（生物化学与分子生物学专业论文）乳源球菌菌株的多相分类鉴定.pdf

摘要 对9 株乳源球菌株( 5 株乳酸乳球菌、3 株嗜热链球菌和1 株无乳链球菌) 进行菌株水平上 的多相分类鉴定。通过m r s 固体平板培养基反复划线和形态学观察进行菌株的分离纯化，包 括菌落观察、苗体细胞壁革兰氏染色的光镜观察和菌体常规磷钨酸负染色标本的透射屯镜观 察，并采用依据乳酸乳球菌( l a c i o c o c c u s l a e g i s ) 和嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s ) 菌种水平上的生化代谢莘异设计的牛化试验和基于差异代谢的关键酶编码基因序列的差异设 讣引物的特异性p c r 以及r a p d 对这9 株乳酸茁进行鉴定。依据苗落年n 菌体细胞的大小差异 划线分离得到l l 株乳酸菌；通过透射电镜观察，描述各曲体的大小、形状以及裂殖方式：生 化试验得到了2 个发酵型，将其鉴定为2 个菌群( 乳酸乳球菌乳酸亚种和嗜热链球菌) ，而特异 性p c r 扩增在菌株水平卜将其鉴定为9 株菌( 6 株乳酸乳球菌、2 株嗜热链球菌，f l i 株无乳链球 菌) ，与r a p d 鉴定结果( 2 0 个随机引物的r a p d 筛选也得到了9 个不同的基因型) 一致。此外， 本实验还获得了2 个乳酸乳球菌的种特异性p c r 弓f 物l e l a m y l f r $ 1 1 l e l m a p a 2 f r 、2 个嗜热链 球菌的种特异性p c r 引物s n 9 1 9 p f r 和s 锄n y l f r 以及乳酸乳球菌乳酸亚种( l f = 1 c l o c o c c z t s l a c 加5 幻口l a e t i s ) 株a s l1 9 3 6 的株特异性p c r 引物l c l a n 1 y y v r ，并推测其叶淀粉酶基因 ( a m y y ) 与其他乳酸乳球菌株之间存在序列若异。 本实验进行功c f 。c o c c 瑚i o e t i s 和s i r e p l o o o f t t 8t h e r m o p h i l u s 菌种菌株的表型特性及其分子 水平的研究，首执比对茛基于菌种水平分类的代谢酶编码基囡的序列，设计菌种水平的特异 性p c r 引物做出这些菌种不同菌株的p c r 鉴定，并以1 株经证实己应用于牛乳发酵的 s t r e p t o c o c c u sa g a l a c t i a e 作为对照，以达到更加可靠的分娄和鉴_ 5 | ；f i 。为l a c t o c o c c u sl a c t i s 和 s t r e p t o e 卯c 螂t h e 胛n o p h i l u s 的相关科学研究和：亡业化生产提供理论种技术基础，并为其他乳酸 菌的分类鉴定提供参考。 关键词乳酸乳球苗；嗜热链球菌；电镜：生化鉴定；代训酥基幽；p c r ：r a p d 。，。，! 。，! ：至些至兰尘兰茎兰璧圭兰堡墼，! ! ， p o l y p h a s i ct a x o n o m ym e t h o d sf o ri d e n t i f i c a t i o no fm i l k d e r i v e dc o c c u ss t r a i n s a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , p o l y p h a s l et a x o n o m yi d e n t i f i c a t i o no f 9m i l kd e r i v e dl a c t i ca c i d c c i ds t r a i n sr 5 l a c l o c o c c t sl a c t i ss t r a i n s ，3s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u ss t r a i n sa n d is t r e p t o c o c c u sa g a l a c t i a e s t r a i n ) w e r es t u d i e d t h es t r a i n sw e r ei s o l a t e db ym r sp l a t e s t r e a k i n g c u l t i v a t i o na n d m o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n ，i n c l u d i n gc o l o n yo b s e r v a t i o n ，l i g h tm i c r o s c o p ee x a m i n a t i o nb a s i n go n t h eg r a ms t a i n i n go f t h es t r a i n sc e l lw a l l a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( e m ) e x a m