（遗传学专业论文）不同光照条件下钝顶螺旋藻蛋白质组学及代谢途径研究.pdf

目录 中文摘要2 英文摘要4 1 引言7 2 材料与方法8 2 1 基因组随机文库的构建8 2 2 基因组序列拼接与注释1 0 2 3 钝顶螺旋藻总蛋白的提取1 1 2 4s d s p a g e 凝胶电泳1 2 2 5 双向凝胶图像分析及m a l d i t o fm s 蛋白鉴定1 3 3 结果：1 4 3 1 钝顶螺旋藻基因组分析1 4 3 2 二向蛋白电泳及蛋白鉴定1 6 3 3 差异表达蛋白及其代谢途径分析1 7 4 分析与讨论2 5 4 1 糖酵解途径和糖异生途径2 5 4 2 戊糖磷酸途径_ 2 7 4 3 光合作用及c 0 2 的固定2 8 4 4 蛋白翻译后修饰3 0 4 5 脂类合成3 0 4 6 胞外被膜的生物合成及分泌3 1 4 7 氨基酸生物合成。3 1 4 8 核苷酸代谢3 1 4 9 辅助因子3 2 4 1 0 其他蛋白3 2 5 小结与展望3 3 参考文献3 5 附录j 3 9 致谢4 0 综五匕4 1 学位论文独创性声明5 6 温州医学院硕士学位论文 不同光照条件下钝顶螺旋藻蛋白质组学及代谢途径研究 中文摘要 【目的】本项研究在完成的钝顶螺旋藻全基因组测序的基础上，利用蛋白组学 技术( 2 d p a g e 和m a l d i t o fm s 技术) ，进行钝顶螺旋藻不同光照条件下的 蛋白表达谱分析，探索钝顶螺旋藻对外界光条件的响应。运用比较蛋白组学分析 蛋白表达的差异，追踪并进一步鉴定这些差异蛋白，且定位到基因组相应的o r f 上，寻找出一些重要o r f 的功能信息。另外，我们将追踪这些差异蛋白在胁迫环 境下是如何协调各自的代谢调控网络，将有助于拓展对蓝藻的蛋白组学和系统生 物学的研究。本研究将为后续的研究奠定了基础，即利用集胞藻p c c6 8 0 3 作为 蓝细菌遗传转化系统的模式生物，进行差异表达蛋白的功能验证，进而研究螺旋 藻代谢途径调控网络的分子基础。 【方法】对已完成的钝顶螺旋藻基因组用g l i m m e r 3 0 2 进行o r f 预测，根据序 列相似性进行功能注释，并根据c o g 进行蛋白分类及功能研究。分别提取光照 和黑暗条件下培养的钝顶螺旋藻总蛋白，经2 d p a g e 分离出各蛋白组分，银染 后，进行u n a xp o w e r l o o k2 1 0 0 x l 扫描仪获得图像，利用i m a g e m a s t e r2 d p l a t i n u m5 0 程序分析找出差异表达蛋白点。通过显著性分析，我们挑选出重复 性好的蛋白点进行胰酶消化，m a l d i t o f 质谱仪分析。肽指纹图谱通过软件 f le x a n a ly sis2 4 和b r u k e rd a l t o n i c sb i o t o o l s3 0 连接到m a s c o tn c b i n r 数据库 进行比对分析，对所鉴定的蛋白根据c o g 进行功能分类，并通过k e g gk a a s 将其定位到各自的代谢途径上，进行表达调控研究。 【结果】 1 成功构建3 0 4 0k b 大小的f o s m i d 文库，进行末端测序，获得7 1 7 5 条r e a d s ， 经p h r e d p h r a p 序列拼接，s o l e x a 测序，以及p c r 测序延伸，形成1 1 组大 s c a f f o l d s ，涵盖整个基因组达6 8 2m b 。 2 利用g l i m m e r 3 0 2 预测了5 7 1 3 个o r f ，并做相似性比对，结果发现有5 2 1 0 个o r f 与己知基因有不同程度的相似性，且这些o r f 中有8 8 2 ( 4 5 9 5 5 2 1 0 ) 与极大节旋藻( a r t h r o s p i r am a x i m ac s 3 2 8 ) 基因非常相似， 表明两者亲缘关系密切。为把这些预测的基因进行功能分类，c o g 比对结 果发现可以对3 6 0 2 个基因( 6 3 0 5 ) 进行c o g 功能分类。 3 根据2 d p a g e 和m a l d i t o fm s 结果，我们在光照组中筛选到了1 6 个 蛋白点表达显著上调( 包括7 个只在光照组中表达的蛋白) ，2 7 个蛋白点 2 温州医学院硕士学位论文 表达显著下调，而在黑暗组中，有5 8 个蛋白点差异表达。这1 0 1 个蛋白 点的肽指纹图谱提交到m a s c o t 搜索结果发现有9 4 个蛋白都与节旋藻属有 高度的同源性。 4 我们根据所鉴定的蛋白点进行功能和参与的代谢途径进行归类，发现差 异表达的蛋白都是一类与碳及能量代谢相关的关键酶类，还有一些是与胁 迫、移动与分泌相关的蛋白和翻译后修饰蛋白。 【结论】 1 本课题组先前完成的钝顶螺旋藻基因组信息为大规模比较鉴定差异表达 蛋白提供强大的支持，我们根据基因组序列构建本地的质谱库，可以将所 蛋白组鉴定的蛋白定位到基因组上。 2 所鉴定的碳及能量代谢相关的关键酶类，主要涉及到糖酵解糖异生途径、 戊糖磷酸途径及光合作用等过程。揭示螺旋藻通过调控这些酶类的表达水 平来有效控制细胞内的正常生理活动，达到对不同光照条件下的生存适 应。 3 研究结果表明钝顶螺旋藻蛋白表达受到不同光照的显著影响，利用蛋白组 学研究方法( 2 d p a g e 和m a l d i t o fm s ) 可以为我们提供不同条件培 养下可靠的蛋白表达谱信息，为后续对感兴趣的蛋白进行功能验证提供基 础。 【关键词】 钝顶螺旋藻；2 d p a g e ；m a l d i t o fm s ；代谢 t 婆埸寺冀，如归气? 气蚴q 三吓柳始龟访h 三0 ，楣。 