食品中有毒有害物质的快速检测方法PPT课件.ppt

1,第一节农药残留的快速检测第二节兽药残留的快速检测第三节真菌毒素及化学污染物的快速检测第四节致病微生物的快速检测第五节食品中异物的检测方法,第二章食品中有毒有害物质的快速检测方法,2,一、何为快速检测,快速检测没有经典的定义，而是一种约定俗成的概念，即：包括样品制备在内，能够在短时间内出据检测结果的行为称之为快速检测。,3,二、快速检测的时间概念,理化快速检验方法：包括样品制备在内，能够在两小时以内出具检测结果，即可视为实验室快速检测方法。如果方法能够应用于现场，在30分钟内出具检测结果，即可视为现场快速检测方法。如果能够在10几分钟甚至几分钟内得到检测结果，可视其为比较理想的现场快速检测方法。微生物快速检验方法：与传统检验方法相比，能够缩短1/2或1/3的检测时间，就可得到检测结果,可视为快速检测方法。,4,第一节农药残留的快速检测,农药是指用于消灭、控制危害农作物的害虫、病菌、鼠类、杂草、及其它有害动植物和调节植物生长的药物。,5,按用途分九种：杀虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀鼠剂、杀菌剂、除草剂、脱叶剂、植物生长调节剂。农药残留：农药使用后残存于生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、毒代谢物、降解物和杂质的总称，残存的数量称残留量，一般以每千克中有多少毫克表示。农药残留量是施药后的必然现象，但如果超过最大残留量，对人畜产生不良影响或通过食物链对生态系统中的生物造成毒害，则称为农药残留毒性（简称残毒）。,6,目前，我国农药残留较为突出的是蔬菜中的农药残留问题。近年来蔬菜被农药污染的情况有增无减，有机磷农药残留尤为突出。,有机磷农药多为磷酸酯类或硫代磷酸酯：对硫磷（1605）、内吸磷（1059）、马拉硫磷（4049）、乐果、敌百虫、敌敌畏。,7,控制蔬菜中农药残留对人体的危害，最为有效的方法之一是加强对蔬菜中的农药残留检测的力度。传统的农药分析主要依赖于气相或液相色谱等仪器，仪器分析虽然可以检出样品中较微量的农药，但操作复杂、费时费工、检测成本较高。,8,农药残留快速测定方法从反应原理上分为生物法和化学法。生物法:活体生物测定法:使用发光细菌或敏感性家蝇作为测定材料。分子生物学方法:采用免疫反应如酶联免疫反应。生物化学测定法:利用胆碱酯酶抑制原理。,9,农药残留快速测定法从仪器使用上分为：气相色谱仪法液相色谱仪法农药残留分光光度法(抑制率法)目视法(如有机磷农药速测灵法、农药残留试纸法、酶片法)。,10,一、免疫分析技术,常用于农药残留分析的免疫分析技术有：,酶免疫技术,放射免疫技术,RIA,EIA,11,1.放射免疫技术,放射免疫技术是以放射性同位素为标记物的标记免疫分析法,用于定量测定受检标本中的抗原或抗体。基本原理是：采用定量的标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对有限量特异性抗体(Ab)的竞争结合反应。,12,结合型的标记抗原Ag*-Ab(B),游离型标记抗原Ag*(F),放射免疫分析法的原理与方法,13,先将放射性同位素标记已知抗原或抗体，与待检标本反应后，用射线探测仪或闪烁计算器测定射线或射线的放射性强度，根据放射性强度计算标本中抗原或抗体的含量。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达10pg水平。常用于标记的同位素有8H、125I和3H。,14,测定方法与步骤,(1)抗原抗体反应：平衡法。(2)分离结合与游离标记物沉淀剂沉淀复合物，离心分离。(3)放射性测定及数据处理晶体闪烁计数仪(射线)或液体闪烁计数仪(射线)绘制标准曲线，计算待检抗原浓度。,15,液闪仪,16,计数器,但是由于放射免疫分析法需要较昂贵的液体闪烁仪或放射仪，且放射性同位素对工作人员有一定的伤害，废弃物又不易处理，这些不利因素限制了该法的广泛应用。,17,2.酶免疫技术(EIA),酶免疫技术是用酶标记的已知抗原或抗体，检测标本中的相应抗体或抗原，将抗原抗体反应的特异性与酶催化反应的专一性相结合的免疫检测技术。,18,酶联免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbantassay，ELISA）,酶联免疫吸附法是把抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫检测技术。将已知抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯板)上进行酶免疫反应，检测相应的抗体或抗原。应用：食品中毒素的测定、食品有害微生物的快速检测、食品中农药残留的检测、食品中抗生素残留的检测（如氯霉素）,19,ELISA基本原理,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。,20,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,21,ELISA原理图,22,ELISA基本的实验过程,23,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体,在这种测定方法中有3种必要的试剂：,固相的抗原或抗体,酶标记的抗原或抗体,酶作用的底物,24,ELISA的一般操作方法,固相载体的准备：最常用的是聚苯乙烯微量反应板，规格有40孔、72孔、96孔，板孔呈凹型，应用方便。抗原或抗体的包被：将Ag或Ab吸附到固相载体的过程称为包被。