i n a t i o n b a s i n go nt h en e g a t i v es t a i n i n gb yp t a a n dw e r ei d e n t i f i e db yb i o c h e m i c a le s s a y sb a s i n go nt h e b i o c h e m i c a lm e t a b o l i s md i l y e f e n c e sb e t w e e nl c 1 a c t i sa n d 皿i h e r m o p h i l u s s p e c i f i cp c rw h i c h p r h n e r sw e l - ed e s i g n e db a s i n g ont h es e q u e n c ed i f f e r e n c e sa m o n gt h e i r g e n e sc o d i n gt h e s e b i o c h e m i c a lm e t a b o l i ck e ye n z y m e s a n dr a p dt h er e s u l t so f p l a t es t r e a k i n gc u l t i v a t i o nw e r e1i s t r a i n sa c c o r d i n gt o t h es i z e so f t h e i rc o l o n i e sa n dc e l l s ；t h es i z e ，s h a p ea n ds c h i z o g a n e s i ss t y l e so f e v e r ys t r a i nw e r eo b t a i n e db yt e mo b s e r v a t i o n ；a n dt h er e s u l to fb i o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o nh a d2 d i s t i n c tf e r m e n t a t i o nt y p e sw h i c hc l a s s i f i e dt h e s es t r a i n sa s2m i c r o b i a lp o p u l a t i o n 。o n ew a s c 1 a c t i ss u b s pl 口c t i s ，a n df i l eo t t m rw a ss t t h e r m o p h i i u s ；t h ep c ra m p l i f i c a t i o n sc l a s s i f i e dt h e s e s t r a i n sb9s t r a i n s ，w h i c hw a sc o n s i s t e n tw i t ht h er a p dr e s u l t o n eo fw h i c h2 0r a n d o mp r i m e r s o b t a i n e d9d i s t i n c tg e n o t y p a st o o ，t h e9s t a i n sw e r e6l cl a c t i ss t r a i n s ，2s tt h e r m o p h i l n ss t r a i n s a n d1s t a g a l a c t i a es t r a i n i na d d i t i o n 、2s p e c i e s - s p e c i f i cp c r p r i m e r so f l cl a e t i sw h i c hn a m e d l c l a m y l f ra n dl c l m a p a 2 f rr e s p e c t i r e l yw e r ea c q u i r e d ，a n ds t , l h e r m o p h i l u st o o ，s t t g l g p f r a n ds t l a m y l f - rr e s p e c t i v e l y , a n de v e no n es t r a i n s p e c i f i cp r i m e r sn a m e dl e l a m y y p ro f ll a c t i s s u b s pl a c t i s a s l1 9 3 6 w h i c h m i g h t l o s sn u c l e o l i d e s i n i t s “一a m y l a s e g e n e ( a r n ，w e r eg a i n e d p h e n o t y p i ct r a i t so f z cl a c t i sa n ds tt h e r m o p h i l u ss t r a i n sw e r ei n v e s t i g a t e da tm o l e c u l a ri