3 t 一 1 温州i 医学院硕士学位论文 p r o t e o m i c a n dm e t a b o l i c a n a l y s i su n d e r d i f f e r e n t l i g h tc o n d i t i o n si ns p i r u l i n ap l a t e n s i s o b j e c t s ：b a s e do nt h ec o m p l e t e dg e n o m eo fs p i r u l i n ap l a t e n s i sb yo u rg r o u p ，t h e d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fp r o t e i n si ns p i r u l i n ap l a t e n s i sr e s p o n d i n gt ov a r i o u sl i g h t c o n d i t i o n sw a ss t u d i e d t h ep r o t e o m i c st e c h n i q u e sw e r ea p p l i e db a s e do n2 d p a g e a n dm a l d i - t o fm s w ea t t e m p e dt os c r e e nt h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fp r o t e i n s b yu s i n gc o m p a r a t i v ep r o t e o m i c sm e t h o d s ，a n dt h e nt r a c e da n di d e n t i f i e dt h e s e p r o t e i ns p o t s i tw a sp o s s i b l et ol i n kt h e s ep r o t e i ns p o t sw i t ht h e i rp u t a t i v eo p e n r e a d i n gf r a m e s ( o r f s ) o nt h eg e n o m ea n dp r o b ei n t om a n yi m p o r t a n tf u n c t i o n a l i n f o r m a t i o n sa b o u to r f sw i t hu n k o w nf u n c t i o n s f u r t h e r m o r e ，w ei n t e n d e dt ot r a c e t h ep r o t e i n si d e n t i f i e dt ot h e i rr e g u l a t o r ym e t a b o l i cn e t w o r k si nl i g h ts t r e s sr e s p o n s e s t h er e s u l t si n t h i ss t u d yw o u l db eag r e a tc o n t r i b u t i o nt oo u ru n d e r s t a n d i n go f p r o t e o m i c sa n ds y s t e mb i o l o g y i n c y a n o b a c t e r i a t h ea v a l i b i l i t yo fd i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o no fp r o t e i n si d e n t i f i e d i sj u s tt op a v et h ew a yf o ri d e n t i f i c a t i o no ft h e f u n c t i o no fr e l a t e dp r o t e i n su s i n gs y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3a sam o d e lo r g a n i s m f o rg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n s y s t e m i n c y a n o b a c t e r i a a tp r e s e n t ，ac o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n go ft h em o l e c u l a rb a s i so fr e g u l a t o r ym e t a b o l i s mi sn e e d e d t h e r e f o r e ，i t a r i s e so u ri n t e r e s t sf o rf u r t h e rr e s e a r c ho nd i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o no fp r o t e i n sa n d r e g u l a t o r ym e t a b o l i s mi ns p i r u l i n a p l a t e n s i se x p o s e dt od i f f e r e n tl i g h tc o n d i t i o n s m e t h o d s ：t h eo r f sw e r e p r e d i c t e df o r t h es p i r u l i n a p l a t e n s i sg e n o m e b y g l i m m e r 3 0 2 ，a n da n n o t a t e db a s e do ns e q u e n c es i m i l a r i t y t h ep r e d i c t e dp r o t e i n s e q u e n c e sw e r ec l a s s i f i e da c c o r d i n gt oc o gd a t a b a s e t h es o l u b l ep r o t e i n sw e r e e x t r a c t e df r o m s p i r u l i n ap l a t e n s i sc u l t u r e du n d e rl i g h ta n dd a r kc o n d i t i o n s ， r e s p e c t i v e l y a f t e rs e p a r a t i o no ft h es p i