固相载体的封闭：固相载体包被Ag(或Ab)后，载体表面可能因残留未吸附蛋白质的活性部位而吸附抗体或酶标抗体，引起试验误差；因此需事先用含0.5BSA-0.05吐温-20的PBS封闭3060分钟（37），以降低非特异性吸附。,25,固相载体的洗涤：洗涤是在整个酶联免疫吸附测定的操作过程中不可缺少的一个步骤，每加一层反应结束后均要洗涤固相载体板，目的在于防止重叠反应引起的非特异性吸附。-常用的洗涤液为：0.02M，pH7.2(或7.4)的PBS(含NaCl0.15M，0.05吐温-20)；洗涤时先将加入的反应液倒干，然后加洗涤液于孔中，泡洗3分钟，重复3次，最后倾去洗涤液，用吸水纸吸干。,26,双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。方法：先将已知抗体吸附在固相载体上，加入待检抗原，再加入酶标记的已知抗体，反应后形成“抗体-抗原-酶标抗体”复合物，最后加入酶的底物显色。应用：常用于检验各种蛋白质等大分子抗原。适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。,双抗体夹心法,27,28,1、已知抗体包被于载体表面,3、加酶标抗体与抗原结合,4、加酶作用的底物产生颜色,2、加待检物抗原与抗体结合,4、加酶作用的底物不产生颜色,双抗体夹心法测抗原,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待检物无抗原与抗体结合,3、加酶标抗体无抗原结合,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,29,原理为标本中的抗原(抗体)和一定量的酶标抗原(抗体)竞争与固相抗体(抗原)结合。方法：用已知抗体(抗原)包被，加入待测血清，再加酶标抗原(抗体)，酶标抗原(抗体)与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：可用于测定抗原和半抗原，也可用于测定抗体。,竞争法,30,竞争法测抗原,+,-,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合,3、加酶作用的底物不显色或显色弱,3、加酶作用的底物显色,1、已知抗体包被于载体表面,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合,31,原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。方法：先将已知抗原吸附在固相载体上，加入待检血清，再加入酶标记的抗抗体，反应后形成“抗原-抗体-酶标抗抗体”复合物，最后加入酶的底物显色。优点：一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用：主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。,间接法,32,33,34,底物显色：必须用反应后能形成水溶溶性色素的供氢体，常用的有邻苯二胺(CPD)，联苯茴香胺，5-氨基水杨酸和邻联甲苯胺。于用前配制避光保存，加入反应孔作用2030min。显色终止：阴性对照孔微微出现颜色，加入终止液（2MH2SO4）,35,结果判定：在白色背景上，用肉眼观察，每批试验均需有阴性对照。颜色反应明显深于对照组者判为阳性。酶标仪测定，待检孔OD值(P)与对照孔OD值(N)的比值(P/N)大于1.5或2.0者为阳性。定量测定：对于抗原的定量测定（如酶标记抗原竞争法），需事先用标准抗原制备一条吸收值与浓度的相关标准曲线，只要测出样品的吸收值，即可查出其抗原浓度。,36,优点:可以通过颜色来快速做定性结果分析;特异性强;灵敏度高;酶标板上一次可作多份样品检测。,37,标记酶要求很高，应具备:纯度高、溶解性高、特异性强、稳定性高;测定方法应简单、敏感、快速;与底物作用后会呈现颜色;与抗体交联后，仍保持酶的活性。,38,最常用的是辣根过氧化物酶(HRP)，它广泛存在于植物界，辣根中的含量尤高。HRP是一种糖蛋白，由酶蛋白和铁啉结合而成，相对分子质量为40000，其底物是二氨基联苯胺(DAB)，DAB经酶解可产生棕褐色沉淀物。因而可用目测或用比色法测定。还有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和-D-半乳糖苷酶等可供应用。,39,3.RIA和EIA技术异同点,相同点：1)RIA与EIA技术的原理基本一致，即抗原与抗体反应，形成抗原一抗体复合物。2)RIA与EIA检测技术都是由反应系统和检测系统组成，不同点：1)RIA技术以放射性同位素作指示剂(标记物)；而在EIA技术中，用作标记物的指示剂为生物酶。,40,2)RIA技术操作过程中检测放射性同位素需要昂贵的仪器设备和防辐射设备，并且需要专业人员。相对于RIA技术而言，EIA技术有更多的优点，如灵敏度高、特异性强、成本低、简便快速、自动化程度高、检测方法多样和安全等。因此，EIA技术，尤其是酶联免疫吸附分析技术(ELISA)，已成为目前使用最普及的免疫分析技术。,41,目前，国外已研制出几十种农药的酶免疫检测试剂盒，包括有机磷类、氦基甲酸酯类、硫代氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类及酰胺类等。美国使用的ELISA试剂盒对有机磷农药普遍的最小检出浓度达20pg/kg，对氨基甲酸酯类农药普遍的最小检出浓度达300ug/kg。免疫检测试剂盒使用起来简便、快速，操作人员不需经过特殊培训，样品不需净化或只需简单的净化。,42,二、生物化学测定法,生物化学测定法包括农药速测卡法、农药速测片法、农药残留分光光度计法。运用胆碱酯酶抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的一种快速现场检测方法。