e v a l t h es p e c i e s s p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e df i r s tl i m eb ya l i g n i n gs e q u e n c e so ft h eg e n e sc o d i n g m e t a b o l i ce n z y m e st oi d e n t i f yt h e ma tt h el e v e lo fs t r a i n s ，a n das t a g a l a c t i a es t r a i nw h i c hh a s b e e na p p l i e a t e dt oy o g h o r tw a sa sc o n t r o lw eh o p et h i sm e t h o dw i l lo f f e rt h e o r e t i c a la n dt e c h n i c a l f a n d a m e n tf o rc o r r e l a t i v er e s e a r c ha n di n d u s t r i a l i z a t i o no fl cl a c t da n ds t , t h e r m o p h i l u s a n d p r o v i d er e f e r e n c ef o ro t h e rl a c t i ca c i db a c t e r i aa n de v e no t h e rm i c r o o r g a n i s mi d e n t i f i c a t i o n k e yw o r d s ：l a c l o c u c c t l 7l a c l ；s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s ；e l e c t r o nm i c r o s c o p e ； b i o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o n ；m e t a b o l i ce n z y m eg e n e ；p c r ；r a p d p o s 培r a d o a t e ：w a n gt i n g z h u s p e c i a l i l y ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f g a ox u e j u n 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包台其 他人已经发表或撰写过的研究成果或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签名 磋私 日期：2 0 0 6 年6 月1 5 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交沦文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阋。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 学位论文作者签名：砂f 氆 日期：2 0 0 6 年61 5 日 导师 签名：焉孑豸 日期：2 。6 年6 月1 5 日 1 1 乳酸菌概述 乳酸菌( 1 a c t i ca c i db a c t e r i a , l a b ) 是一大类缺乏细胞色素、糖代谢主要以乳酸为终产物 的革兰氏阳性非芽孢细菌，其过氧化氢酶反应为阴性、耐氧耐酸、营养要求复杂并且严格发 酵。l a b 这个名称就分类学而言实属一个非正式、非规范的名称。目前从自然界中已发现的 这类细菌在分类学上至少可划分为2 3 个属，涉及到的有关种属则更多，其代表性的种属有乳 杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、气球菌属、肉杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、 酒球菌属、足球菌属、四体球菌属和漫游球菌属等( j ec h r i s t e n s e n 1 9 9 9 ) 。 人类认识l a b 的历史可以追溯到1 9 0 8 年，当年的诺贝尔生理学及医学奖得主俄国细菌 学家梅契尼可夫( m e t c h n i k o f f ) 将他的长寿理论发表在生命的延长( t h ep r o l o n g a t i o no f l i f e ) 一书中，他认为大肠健康的人身体才会健康，人类的大肠里本来就有许多腐生菌会产生各种 毒素使人生病，使人类的寿命减少如果每天吃保加利亚的优酪乳( y o g u r t ) ，y o g u r t 中的乳 酸杆菌( 即指现在的德氏乳杆菌保加利亚亚种) 会取代肠道中不好的腐生茁，使肠道维持良 好的消化能力，这样人类就有可能活到一百五十岁。很快就引起了全世界对y o g u r t 的兴趣。 