r u l i n ap l a t e n s i sp r o t e i n su s i n g2 d p a g e ，g e l s w e r es t a i n e dw i t hs i l v e rn i t r a t e g e li m a g e sw e r eo b t a i n e df r o mu n a xp o w e r l o o k 2 1 0 0 x ls c a n n e ra n d a n a l y z e dw i t hi m a g e m a s t e r2 dp l a t i n u m5 0 t h es i g n i f i c a n c eo f t h ed i f f e r e n c ei np r o t e i n se x p r e s s i o nb e t w e e nl i g h ta n dd a r kw a se s t i m a t e d ，o n l yt h o s e s p o t st h a tw e r er e p r o d u c i b l e ( d e t e c t e do nt h r e eg e l s ) a n dc o n s i d e r e da ss i g n i f i c a n t ( p 0 0 5 ) w e r ep i c k e do u tf o rf u r t h e rm a l d i t o fm sa n a l y s i sa f t e rt r y p t i cd i g e s t i o n t h ep e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t s ( p m f ) w e r ec a l i b r a t e di nf l e x a n a l y s i s2 4 ，a n dt h e n 4 温州医学院硕士学位论文 s u b m i t t e dt om a s c o ts e r v e rb yb r u k e rd a l t o n i c sb i o t o o l s3 0w h i c hc o u l dc o m p a r e t h ep m f st ot h en c b i n rd a t a b a s ea u t o m a t i c a l l yo n l i n e t h ep r o t e i n si d e n t i f i e dw e r e c l a s s f i e db a s e do nc o gd a t e b a s e ，a n dw e r el o c a t e di nt a r g e dm e t a b o l i cp a t h w a yf o r f u r t h e rs t u d i e so nr e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o n r e s u i t s ： 1 w es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e daf o s m i dl a b r a r yf o rs p i r u l i n ap l a t e n s 括a n d7 1 7 5 r e a d sw e r eo b t a i n e du s i n ge n d - s e q u e n c i n g t h es e q u e n c e st o g e t h e rw i t hp r e v i o u s s e q u e n c i n gr e s u l t sf r o mp u c l 8c l o n e sw e r ea s s e m b l e db yp h r e d p h r a p i na d d i t i o n ， s o l e x as e q u e n c i n ga n de x t e n s i o np c rw e r ep e r f o r m e dt of i ut h eg a p s a tl a s t t h e w h o l eg e n o m ew a sd i v i d e di n t o1 1l a r g es c a f f o l d s w h i c hc o v e r e d6 8 2m bo ft h e g e n o m e 2 5 7 1 3o r f sw e r ep r e d i c t e df o rt h es p i r u l i n ap l a t e n s i sg e n o m eb yg l i m m e r 3 0 2 ， a n ds e q u e n c es i m i l a r i t y a n a l y s i s r e v e a l e dt h a tat o t a lo f5 2 1 0p r o t e i n sh a dt h e s i m i l a r i t yt oo t h e rk n o w ng e n e st ov a r y i n gd e g r e e s a m o n gw h i c ht h e r ew e r e8 8 2 ( 4 5 9 5 5 2 1 0 ) b e s th i tt ot h ep r o t e i n so fa r t h r o s p i r am a x i m ac s - 3 2 8 ，m e a n i n gt h a t t h e s et w os p e c i e sw e r ec l o s e l yh o m o l o g o u s t h ef u n c t i o n so ft h ep r o t e i n sp r e d i c t e d w e r ec l a s s i f i e da c c o r d i n gt oc o g d a t a b a s e ，w h i c hs h o w e dt h a t3 6 0 2p r o t e i n sw e r eh i t i nc o gd a t a b a s e 3 t h er e s u l t so f2 d p a g ea n dm a l d i t o fm ss h o w e dt h a tt h e r ew e r e1 6 u p 。