,农药残留速测仪,43,1.农药速测卡法农药速测卡法又称农药残留试纸法、酶试纸法。原理：胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯(红色)水解为乙酸靛酚(蓝色)，有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。,44,蔬菜表面测定法（粗筛法）：擦去蔬菜表面泥土，滴23滴浸提液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。放置10min进行预反应，将速测卡对折后，用手捏3min时，打开与空白对照实验卡比较判定。,分析步骤：,45,蔬菜整体测定法：选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL浸提液，震摇50次，静置2min以上。取23滴浸提液滴在速测卡上，以下操作与表面测定法相同。饮用水中污染农药的检测：直接取23滴加到速测卡上进行操作。,46,中毒残留物中农药的检测：取样品适量于容器中，加入2倍量的乙酸乙酯，充分震摇后静置，取澄清液于蒸发皿中，在水浴上蒸干乙酸乙酯，取1mL磷酸盐浸提液溶解蒸干后的残渣，取残渣溶液23滴于速测卡白色药片上进行检测。,47,结果判定：,48,速测卡法测定结果,与空白对照卡比较,49,2.农药残留分光光度计法又称抑制率法。利用胆碱酯酶原理。在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关系。如果样本提取液中含有有机磷和氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试验中加入的基质就不能被酶水解，从而不显色或颜色变化很小;如果样本提取液中不含有机磷和氨基甲酸酯类农药，酶的活性就不被抑制，试验中加入的基质就被酶水解或少部分水解，水解产物与加入的显色剂反应产生颜色，用分光光度计测定吸光值随时间的变化，计算机出抑制率，就可以判断出蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留情况。,50,51,操作步骤：,样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，檫去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取1g放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲溶液浸没菜叶，每3min摇动一下烧杯，于10min后吸取2.5mL提取液于试管，待测。,52,测定：对照溶液测试：于试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入0.1mL酶液、0.1mL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，于410nm波长下比色，记录反应3min的吸光度变化值或仪器记录值A0。样品测试：于试管中加入2.5mL样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值或仪器记录值At。结果的表述计算：注意：使用速测仪可以直接读出抑制率值，而无须手工计算。,53,结果判定,如现有方法在使用乙酰胆碱酯酶时，抑制率为50%;使用丁酰胆碱酯酶时，抑制率定为70%。,54,优点：具有快速、灵敏、经济的特点，样本无需净化，缩短了检测时间。缺点：1)不能定性定量，只能作为对含有机磷农药和氨基甲酸酯农药残毒的蔬菜进行初筛的一种方法，将一部分含农药残毒的蔬菜控制在市场之外。2)不适宜检测一些含辛辣物质的蔬菜如萝卜、韭菜以及一些如菱白、蘑菇等卤类蔬菜(含有破坏酶活性的物质)。3)对残留量愈大的蔬菜，测定的误差愈小。,55,假阳性是由于酶活性降低或失活，底物不与之反应，从而不能被水解，无法与显色剂结合显色。假阴性是因为某些农药对酶抑制作用很小或无作用而产生的，表现出无农药残留的假象。另外，在反应过程中化学、物理干扰都有可能导致假阳性、假阴性的发生。灵敏度、重复性和回收率相对较差。新方法：酶抑制-生物芯片分析法。,56,由于此方法不能定性定量，所以当测出有残毒的蔬菜时，如果要作为仲裁处理，还应该送往有关部门进一步用气相色谱等实验室仪器进行定性和定量分析，其结果方可作为最终结论性数据。2001年，农药速测卡法和农药残留分光光度计法(抑制率法)被制定为国家标准推荐分析方法，即蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯农药残留量快速检测方法(GB/T5009.199)，2002年公布实施。,57,58,三、化学方法1.农药多残留扫描法(MRSM)传统的农药残留分析，即样本经过提取、净化后用气相色谱、液相色谱等分析仪器进行定性定量分析测定。传统的化学分析仪器法花费的时间长。农药多残留方法是在一次分析中同时测定一种以上农药残留的方法。,59,我国MRSM技术是1999年开始推广的一种对农产品中农药多残留快速扫描技术，简化了传统检测技术的前处理，采用固相萃取，并使用氮吹仪代替常用的旋转蒸发器进行浓缩，大大缩短了分析时间。该法与上面介绍的快速测定方法的区别:(1)使用大型的仪器设备，如气相色谱议和液相色谱仪，脱离不了实验室;(2)可以进行农药残留定性和定量分析;(3)可以进行未知农药残留的测定;(4)可检测各类蔬菜或水果样本中四大类(有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、除虫菊酯类)的农药残留;(5)对各类农药灵敏度均较高。作为仲裁依据；一种实验室快速检测技术。