虽然m e t c h n i k o f f 的长寿理论至今还有许多论点并未被确认，但是1 9 6 0 年开始的许多国际性 研究，陆续证实了y o g u r t 确实具有特定的保健功效。 目前已知有2 0 0 多种l a b ，其中最知名的是德氏乳杆菌保加利亚亚种( l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s ) 和嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s ) ，在本世纪初首先自 y o g u r t 中被分离出来。根据国际上的定义，商品化的y o g u r t 中一定要使用这2 个菌种。相当 多的l a b 是益生菌，其作为益生菌有如下依据：其属于肠道正常菌群，对人和动物的健康是 有益的( a lm c c a r t n e y , 2 0 0 2 ) 。 乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ，l b ) 是l a b 中最重要的种属之一，在全世界的工业应用中占 有重要的作用，目前已有1 1 9 个种的乳杆菌被描述。德氏乳杆菌( l bd e l b r u e c k i i ) 群包括许 多动植物源性发酵食品： 业中重要的l a b ，如瑞士乳杆菌( l bh e l v e t i c u s ) 和嗜酸乳杆菌( 6 a c i d o p h i l u s ) 以及常用于蔬菜发酵的德氏乳杆菌德氏亚种( l b d e l b r u e c k i is u b s p d e l b r u e c k i i ) 和用于乳品：i ：业的肋d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s 和德氏乳杆菌乳酸亚种( l b d e l b r u e c 胁 s u b s pl a c t i s ) ，后两者与其它微生物，如s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s 、l b h e l v e t i c u s 和肋 a c i d o p h i l u s 一起广泛地应用于y o g u r t 以及乳酪的制造工业中( gg i r a f f a 1 9 9 8 ；gg i r a f f a , 2 0 0 3 ) 。最近fd e l l a g l i o ( 2 0 0 5 ) 从印第安人的乳制品中分离出4 株乳杆菌，经鉴定将其命 名为德氏乳杆菌的一个新的亚种肋d e l b r u e c k i is u b s p # t d i c u s 。干酪乳杆菌群包括干酪乳杆菌 ( l b c a s e d 、类干酪乳杆菌( l bp a r a c a s e i ) 、鼠李糖乳杆菌( l b ，r h a m n o s u s ) 和玉米乳杆菌 ( l b z e a e ) 。l b c a s e i 和l b r h a m n o s u s 虽然不属于乳品工业中主要的发酵剂菌群，但也含 有许多重要的益生菌株，如肪c a s e is h i r o t a 和肪r h a m n o s u sg g ，它们可见于初乳中，特别 是在成熟乳酪中大量存在( m dc o l l i n s ，1 9 8 9 ；l j hw a r d ，1 9 9 9 ) 。此外，肋r h a m n o s u s 与牙 齿溃疡密切相关( br i c h a r d ，2 0 0 1 ) 。植物乳杆菌群包括植物乳杆菌( l b p l a n t a r u m ) 、戊糖 乳杆菌( l b p e n t o s u s ) 和类植物乳杆菌( l b p a r a p l a n t a r u m ) ，它们对于动植物和鱼类源性 东北农业大学理学硕士学位论文 发酵食品是很重要的，如青贮饲料( ts a n d 鸭2 0 01 ) ，此外，矗p l a n t a r u m 也可引发苹果乳 酸的发酵和未发酵葡萄汁的酸败，既可降低葡萄酒的酸度。改善其品味和风味，也在很少的 情况下降解酒石酸产生挥发性酸，而引起酸败( gs p a l l o ，2 0 0 2 ) ，在酒发酵过程中还有其他 的酸败乳杆菌，如i n 金山乳杆菌( l b s a n f r a n s c i s e u s i s ) 和类短乳杆菌群的短乳杆菌( l b b r e v i s ) 、海格乳杆菌( 上矗h i l g a r d i i ) 和布氏乳杆菌( l bb u c h n e r i ) ，其中后2 者也见于酵 母、发酵淀粉、乳酪、橄榄发酵和青贮饲料中。此外，6b r e v i s 也可见于食品( 尤其是乳品) 中( t g u a r n e r i ，2 0 0 1 ；l r o s s e t t i ，2 0 0 1 ) 。 