r e g u l a t e dp r o t e i n ss i g n i f i c a n t l yi nl i g h tc o n d i t i o n si n c l u d i n g7p r o t e i n st h a tw e r e d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d ，w h i l e2 7p r o t e i n sw e r ed o w n r e g u l a t e ds i g n i f i c a n t l y i tw a s b e y o n do u re x p e c t i o nt h a tt h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n sa sm u c ha s5 8i nd a r k c o n d i t i o n s t h ep e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t so ft h e s e1 0 1p r o t e i ns p o t sw e r ec o m p a r e dt o t h en c b i n rd a t a b a s et h r o u g hm a s c o ts e a r c h ，a n dw ef o u n dt h a tt h e r ew e r e9 4p r o t e i n s p o t sw i t hh i g hh o m o l o g yt oa r t h r o s p i r ag e n u s 4 t h ec l a s s i f i c a t i o no ft h ep r o t e i ns p o t si d e n t i f i e do nt h eb a s i so fc o gd a t a b a s e a n dt h e i rm e t a b o l i cp a t h w a y sr e v e a l e dt h a tt h ep r o t e i n st h a tw e r e d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e db e l o n g e dt os o m ei m p o r t a n te n z y m e sw h i c hw e r ei n v o l v e di nc a r b o na n d e n e r g ym e t a b o l i s m ，t o g e t h e rw i t han u m b e ro fp r o t e i n sr e l a t e dt os t r e s s ，m o t i l i t y ， s e c r e t i o na n dp o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n s c o n c l u s i o n s ： 1 t h ea v a l i b i l i t yo f c o m p l e t e dg e n o m i ci n f o r m a t i o n s o fs p i r u l i n a p l a t e n s i s 5 温州医学院硕士学位论文 p r o v i d e das t r o n gs u p p o r tf o ral a r g e s c a l ec o m p a r i s o no fd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s i o ni n p r o t e i nl e v e l s a n dt h ep r o t e i n si d e n t i f i e dc o u l db ep e r f e c t l yl i n k e dt ot h ep r o t e i n sw e p r e d i c t e dw h e nc o m p a r e dt o m sd a t a b a s ec o n s t r u c t e di nl o c a l t h eg e n e p r o t e i n l i n k a g ew a s a c h i e v e d 2 t h ek e ye n z y m e st h a tw ei d e n t i f i e dt or e l a t et oc a r b o na n de n e r g ym e t a b o l i s m ， w e r em a i n l yi n v o l v e di nt h eg l y c o l y s i s g l u c o n e o g e n e s i s ，p e n t o s ep h o s p h a t ep a t h w a y a n dp h o t o s y n t h e s i s i tw a sm o r ee f f e c t i v et oc o n t r o ln o r m a lp h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e si n c e l l sb yr e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o nl e v e l so ft h e s ee n z y m e st oa d a p tt od i f f e r e n tl i g h t c o n d i t i o n s 3 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fp