患者骨髓基质细胞就存在量和质的异常，其中t n f a 的 i o 贵阳中医学院学位论文 异常分泌可能就是导致白血病细胞增殖的一个很重要的因素嘲。在a m l 患者骨髓 基质细胞中表达的i l - 1b 和i l 一6 m r n a 均较正常的骨髓基质细胞要高，但也可以妇 分泌和正常骨髓基质细胞一样的t g f b 、g m - e s f 、i l 一7 等细胞因子嘲。把依赖、 骨髓基质细胞的小鼠粒细胞性白血病细胞h s - 1 和基质细胞相粘附后，可以诱导 基质细胞分泌出i l - l a 、i l - 1 1 ，从而促进h s - 1 的增值，并且可以测出h s - 1 细 胞表面的i l - l a 受体和i l - 1 1 受体表达增加n 帕。 白血病细胞在骨髓造血微环境中的迁移对白血病细胞的形成和分化亦有重 要意义，骨髓基质细胞分泌的有些细胞因子，对表达e x c r - 4 的造血细胞有趋化 作用，可以诱导造血细胞穿过骨髓基质细胞或者在骨髓基质细胞中进行迁移m 。 7 在急性淋巴细胞白血病的研究中发现白血病细胞的趋化作用与细胞表面表达的 c x c r - 4 水平是呈正相关关系的，对不表达的e x c r - 4 的白血病细胞是没有趋化吸 引作用的。粘附分子，如：v l a - 5 等也参与到了白血病细胞在骨髓基质细胞中的 气移过程叭1 。 囊。三 -_+舢 1 1 4 骨髓基质细胞使白血病细胞减少凋亡、增强抗药性 一。 ” 目前，化疗仍是急性白血病的主要治疗方法，作用机理是通过药物杀灭白血 ：。： 病细胞或者诱导白血病细胞分化、凋亡从而达到治疗白血病的目的，有研究表明 骨髓基质细胞可以使白血病细胞凋亡减少，抗药性增强。在将白血病细胞单独进 行体外培养时，其很快就会发生凋亡，但是如果加入某些细胞因子如i l - 4 , ：干 扰素等则可以阻止白血病细胞的凋亡，使其在体外长时间的生存。在没有外源 性细胞因子参与的情况下，将慢性淋巴细胞性白血病( e l l ) 细胞直接放置于骨 髓基质细胞上，发现e l l 白血病细胞凋亡减少、存活增多n 妇。b - e l l 患者的白血 病细胞和骨髓基质细胞接触后所致的凋亡减少是通过b1 和b2 整合素、v l a 一4 、 v l a 一5 以及其配体r e a m - 1 和i c e - 1 所介导的，并且在骨髓基质细胞的作用下， 细胞内抗凋亡的基因b c l - 2 表达里增高趋势，表明b c l - 2 表达和b e l l 白血病细 胞的凋亡有相关性n 朝。氢化可的松诱导的c l l 患者在骨髓基质细胞的作用下，其 白血病细胞凋亡减少n 刁。 可见，白血病患者骨髓基质细胞发生了结构及功能的改变，在异常的造血环 境中，白血病细胞恶性增殖、分化与迁移，保护白血病细胞，为其提供“避难所 ， 并减少其凋亡，增加抗药性，可能是形成微小残留自血病，并最终导致白血病的 贵阳中医学院学位论文 复发的重要原因。 1 2 骨髓基质细胞在免疫提呈方面的影响 随着现代化疗方法的发展、新的化疗药物的研究开发和造血干细胞移植的大 量运用，白血病的缓解率有了很大的提高，其中有的病例已经治愈，但是进行多 疗程的放、化疗，甚至造血干细胞移植后，许多患者的机体免疫系统遭到了严重 的破坏，导致机体不能对残留的白血病细胞进行有效的免疫监视及清除，而致复 发。而在整个机体免疫过程中，树突状细胞有着重要的作用，它可以将白血病细 胞的肿瘤的特异性抗原提呈给t 淋巴细胞，从而发挥免疫监视的功能，对白血病 细胞进行有效的免疫监视并将其清除，而骨髓基质细胞通过分泌细胞因子和粘附 分子亦参与到肿瘤抗原提呈的过程中。 