双歧杆菌属( b i f i d o b a c t e r i u m ，置) ，基因组g + c 含量高于5 0 ，属内有3 1 个有重要宿主 特异性的菌种，尽管有报道说可从污水、厌氧消化物和发酵乳中分离到某些双歧杆菌，但是 其主要生境还是人和动物肠道，b i f i d o b a c t e r i u m 是人肠道微生物区系的常见细菌，占成年人总 体粪样微生物区系的比例高达8 3 ，在婴儿肠道所占的比例更大( 在以母奶抚育的婴儿中可 高达9 1 ) 。青春双歧杆菌( 丑a d o l e s c e n t i s ) 、链状双歧杆菌( 丑c a t e n u l a t u m ) 、假链状双 歧杆菌( 口p s e u d o c a t e n u l a t u m ) 和长双歧杆菌( 日l o n g u m ) 是肠道菌群中4 种主要的双歧杆菌 种，因此常常做为粪便污染的指示( rt e r e s a , 2 0 0 2 ；rt e m m e r m a n 2 0 0 3 ；vd e l c e n s e r i e 2 0 0 4 ) 。 同乳杆菌属一样，双歧杆菌属也是在食品工业中占有很大比例的益生菌。近年来，对双歧杆 菌的研究很多，主要是一些益生菌种，其在益生乳产品和干燥食物补充剂的应用越来越广泛， 目前研究的重点仅仅是肠道双歧杆菌( mt a k a h i r o ，2 0 0 4 ) 。利用动物双歧杆菌( 口口h 咖口凰) 、 1 3 1 0 n g u m 、两歧双歧杆菌( 丑b i f i d u m ) 和婴儿双歧杆菌( b i n f a n t i s ) 作为益生菌发酵剂培养 物，是因为它们在大肠中的重要作用，即调节p h 值和抑制许多潜在病原体和腐败菌的生长( v m a r c o ，2 0 0 1 ) 。乳双歧杆菌b 1 2 ( 丑l a c t i sd s m1 0 1 4 0 ) 是y o g u r t 分离株，可作为益生菌应用 于婴儿食品中，其高度抗氧化，并可释放出大量甲酸，有不寻常的耐氧耐酸性( vm a r c o ， 2 0 0 2 ) 。 链球菌属( s t r e p t o c o c c u s , s t ) 在分类学上可以分成6 个簇群，有化脓群、牛群、唾液群、 突变群、m i l l e r i 群和缓症群。至少包括6 8 个菌种，其中以唾液群的嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s ) 研究的最为深入，其余的菌种都为条件致病菌或者致病菌，如化脓群的无乳链 球菌( s t r e p t o c o c c u sa g a l a c t i a e ) 和缓症群的肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e ) 。s t t h e r m o p h i l u s 是商品化的y o g u r t 中必不可少的l a b 菌种之一，其与肋d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s 存在一个共生关系，是s t r e p t o c o c c u s 中唯一的益生菌种( pc l a i r e ，1 9 9 8 ) 。 乳球菌属( l a c t o c o c c u s , l c ) 在系统发生上与链球菌属关系密切，基因组g + c 含量低， 当前公认的有5 个菌种：乳酸乳球菌( l c 1 a c t i s ) 、格氏乳球菌( l c g a r v i e a e ) 、植物乳球 菌( l c p l a n t a r u m ) 、棉籽糖乳球菌( l cr a f f i n o l a c t i s ) 和l a c t o c o c c u sp i s c i u m ，乳球菌可见 于各种环境中，在农业、兽医、医学以及食品工业中是很重要的。乳酸乳球菌是实验室研究 的最为深入的微生物之一，广泛的用于l a b 的生理学研究。其有3 个亚种，乳酸乳球菌乳酸 亚种( 以l a c t i s s u b s p 1 a c t i s ) 和乳酸乳球菌乳脂亚种( l al a e t i s s u b s p c r e m o r i s ) 在世界范围 内广泛应用于食品发酵剂，它们在发酵乳工业特别是在乳酪制作的产香、产粘过程中具有重 要的作用，可为凝乳形成和风味产生提供最佳的条件，且都是动物源性和乳牛场环境来源； 而乳酸乳球菌霍氏亚种( l c 1 a c t i ss u b s p h o r d n i a e ) 与昆虫有关。乳酸乳球菌的一些菌株可产 生细菌素，如n i s i n 、l a c t o c c i n 和b a c t e r i o c i n 等，其中n i s i n 可作为无毒的天然食品防腐剂得 2 到广泛应用。l c g a r v i e a e 和l cp i s c i u m 是鱼养殖业中新出现的病原体，c g a r v i e a e 可引起 鱼的败血病和膜性脑炎，与牛的乳房炎和人的感染也有关系，可分离于其他动物以及农田土 壤中，研究表明，鱼病肠球菌( e n t e r o c o c c u ss e r i o l i c i d a ) 与其是同物异名体。