,60,氮吹仪,旋转蒸发器,利用氮气流将溶剂带出样品，一般在加热条件下进行。,用于少量液体的浓缩，蒸汽压较高的组分易损失。不能用于酸、碱物质的浓缩,61,62,2.有机磷农药速测灵法(金属离子催化显色表面皿法)原理是具有强催化作用的金属离子催化剂、使各类有机磷农药(磷酸酯、二硫代酸酯、磷酰胺)在催化作用下水解为磷酸与醇，水解产物与显色剂反应，使显色剂的紫红色褪去变成无色。,63,这种方法操作简便、价格便宜、检测速度快，采用化学反应原理，避免了通常所使用生化方法（酶法）的缺点（酶的制备、保存以及反应需比较严格的条件），灵敏度也达到一定的要求。但主要针对的是有机磷农药的残留检测，特别是甲胺磷、对硫磷农药的定性检测。操作简便、价廉、检测速度快，但是容易受到植物组织液、叶绿体干扰，故只能用于检测叶片、果品表面的农药残留。,64,第二节兽药残留的快速检测,一、传统微生物抑制试验(MIT)兽药残留（residuesofveterinarydrugs）指动物用药后，任何可食动物源性产品中所含有的原型药物或/和其代谢产物，以及与兽药有关杂质的残留。,65,最大残留限量（maximumresiduelimit,MRL）：食品动物用药后，允许存在食物表面或内部的该兽药残留的最高量/浓度（以鲜重计，表示为mg/kg或g/kg）,66,分析大量样品中抗生素的残留物通常采用MIT法。这些方法是建立在活性药物抑制微生物生长能力的基础上。通用的抑制试验是圆盘检验技术。将样品提取液点在接种有试验菌的琼脂上，培养后可测定抗菌药物形成的抑菌圈。抑菌圈表明抗生素的存在，而圈的大小则与抗生素的浓度有关。,67,嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法。国际上公认并作为法定检测食品中抗生素残留的方法首推嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法。利用抗生素培养基接种嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞，把接种培养基6ml倒入各个15mm100mm的培养皿中(平皿需于7天内使用)，纸片直径12.7mm浸渍奶样，放于琼脂中，把平皿于64培养2小时或55培养4小时，培养结束，用毫米游标尺测量抑菌圈直径，阳性结果以16mm为准。本法可进行定量测定，1981年由FDA认可，1982年1月1日起生效为法定方法。,68,69,此法有6项优点:用嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢悬浮物代替藤黄八迭球菌过夜肉汤培养物做试验菌，故性质更稳定，贮存时间更长，可达5-8个月;检测敏感度高，能检出牛奶中青霉素G含量为0.005U/mL;方法简便、快速、省钱，2-4h可出现抑菌圈;不仅能检测青霉素G，还能检测其他多种常用抗生素如氨苄青霉素、氯青霉素和四环素等。可作定量测定;不受消毒剂干扰。,70,TTC法是目前我国食品卫生标准中规定的检测牛奶中抗生素残留的检测方法。原理：细菌生物氧化有方式，即加氧、脱氧和脱电子，相反即还原。当乳中加入嗜热链球菌后，如乳中无抗生素，嗜热链球菌就生长繁殖，在新陈代谢过程中进行生物氧化，其中脱出的氢可以和加在乳中的氧化型TTC结合而成为还原型TTC，氧化型TTC是无色的，还原型TTC是红色，所以可使乳变红色为阴性。相反，如乳中存在抗生素，嗜热链球菌就不能生长繁殖，没有氢释放，TTC也不能被还原仍为无色，被检样保持鲜乳的颜色，即为阳性。,二、氯化三苯四氮唑法(TTC),71,TTC法能检出牛奶中青霉素含为0.004U/mL。日本20世纪50年代TTC法是检测牛奶中青霉素残留的法定方法。该方法1955年4月1日起在我国生效为法定方法。,72,三、酶联免疫吸附剂测定(ELlSA),ELlSA测定法是根据酶标记的抗体或抗抗体来进行的抗原抗体反应。由于酶的专一性催化作用，可使原来无色的底物通过水解，氧化或还原反应而显示颜色。,73,市面上有关欧美针对抗生素残留检测的商品化ELISA试剂盒有许多。英国Randox公司ELISA试剂盒已获AOAC认可。2001年12月21日国家质量监督检验检疫总局推荐英国Randox公司的ELISA试剂盒作为动物激素、抗生素残留的首选筛选试剂。,74,四、放射免疫测定法,RIA测定就是应用放射性物质代替ELISA中的标记酶作为抗体的偶联物，在食品安全快速检测中最常见的同位素是6H和14C。1978年charm氏在RIA技术的基础上发展了放射免疫受体检测技术(RRA)。,75,RRA在检测食品中抗生素残留的原理：(1)每类抗生素族均是在一个母环基础上用不同功能团修饰形成特定功效的抗生素。(2)微生物细胞表面都存在着能与各种抗生素功能基团结合的特异受点(这种高度的专一性类似于抗原和抗体间的专一性)。,76,抗生素抑制细菌生长的能力是由微生物特定位上的附着决定的，并由此打断该细菌的代谢活动。结合反应是在标记的靶参考物(示踪物)与无标记的待测药物(非标记物)之间竞争进行的。测试建立在药物的功能团和微生物细胞专一性受点的结合反应的基础上。,77,此方法将细胞上具有特异性受体点的细菌加到含有6H或14C标记药物的牛奶或组织提取物中，这些加放射标记的药物与样品中所含的药物残留物竞争可利用的细胞受体部位，样品经离心除去上清液，沉淀在-闪烁液重新悬浮，用液体闪烁计数器来测量其放射性。牛奶、血清、鸡蛋、组织中的检测限在低于10-6范围内。,78,在现有的放射性检疫检测方法中，作为快速检测方面最成功的例子，是Charm6600/7600抗生素快速检测系统。该检测系统可以检测动物和鱼类的肌肉组织、蛋类、饲料、蜂蜜、水、水果、蔬菜、谷物等样品。