免疫反应的产生首先是抗原被抗原提呈细胞( a f c ) 所捕获，并将其加工处理 后再将信号传递给t 、b 淋巴细胞，从而引发一系列的免疫应答反应。树突状细 胞是连接抗原与免疫应答细胞的桥梁，能激发有效的抗肿瘤免疫应答反应，是 c d 8 + t 细胞介导的原发性和继发性的免疫应答的激发者，是迄今为止人体功能最 强大、最具免疫治疗活力的抗原提呈细胞，是唯一一个能够刺激初始t 淋巴细胞 增殖的免疫细胞。它能诱导原发的和继发的免疫应答，激活辅助t 淋巴细胞( t h ) 和细胞毒性t 淋巴细胞( c t l ) ，从而克服对肿瘤抗原的自身耐受性，以产生强大 的抗肿瘤反应，同时分泌细胞因子以及抗原肽小体，完成免疫调节功能。 有研究n 田表明白血病细胞的h l a 抗原及协同刺激分子表达的缺陷是导致白 血病细胞虽然有肿瘤特异抗原的表达，但却不能激发有效的特异性抗白血病的t 淋巴细胞应答反应的主要原因。目前认为b m s c s 影响抗原提呈和调节免疫反应的 机制为：b m s c s 具有独特的免疫表型n 门，其不表达m h c l l 分子和c d 4 0 ，导致它 很难被免疫系统所识别，但b m s c s 却能通过间接分泌某些对免疫应答起负调控的 可溶性细胞因子，如t g f - b 等，从而形成免疫抑制的微环境。虽然b m s c s 能通 过与t 细胞的直接接触，抑制t 淋巴细胞的分化增殖n 刖，但是n 鲫对t 淋巴细胞的 增殖抑制是非m h c 限制的，其抑制反应是通过与脾细胞共同培养后激活的b m s c s 分泌可溶性因子产生的，对免疫抑制效应的调节则是通过c d 8 + 调节细胞来实现 的。有实验啪3 证实功能正常的单核巨噬细胞型骨髓基质细胞具有抗原提呈的功 能，m h c i i 类分子和b 7 2 分子在其抗原提呈过程中发挥了重要作用。在将b m s c s 1 2 贵阳中医学院学位论文 与k 5 6 2 细胞共同培育后，结果发现共育组k 5 6 2 细胞生长缓慢，几乎无明显的指 数生长期，这提示b m s c s 具有潜在的抗肿瘤作用，张明徽n 朝提出经肿瘤抗原刺激 后分泌的t n 卜q 可能是骨髓基质细胞抑制白血病细胞生长的重要因素，并将骨 髓基质细胞的体内抗肿瘤作用归于两方面的因素：( 1 ) 预激的骨髓基质细胞在体 内诱导出特异性的抗肿瘤免疫功能。( 2 ) 抗原预激后的骨髓基质细胞的直接抗 肿瘤作用，从而推断出，抗原预激后的骨髓基质细胞在体内可以通过直接杀伤效 应和间接诱导产生特异性的免疫应答来发挥抑制肿瘤的作用，证实骨髓基质细胞 对白血病细胞具有直接抑制效应，而f a s f a sl 系统则是在其中发挥了重要的作 用陋，证明通过f a s 蛋白传入凋亡信号可以使靶细胞发生凋亡。 目前已有人证明b m s c s 在体外以及异基因移植的体内模型中，均具有免疫调 节的功能恤1 。b m s c s 因为具有强大的多向分化潜能慨铷和独特的免疫调节作用而 在细胞治疗学领域日益受到重视。有实验显示基质细胞与髓系白血病细胞通过直 接的相互作用调节髓系白血病细胞的增殖以及分化，并且对髓系白血病细胞的增 殖和分化的调节能力比外源性分化诱导的能力强，表明基质细胞为髓系白血病细 胞提供了特定的增殖、分化的微环境阱1 。正常人基质细胞可明显的诱导白血病细 胞株h l 一6 0 分化，并抑制其增殖，证明基质细胞的免疫调控作用对肿瘤的预防及 肿瘤细胞逆转录等都具有重要的意义汹1 。因此，除了对造血支持作用以外，功能 正常的骨髓基质细胞在清除白血病细胞中亦是至关重要。 2 透毒法是微小残留病重要治法 在目前西医对微小残留病的尚无有效治疗手段的今天，中医治疗急性白血病 取得了较大的进展，已经成为治疗急性白血病的一个重要方式，明显提