l cp l a n t a r u m 参与冷冻豆在解冻过程中的酸败；l cr a f f i n o l a c t i s 分离于未灭菌的牛奶、菜园的胡萝h 、鹅 和牛的胃肠道以及乳牛场生境中。此外，乳球菌也很容易与肠球菌混淆，如( z yp u ，2 0 0 2 ) 。 其他菌属中还有明串珠菌属( l e u c o n o s ，o c ) 的菌株有可见于蔬菜发酵( 如泡菜) 以及乳 制品起始培养物中的报道。 1 2 乳酸菌鉴定的常规方法 细菌的鉴定是指鉴定某一未知细菌，通过对其各种特征( 包括表型的和基因型的以及系 统发育型的) 的分析比较，鉴定它属于细菌分类体系中的哪一类、哪一种菌，按国际通用名 称予以定名。用于细菌分类鉴定的常规方法有很多。 多相鉴定是综合某一细菌未知菌株的多种性状，经分析比较后，进行对该菌株的鉴别和 定名( 凌代文等1 9 9 9 ) 。 1 2 1 乳酸菌的形态学观察 乳酸菌的形态学观察是进行微生物研究不可缺少的研究手段，包括如下3 种方法：1 菌 落特征的观察。菌落的形态随培养基的组成、培养时间和温度的变化而发生变化，所以利用 菌落形态认识乳酸菌时务必考虑这些因素：2 光学显微镜观察。这需要对菌体细胞进行染色， 革兰氏染色法是细菌鉴定中晟重要的一个染色法，它主要是由于革兰氏染色阳性细菌和革兰 氏染色阴性细菌的细胞壁结构差异，对结晶紫。碘复合物的渗透性不同，而形成染色阳性或染 色阴性反应：3 电镜观察。电子显微镜观察菌体形态及其表面结构都是通过扫描电镜或菌体 细胞磷钨酸负染色的透射电镜进行的( 刘振明等2 0 0 2 ；龙小海，2 0 0 2 ) ，也有进行超薄切片 的透射电镜研究茁体的内部结构( 袁肖寒等2 0 0 5 ) 。 1 2 2 乳酸菌的生化鉴定 生化特征的测定，包括氧化酶、葡萄糖的氧化发酵测定、糖类或醇类的发酵试验、乙醇 的氧化、乙酸的氧化、产氨试验、硝酸盐还原试验、脲酶测定、哼哚产生试验、氨基酸脱羧 酶测定、明胶水解等3 0 种方法( 凌代文等1 9 9 9 ) 。生化鉴定是依据表型特征进行微生物学鉴 定的主要组成部分，曾在细菌鉴定中占有重要的地位，其最佳的辨识力是进行菌种水平的鉴 定，但是由于操作麻烦并且容易被污染，一度限制了其在分类学的应用，随着细菌微量生化 鉴定管以及可自动化的生化鉴定条( 如改良的a p ii d 3 2 链球菌检测系统s t r e ps y s t e m ) 的研 发上市，又改变了这一趋势，但受辨识力所限，生化鉴定也仅仅作为多相分类学鉴定的一个 重要组成部分( ca n d r i g h e t t o ，1 9 9 8 ) 。 东北农业大学理学硕士学位论文 1 3 伯杰氏细菌鉴定手册关于乳源球菌的分类描述 在乳酸菌的分类学上，乳酸球菌均分布在肠球菌科( e n t e r o c o c c a c e a e ) 、乳杆菌科 ( l a c t o b a c i l l a c e a e ) 、明串珠菌科( l e u c o n o s t o c a c e a e ) 以及链球菌科( s t r e p t o c o c c a c e a e ) 中， 共1 6 个菌属。其中乳源性的乳酸球菌即应用于优酪乳和发酵乳工业中的乳酸球菌，主要集中 在链球菌科( s t r e p l o c o c c a c e a e ) 中的乳球菌属( l a c t o c o c c u s ) 和链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 中，即乳酸乳球菌种( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 和嗜热链球菌种( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) ， 下面就这2 个菌属在伯杰氏细菌鉴定手册中的描述作一总结( j gh o l g1 9 9 4 ；凌代文等 1 9 9 9 ) 。 链球菌属：细胞球形或卵球形，直径o 5 2 “m ，当生长在液体培养基中时，常常成对或 成链，有时在链的轴向上延长成柳叶刀形。不运动，不形成芽孢，革兰氏染色阳性，有些菌 种形成囊粒，兼性厌养，化能异养菌，营养要求丰富，有时还需要5 的c 0 2 。发酵代谢， 主要产生乳酸，但不产气，触酶反应为阴性，通常溶血，呈绿色( 溶血) 或完全透明( 肛 溶血) ，生长温度为2 5 4 5 ，最适温度3 7 。寄生于脊椎动物，主要栖息在口腔和上呼 吸道上，有些菌种对人和动物是致病的，血清型不固定，需确切鉴定。 乳球菌属：细胞球形或卵球形，直径0 5 1 5 1 a m ，当生长在液体培养基中时，常常成对 或成短链，不形成内生孢子，革兰氏染色阳性，不运动，不形成荚膜，兼性厌养，化能异养 菌，发酵代谢，发酵大量的碳水化合物主要产生l ( + ) 乳酸，但不产气，营养要求复杂，触 酶反应为阴性，氧化酶反应阴性，最适温度3 0 ，i o 生长，但是4 5 不生长，也不生长 于0 5 的n a c i 溶液中，血清型通常为n 群，可见于乳品和植物中。 1 4 乳酸菌鉴定的分子生物学方法 至今，乳酸菌鉴定仍沿用传统方法，主要是形态学观察、革兰氏染色和糖发酵试验。