目前Charm7600检测系统就-内酰胺、氯霉素类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、邻氯青霉素及碱性磷酸酶这六项检测已被FDA认可。,79,五、磺胺二甲基嘧啶快速测定,磺胺药物广泛的用作为饲料添加剂，因此残留可能发生在动物源性食品中，例如牛奶和肉类中。特别是致癌性的磺胺二甲基嘧啶给人类的健康带来了威胁。对于磺胺二甲基嘧啶残留的检测，由于微生物抑制分析方法缺乏灵敏度和特异性。高相液相色谱是最常采用的方法。然而HPLC方法的缺点是制备样品要耗费大量时间、并且需要昂贵的实验室设备。酶标免疫分析定量测定磺胺二甲基嘧啶残留方法适于日常大量样品的筛选，特别是近年发展的试剂盒为快速筛选提供了途径。,80,酶标免疫分析定量测定磺胺二甲基嘧啶残留方法适于日常大量样品的筛选，特别是近年发展的试剂盒为快速筛选提供了途径。竞争酶标免疫法可以定性和定量测定牛奶、肉类及肾脏中的磺胺二甲基嘧啶残留。,81,操作步骤：,微孔板包被有针对兔IgG(磺胺二甲基嘧啶抗体)的羊抗体。加入磺胺二甲基嘧啶抗体，磺胺二甲基嘧啶酶标记物，标准或样品溶液。游离磺胺二甲基嘧啶与磺胺二甲基嘧啶密酶标记物竞争磺胺二甲基嘧啶抗体，同时磺胺二甲基嘧啶抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质(过氧化尿素)和发色剂(四甲基联苯胺)加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为收色的产物。加入反应停止液后使颜色为蓝转变为黄色。在450nm处测量，吸收光强度与样品中的磺胺二甲基嘧啶浓度成反比。,82,RIDASCREEN磺胺二甲基嘧啶试剂盒的平均检测下限约为1g/kg。根据样品处理记录，在牛奶中磺胺二甲基嘧啶的检测下限为10g/kg（10ppb）,在肉类及肾脏中磺胺二甲基嘧啶的检测下限为2g/kg(2ppb)，蜂蜜中磺胺二甲基嘧啶的检测下限为1g/kg(1ppb)。,磺胺总量试剂盒是竞争性酶联免疫法，定量检测蛋、肉（鸡肉和猪肉）、鱼、虾、蜂蜜和奶类样品中的磺胺类药物总量。,83,快速、高通量兽药残留检测系统,生物芯片法英国Randox公司evidenceinvestigator系统：是以生物芯片技术为核心，集合免疫学原理和高灵敏的化学发光技术，通过对单个微量样品进行多种检测项目组合的定量检测，提供高通量、高精度的实验结果。快速出报告：这是目前世界上最快的分析系统，可在2小时内完成对540个样品的分析，每个样品的检测项目达6-12种；真正实现多通道检测：一次可检测54个样品，每个样品可同时检测6-12种成分；,84,六、盐酸克伦特罗快速测定,1.简介瘦肉精学名为盐酸克伦特罗。盐酸克伦特罗为克伦特罗的盐酸盐形式，用于药名又称克喘素。它属于-肾上腺素类激动剂类，是一种交感神经末梢的介质。可增强代谢、加快心跳和增强血管收缩和扩张气管，临床上用于治疗哮喘。,瘦肉精,85,上世纪80年代初，美国脂胺公司研究人员意外地发现，将一定量的盐酸克伦特罗加入饲料中，能够改变营养物质的代谢途径，促进动物肌肉特别是骨胳肌蛋白质的合成，同时抑制脂肪合成，从而促进动物生长，增加瘦肉率。根据试验得出，在饲料中添加适量的盐酸克伦特罗，可以提高饲料转化率、生长速率、瘦肉相对增加10以上，于是这项技术开始在养殖业中大行其道。,瘦肉精用于养殖的发现,86,作用机理,它的主要作用机理是作为一种强效激动剂，选择性的作用于肾上腺素2受体上，激活腺苷酸环化酶(cAMP)，使环磷腺苷增加，加强脂肪分解，促进蛋白质合成，实现动物营养再分配，故又将瘦肉精称作“生长促进剂(growthpromoter)”和营养“重分配剂(repartitioningagent)”。,87,2.痩肉精危害,可增强脂肪代谢，减慢蛋白质分解代谢，可显著提高饲料转化率和瘦肉率。瘦肉精性状稳定，加热到172以上分解，一般的家庭烹饪很难去毒。中毒临床表现有：心跳过速、心慌、精神紧张、肌肉震颤、肌肉疼痛、头疼、晕眩等。若长期食用，有可能导致染色体畸变，诱发恶性肿瘤。有心脏病、高血压、甲亢等患者可能食用后会有生命危险。,88,2001年8月22日，广东信宜市510人因食用残留盐酸克伦特罗的猪肉而中毒，其中51人出现严重的中毒现象。11月7日广东省河源市484人，也都因食用含有盐酸克伦特罗的猪肉或猪肝而中毒。,动物性食品中毒案例,89,但当前瘦肉精却屡禁不止，原因之一就是国内外检测CLB的方法手段还不够完善，还没有建立宰前监测体系和准确迅速方便精确的检测方法，从而使不法分子有机可乘。,当前现状,90,盐酸克伦特罗一般使用HPLC或GC-MS进行测定，但是其前处理步骤繁琐且费用昂贵。盐酸克伦特罗测定试剂盒则是一种有用的筛选方法，可用在检测尿、肌肉、肝脏等的盐酸克伦特罗残留。RIDASCREENClenbuterolFast(克伦特罗测定试剂盒)是非常有用的筛选方法。竞争酶标免疫法定量测定尿、肌肉、肝脏及牛眼中的克伦特罗（Clenbuterol）。,91,测定原理,测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对兔IgG（克伦特罗抗体）的羊抗体。克伦特罗抗体被加入，经过孵育及洗涤步骤后，加入克伦特罗酶标记物，标准或样品溶液。克伦特罗与克伦特罗酶标记物竞争克伦特罗抗体，没有连接的克伦特罗酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量，吸收光强度与样品中的克伦特罗浓度成反比。,92,一般含盐酸克伦特罗的猪肉色特别鲜红，脂肪非常薄，肉皮紧贴着瘦肉，瘦肉纤维比较疏松，肉皮与瘦肉之间几乎无肥肉(肥膘厚度不到1.5cm)一般健康肉淡红色肉质弹性好通过这种感官识别方法就可以快速简单定性对动物性食品中有无CLB作出初步判定。