但 是也普遍意识到表型分析的一些缺点，例如重现率及辨识能力低、相似的表型特性并不等同 于相似的或者关系密切的基因型( a lm c c a r t n e y , 2 0 0 2 ) 。表型试验所固有的可能问题是，不 是每一给定种内的所有菌株都有一个兆同的性状，而且即使是同一菌株也可能呈现出一定的 生化变异性。此外，实验操作的一点改变也可能产生错误的结果。因此基于表型试验的常规 技术并不能对乳酸菌株作出明确的鉴定( pc l a i r e ，1 9 9 8 ) 。一般来讲，准确地鉴定乳酸菌至 种的水平，至少需要1 7 种表型实验( g w t a n n o c k , 1 9 9 9 ) ，但是微生态系统的分离株需要更 为简单快速的鉴定方法。因此，需要进行表型特性的分子水平研究和遗传特性的研究，以达 到更加可靠的分类和鉴别。随着对乳酸菌基因组结构及系统发生关系的了解，分类学也发生 了变化( ts o i l e ，1 9 9 9 ) 。 4 引言 1 4 1 乳酸菌的特异性p c r 鉴定 特异性p c r ( s p e c i f i cp c r ) ，即是依据某( 某些) 乳酸菌株的己知( 同源) 基因序列 设计菌株( 菌种菌属菌群) 特异性的p c r 引物，扩增后产生排他性的唯一条带，据此做出 鉴定。p c r 的特异性取决于引物与模板核苷酸序列的特异性结合，即模板核苷酸顺序的特异 性，因此靶序列的选择起着决定性的作用。 目前，多是以蛋白酶编码基因作为靶序列进行鉴定引物的设计，且多为菌种( 含亚种) 水平的，如j cl e 等( 1 9 9 5 ) 比较各种l a b 的组氨酸脱羧酶基因( h d c a ) 的核甘酸序列，设 计了群特异性引物，可以鉴定出所有可使组氨酸脱羧的l a b ：f jp i c a r d 等( 2 0 0 4 ) 基于 s t r e p t o c o c c u s 延伸因子( t u ) 编码基因( ，m 力序列设计了链球菌属特异性的p c r 引物。ti g a r a s h i 等( 2 0 0 0 ，2 0 0 4 ) 先后基于聚糖酶基因( d e x ) 序列设计了远源链球菌( ss o b r i n u s ) 、变形链 球菌( sm u t a n s ) 以及汉毛链球菌( 叠d o w n e i ) 的3 个菌种的种特异性p c r 引物；m gf o r t i n a 等( 2 0 0 1 ) 分别依据氨基肽酶c 基因( p e p c ) 、氨基肽酶n 基因( p e p n ) 以及胰蛋白酶样丝 氨酸蛋白酶基因( h t r a ) 的特异性序列区域设计了3 对种特异性的p c r 引物，可进行瑞士乳 杆菌种的鉴定；ts a n d r a 等( 2 0 0 1 ) 通过比对三扛p l a n t a r u m 、l bp e n t o s u s 和肋p a r a p l a n t a r u m 的重组酶基因( r e c a ) 序列，选择4 个区域设计种特异性p c r 引物，1 个反向引物是同源的 共有序列，3 个上游引物可单独作为引物应用于不同的3 个菌种特异性的p c r 鉴定试验中： oo k w u m a b u a 等( 2 0 0 3 ) 基于谷氨酸脱氢酶基因( g d h ) 序列设计了猪链球菌( 皿s u i s ) 种 特异性p c r 引物；n dc o r r o l e r f i 等( 1 9 9 9 ) 依据组氨酸生物合成操纵子( h i s t i d i n eb i o s y n t h e s i s o p e r o n ) 序列设计了l cl a c t i s 亚种特异性的p c r 引物，可将l c 1 a c t i ss u b s pl a c t i s 和l c 1 a c t i s s u b s p c r e m o r i s 鉴别开来( 后者的扩增子长度多出约2 0 0 b p ) ；而sg a r d e 等( 1 9 9 9 ) 依据 n - 乙酰溶菌酶基因( a c m a ) 序列设计特异性p c r 引物，也将l c 1 a c t & 在基因型上鉴定到亚 种水平，即除了1 个11 3 l b p 的特异扩增子外，l cl a c t i ss u b s p 1 a c t & 较之l c 1 a c t i ss u b s p c r e m o r i s 还多出1 个约7 0 0 b p 的额外扩增子。ts a n d r e 等( 1 9 9 9 ) 以脯氨酸亚氨基肽酶基因 ( p e p s ) 为靶序列设计了上6 d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s 的亚种特异性引物，扩增得到了 1 0 6 5 b p 的特异性片段，但是在扩增6d e l b r u e c k i i s u b s p 1 a c t i s 时却意外地也得到l 条约1 6 0 0 b p 的片段，验证后发现其可特异性地扩增l b d e l b r u e c k i is u b s p 1 a c t i s ；sl i c k 等( 2 0 0 0 ) 根据 6d e l b r u e c k i i 中与枯草杆菌a d d a b 基因极为相似的d n a 序列设计了3 个引物对，可分别特 异性地检测扛d e l b r u e c k i i 及其两个亚种肋d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u 和6d e l b r u e c k i i s u b s pl a c t i s ；p b r i g i d i 等( 2 0 0 3 ) 也设计出了s t t h e r m o p h i l u s 菌种特异性引物以及b i n f a n t & y l 和短双歧杆菌b r e v e ) y 8 菌株特异性的p c r 引物。 