缺点：只是一种经验的判断，不够准确,感官识别,93,第三节真菌毒素及化学污染物的快速检测,一、食品中真菌毒素的快速测定真菌及真菌毒素污染食品后，引起的危害：真菌引起食品变质真菌产生的毒素引起的中毒,94,真菌毒素的快速分析方法主要有：亲和色谱法酶联免疫吸附法,95,亲和色谱法是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。酶联免疫吸附测定法(ELISA)是一种将抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来用于检测的免疫技术。-既可用于检测抗原，又可检测抗体，ELISA法可进行定性和定量测定。,96,1.黄曲霉毒素快速分析技术黄曲霉毒素是主要由黄曲霉(aspergillusflavus)寄生曲霉(a.parasiticus)产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。黄曲霉毒素的相对分子量为312-346。难溶于水,易溶于油,甲醇,丙酮和氯仿等有机溶剂,但不溶于石油醚,己烷和乙醚中。一般在中性溶液中较稳定,但在强酸性溶液中稍有分解,在pH9-10的强碱溶液中分解迅速。其纯品为无色结晶,耐高温,黄曲霉毒素B1的分解温度为268,97,1993年黄曲霉毒素被食品卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物,是一种毒性极强的剧毒物质，其毒性相当氰化钾的10倍，砒霜的68倍。黄曲霉毒素属肝脏毒，抑肝脏蛋白质的合成，引发不同类型的肝脏疾病。严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见,其毒性和致癌性也最强。,98,黄曲霉毒素的种类和结构目前已发现的黄曲霉毒素相关化合物有B1、B2、G1、G2、B2a、G2a、M1、M2、P1等十二种左右。基本结构都是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，即结构中含有一个二呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的主要分子型式含B1、B2、G1、G2，M1、M2等。其中M1和M2主要存在于牛奶中。B1为毒性及致癌性最强的物质。B1和G1的二呋喃环末端有双键。二呋喃环末端有双键者毒性较强并有致癌性。其中B1毒性及致癌性最强。B1在食品中的污染最广泛，对食品的安全性影响最大，在食品卫生监测中，以它作为污染指标。,99,各种黄曲霉毒素的结构,100,（1）免疫亲和柱法,原理：试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液经过过滤，稀释后，用免疫亲和柱净化，以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来，在淋洗液中加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度，然后用荧光分光光度计进行定量；也可以将甲醇-黄曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中，对黄曲霉毒素B1,B2,G1,B2分别进行定量分析。免疫亲和柱是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上，然后装柱而成。该方法的测定范围0-300ug/kg。,101,黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法克服了TLC和HPLC法在操作过程中使用剧毒的黄曲霉毒素作为标定标准物，极少使用有机溶剂，操作方便，耗时少。一个样品只需10-15min,比传统方法快几个小时甚至几天时间;仪器设备轻便容易携带,自动化程度高,操作简单,直接读出测试结果,可以在小型实验或现场使用。可以进行黄曲霉毒素总量(B1B2G1G2)的测定,检测限可达到1ug/kg,达到黄曲霉毒素标准限量值以下测定范围为1-300ug/kg.,102,免疫亲和柱荧光分光光度法,1.程序试样经过甲醇水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)总量。,103,2.分析步骤,(1)提取大米、玉米、小麦、花生及其制品:准确称取经过磨细(粒度小于2mm)的试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及甲醇一水(7+3)至125.0mL(V1)，以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0mL(V2)滤液并加入30.0mL(V3)水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1-2次，至滤液澄清，备用。植物油脂:准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加人5.0g氯化钠及加入甲醇一水(7+3)至125.0mL(V1)，以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0mL(V2)滤液并加入30.0mL(V3)水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1-2次，至滤液澄清，备用。,104,(2)净化1)大米、玉米、小麦、花生及其制品、植物油脂:将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确移取15.0mL(V4)样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2mL-3mL空气通过柱体。