随着1 6 sr r n a 基因及其结构的发现，认为其可作为遗传标记的靶序列，称之为“细菌化 石”，所以其在分类学上的应用也越来越泛，多是依据1 6 sr d n a 可变区设计特异性引物， 与1 6 sr d n a 保守区域引物协同使用，进行菌种水平的鉴定，己鉴定的菌种包括l 6 r h a m n o s u s 、l bc a s e i 、三6 p a r a c a s e i ( l j hw a r d 1 9 9 9 ) 、l b b r e v i s ( tg u a m e r i ，2 0 0 1 ) 、l b p l a n t a r u m 、发酵乳杆菌( l bf e r m r n t u m ) 、罗伊乳杆菌( l br e u t e r i ) 、唾液乳杆菌( l bs a l i v a r i u s ) 、 丑i n f a n t & 、且a n i m a l & 、b 1 0 n g u m ( dr o y , 2 0 0 0 ) 、s t a g a l a c t i a e ( im e i r i - b e n d e k ，2 0 0 2 ) 、 b a d o l e s c e n t & 、b d e n t i u m ( xb o n j o c h 2 0 0 4 ) 和l c 1 a c t & ( jp r o d e l a l o v a , 2 0 0 5 ) ；也有l 对 东北农业大学理学硕士学位论文 引物都是依据1 6 sr d n a 保守区域设计的，这样即可进行更为广阔范围的l a b 鉴定，如s g o t o 等( 2 0 0 4 ) 设计l e u c o n o s t o c 菌属特异性的p c r 引物，sn a k a n o 等( 2 0 0 4 ) 依据1 6 sr d n a 设计群特异性引物检测乳杆菌属和足球菌属的耐醋酸性乳酸菌。 特异性p c r 用于乳酸菌的种属鉴定是很方便直观的，但是用于种属之内的菌株鉴定却很 麻烦，因为随着进化距离的降低，同源基因( 包括r d n a ) 的多样性也不是很有效的，关系 接近菌株的遗传关系也不容易做出准确的界定。研究表明，1 6 s 2 3 sr r n a 内在转录间隔区域 序列( i n t e r g e n i cs e q u e n c e s ，i t s ) 能够克服这个问题，尤其是在进行多重特异性p c r 或者是 单一特异性p c r 后再进行扩增子的限制酶分析更可得到灵敏的结果( at i l s a l a - t i m i s j a r v i ， 1 9 9 7 ；gm o s c h e t t i ，1 9 9 8 ；ts o i l e ，1 9 9 9 ；vm a r c o ，2 0 0 1 ) ，因为i t s 区域的进化压力较小，所 以可以提供更大的遗传变异。 1 4 2 乳酸菌的鼬廿d 鉴定 随机扩增d n a 多态性( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 是利用短的随机引 物( 通常为1 0 m e r ) 随机扩增乳酸菌基因组d n a ，进行扩增片段的分离后即可给出一个清 晰可辨识的指纹，即一个r a p d 基因型。r a p d 足一个简单快速廉价的方法，但是其重珊陛 低，主要是因为反应条件的小小变化就可引起图谱的改变，因此r a p d 必须在可控制的条件 下进行，只有进行小心仔细的操作才能够确保结果的可重复性( a lm c c a r t n e y , 2 0 0 2 ) 。 己证实r a p d 分型用于大多数乳酸菌种内和种间特异性鉴定的可靠性( ts o i l e ，1 9 9 9 ； l j hw a r d 1 9 9 9 ；nh a y a s h i 2 0 0 1 ；gs p a n o 2 0 0 2 ) 。事实上，r a p d 是用于分析食品相关乳酸 菌中最广泛的技术，其辨识力仅仅低于脉冲场凝胶电泳( p u l s e d - f i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s ，p f g e ) 分析( g b l a i o t t a , 1 9 9 8 ) ，更适用于菌株水平的l a b 快速鉴定( ds a m a r z i j a , 2 0 0 2 ；靳淼等2 0 0 3 丛玉婷等2 0 0 4 ；pq u e n e e ，2 0 0 5 ；jp r