以10mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2mL-3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL(V)色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min-2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。,105,(3)测定,1)荧光光度计校准在激发波长360nm，发射波长450nm条件下，以0.05mol/L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值为0.0g/L;以荧光光度计校准溶液调节荧光光度计的读数值为20.0g/L。2)样液测定取上述净化后的甲醇洗脱液加入1.0mL0.002%溴溶液，混匀，静置1min，按上述条件进行操作，于荧光光度计中读取样液中黄曲霉毒素B1+B2+G1+G2)的浓度C(g/L)。3)空白试验用水代替试样，按提取和净化步骤做空白试验。4)结果计算,106,酶联免疫吸附剂（ELISA）试剂盒是依据GB/T5009.22-2003第二法的原理制成的，测定的实质是采用酶标记的抗体或抗原与样品中的抗原或抗体间进行的抗原抗体反应，加入显色液后，通过目测观察颜色来做快速的半定量的结果分析。测定原理：样品中的AFTB1经提取、脱脂、浓缩后与定量的特异性抗体（抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体）反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原（AFB1-BSA人工抗原）结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较测定含量。,（2）酶联免疫吸附剂（ELISA）,107,所用抗原抗体：抗体：抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体（或抗血清）包被抗原：黄曲霉毒素B1与载体蛋白（牛血清蛋白）的结合物酶标二抗：羊抗鼠IgG与辣根过氧化物酶结合物,108,测定步骤：1.样品中AFB1的提取,(1)大米和小麦（脂肪含量3.0）：样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250m1具塞锥形瓶中。准确加入60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中，立即取12mL滤液（相当4.0g样品）于75mL蒸发皿中。65水浴通风挥干。用2.0mL甲醇一PBS(20+80)分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。,109,(2)玉米（脂肪含量3.05.0）：样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中,待分层后，放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯内，从中取10.0mL（相当于4.0g样品）于75mL蒸发皿中,以下按上述“65水浴通风挥干”起，依法操作。,110,(3)花生（脂肪含量15.0-45.0）：样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加入100.0mL甲醇水(5545）溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于100mL烧杯内，从中取20.0mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）。放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一并于蒸发皿中，以下按上述“65水浴通风挥干”起，依法操作。,111,(4)植物油：用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL甲醇水(5545）溶液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼油4.0g样为4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再加溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层甲醇水溶液于750mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下按自“65水浴通风挥干”起，依法操作。(5)其它食品：可按照GB5009有关章节提供的方法操作，最终提取物（相当于4.0g样品）应收集于2.0m1甲醇一PBS(2080)中。,112,2.间接竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA),(1)包被微孔板：用AFB1-BSA人工抗原包被酶标板，100L/孔，4过夜。(3)封闭：已包被的酶标板用洗液洗3次，每次3min后，加封闭液封闭，250L/孔，置37下1h。,113,(3)抗体抗原反应：将黄曲霉毒素B1纯化单克隆抗体稀释倍后分别a.与等量不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液用2mL试管混合振荡后，4静置。此液用于制作黄曲霉毒素B1标准抑制曲线。b.与等量样品提取液用2mL试管混合振荡后，4静置。此液用于测定样品中黄曲霉毒素B1含量。酶标板洗33min后，加抗体抗原反应液，以抗体稀释液为阴性对照，空白对照，130L/孔，37，2h。,114,(4)酶标记反应：酶标板洗33min，加酶标二抗(1200，V/V)100L/孔，1h。(5)显色反应：酶标板用洗液洗53min。加底物溶液(10mgOPD)加25mL底物缓冲液加37L30%H2O2，100L/孔，37，15min。(6)终止：加2mol/LH2SO4，40L/孔，以终止显色反应。(7)测定：酶标仪490nm测出OD值。,115,3.数据处理及计算结果,(1)求出各孔的0D校正值：0D校正值OD实测值一空白对照孔0D值（均值）。(2)求出待测样的0D值：0DOD校正值/阴性对照孔0D校正值（均值）100。(3)求出待测样AFB1含量（ngg）：在标准竞争抑制曲线上找到待测样0D值（座标Y值）的对应点，该点座标X值的反对数（10 x）即为样品中AFB1的含量（ngg）,116,免疫亲和柱法和酶联免疫吸附法虽然都可达到快速简便效果,但酶联免疫吸附法仅能检测单一毒素(如黄曲霉毒素B1)含量,而且易出现假阳性结果,难以控制。免疫亲和柱法(包括荧光光度法和HPLC法)却能达到既定量准确又快速简便的要求。,117,（3）金标试纸法,利用竞争性免疫分析原理设计。氯金酸在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。,118,胶体金检测条在临床诊断中广泛使用。方法成熟，使用简便。关键是制备单克隆抗体，然后与胶体金交联，在亲水纸层析条上固定。,119,检测原理:将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。,120,试纸条由样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和样品吸收垫四部分组成(下图)。,121,操作流程：,122,A：阴性。对照线(C)和测试线(T)同时存在，表明样品中无黄曲霉毒素。B：阳性。只有对照线(C)，无样品测试线(T)。表明样品中含有高浓度的黄曲霉毒素。C：无效结果。对照线(C)和测试线(T)都不存在。,A：阴性,B：阳性,C无效结果,样品处理,比色,123,该方法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法。由此产生的一步式AFT快速检测纸法可在5-10min完成对样品中AFT的定性测定。借助AFT标准样品，能估算AFT的含量，非常适用于现场测试和进行大量样品时初选，实现快速检测的目的。,124,2.黄曲霉毒素M1快速测定技术黄曲霉毒素M1，是动物摄入黄曲霉毒素B1后在体内经经基化代谢的产物，黄曲霉毒素M1的毒性和致癌性与黄曲霉毒素B1的基本相似。快速测定法：免疫亲和柱净化一荧光计测定法。免疫亲和柱净化一高效液相色谱法。,125,(1)免疫亲和柱净化一荧光计快速测定法试样经过离心、脱脂、过柱后，滤液经过结合有黄曲霉毒素M1特殊抗体的免疫亲和柱净化，此抗体对黄曲霉毒素M1有专一识别能力，黄曲霉毒素M1键合在分离柱中的抗体。用甲醇-水(10：90)将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇-水(80:20)通过分离柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。衍生化后的洗脱液于荧光光度计中测定黄曲霉毒素M1。,126,适用于测定牛奶、奶粉，以及低脂牛奶、脱脂牛奶、黄曲霉毒素M1的含量。奶粉中的最低检测限是0.08g/kg，牛奶中的最低检测限是0.008g/kg。,127,试样通过免疫亲和柱时，黄曲霉毒素M1被提取，亲和在固体支持物上。当样品通过亲和柱时，抗体选择性地与所有存在的黄曲霉毒素抗原结合，形成抗体-抗原复合体。用淋洗液将亲和柱上的黄曲霉毒素M1洗脱下来，收集洗脱液。用液相色谱仪(HPLC)测定洗脱液中黄曲霉毒素M1含量。,128,赭曲霉毒素的检测方法包括:酶联免疫吸附法薄层色谱法HPLC免疫亲和柱-荧光法免疫亲和柱-HPLC法等。酶联免疫吸附测定法有直接法和间接法。,3.赭曲霉毒素快速检测技术,129,伏马菌素的检测方法主要有:免疫亲和柱免疫亲和-HPLC法毛电泳电泳法液相-质谱法,4.伏马菌素的快速检测,南非与中国某些地区食管癌高发与吃此类毒素污染的玉米有关,130,二、食品中金属污染物的快速检测微波溶样快速测定法,微波加热是直接通过物质吸收微波能量来达到快速加热的目的，用密闭容器又能同时获得高温、高压，这样不仅能提高反应的速率，而且还可以提高试样的分解能力，以达到理想的消解效果。在微波体系中，样品分解要受到许多复杂因素的影响，其中样品溶剂的选择非常重要。大多数无机酸都是良好的微波吸收体，某些酸在密闭容器中经微波作用后其稳定性、蒸汽压等性质都会引起不同的变化适合于原子吸收光谱分析中的样品预处理。,131,将密封微波溶样技术与原子吸收光谱分析紧密地结合起来可以实现快速准确测定金属污染物。密封微波溶样技术作为一种样品预处理手段，可以使这一过程更加快速、准确、安全。,132,样品经微波消解后，注入原子吸收分光光度计石墨炉中，电热原子化后吸收283.3nm共振线，在一定浓度范围，其吸收值与铅含量成正比，与标准系列比较定量。,1.食品中铅的快速检验微波消化-原子吸收分光光度法,133,2.食品中镉的快速检验微波消化-原子吸收分光光度法样品经微波消解后，注人原子吸收分光光度计石墨炉中，电热原子化后吸收228.8nm共振线，在一定浓度范围，其吸收值与镉含量成正比，与标准系列比较定量。,134,样品经微波消解后，在酸性介质中，样品溶液中的砷与硼氢化钾或硼氢化钠