r o t e i n si ns p i r u l i n ap l a t e n s i su n d e r d i f f e r e n tl i g h tc o n d i t i o n sw e r es i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e d i tc o u l dp r o v i d ea sw i t h r e l i a b l ei n f o r m a t i o n so fp r o t e i n s e x p r e s s i o nu n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n sb a s e do n p r o t e o m i ca n a l y s i st e c h n i q u e s ( 2 d - p a g ea n dm a l d i - t o fm s ) ，f a c i l i t a t i n gt h e f u n c t i o n a li d e n t i f i c a t i o n so f p r o t e i n so fi n t e r e s t k e y w o r d s ： s p i r u l i n ap l a t e n s i s ；2 d - - p a g e ；m a l d i - t o fm s ；m e t a b o l i s m 6 温州医学院硕士学位论文 1 引言 钝顶螺旋藻( s p i r u l i n ap l a t e n s i s ) 为蓝藻门、颤藻目、颤藻科、螺旋藻属一 类原核藻类，广泛分布在热带、亚热带和暖温带的海洋、湖泊、温泉或盐碱 湖中。其分布广泛，适应性强，可耐受高温、强光、高盐、强碱等极端环境。 螺旋藻是一种光合原核生物，具有叶绿体，可以进行光合自养生长。光照是 螺旋藻生长不可缺少的环境因子之一。不同的藻类培养时所需的最适光照不 一样，螺旋藻都能耐受强光、最适光强度为3 0 - - 一3 5k l x ，仍可耐受更高强度的 光照1 1 】。当光辐射强度超过一定值时，螺旋藻的生长就受到光的抑制，称为 光损伤( p h o t o d a m a g e ) 【2 j 。为避免受到损伤，螺旋藻必须调节细胞内所吸收 的光能的分配，其中细胞内复杂的信号转导网络是一个非常重要的原因，同 时也涉及到与此相关的基因的特异表达1 3 】。因此，蓝细菌能够非常迅速的感 受外界环境的信号变化，通过调控基因的表达，使细胞对外界环境作出积极 快速的响应，从而在各种极端环境中得以生存下来。 迄今为止，对蓝细菌的研究取得了令人瞩目的成就，包括对其全基凶组测 序研究，了除本课题组完成的首张螺旋藻基因组序列图外，已经有4 3 个其他 蓝细菌基因组被测序并公布了序列，包括3 8 个基因组全序列和5 个框架图， 而且还有2 0 多个蓝细菌的基因组测序正在进行中( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v ) 。 这些基因组序列为研究蓝细菌的环境适应性和抗逆机制提供了一份宝贵的资 源。 目前，已有开展对蓝细菌逆境生存机理的研究报道，如进行蓝细菌对强光、 高盐、高低温、极端气体环境等的抗逆机理研究，且对蓝藻蛋白组学的研究也 逐渐在增加。作为蓝细菌大家庭中的一员，螺旋藻具有蓝细菌固有的逆境生存 能力。然而目前，蓝藻大部分的蛋白组研究工作还是集中在对集胞藻p c c6 8 0 3 的研究，其主要涉及到膜蛋白、盐胁迫、温度、光照等方面的研究。s a z u k a 等h j 利用2 d p a g e 和n 末端测序技术，已对集胞藻p c c6 8 0 3 进行了全蛋白谱 的筛选，找出了2 3 4 个差异蛋白，并成功将这些蛋白与其在基因组上预测的开 放阅读框( o r f s ) 联系起来，形成一个蛋白基因连锁的数据库( c y a n 0 2 d b a s e ) ， 为本研究的顺利进行提供了极大的参考价值。k o u j ik o j i m a 等【5 】于艮道了在某些 条件下，光照和温度会对蓝细菌分子伴 吕g r o e s l l 和g r o e s l 2 基因的表达发生影 响。两者在正常条件下不受温度和光照的影响，在正常温度3 0 时，无论是在 黑暗或光照环境，两者的表达都维持在较低的水平。进一步的研究显示， g r o e s l l 和g r o e s l 2 的表达受h r c a 的调节，当把蓝细菌s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 的h r c a 突变体转移到暗室后，g r o e s l l 和g r o e s l 2 基因的转录水平明显下 7 温州医学院硕士学位论文 降，当重新进行光照时，g r o e s l l 和g r o e s l 2 的表达又回升。为此，本项研究在 完成的钝顶螺旋藻全基因组测序的基础上，预测出了5 7 1 3 个o r f s ，将利用蛋 白组学技术( 2 d p a g e 和m a l d i t o fm s 技术) 对钝项螺旋藻进行蛋白表达 分析，探索钝顶螺旋藻对外界光条件的响应，追踪不同光照培养条件下螺旋藻 蛋白表达谱的差异，并进一步鉴定这些差异蛋白，且定位到相应的o r f 上，进 行钝顶螺旋藻光诱导及暗适应的功能蛋白研究，寻找新的差异表达蛋白，并追 踪这些蛋白在胁迫环境下是如何协调各自的代谢调控网络，将有助于拓展对蓝 藻的蛋白组学和系统生物学的研究。 蓝藻的细胞结构和遗传特性与革兰氏阴性细菌类似，部分种类具有自然转 化和有效重组系统。集胞藻p c c6 8 0 3 是目前研究最透彻的蓝藻，已成为研究 光合作用和蓝细菌遗传转化系统的一种理想的模式生物【6 】。因此，适用于大肠 杆菌的各种分子生物学操作也同样适用于蓝藻细胞l _ 丌。本研究将为后续的研究 奠定了基础，即利用集胞藻p c c6 8 0 3 作为蓝细菌遗传转化系统的模式生物， 进行差异表达蛋白的功能验证，进而研究螺旋藻代谢途径调控网络的分子基 础。 2 材料与方法 2 1 基因组随机文库的构建 2 1 1 钝顶螺旋藻的培养 实验所用的材料一钝顶螺旋藻，由中科院青岛海洋研究所提供。螺旋藻培 养基( z a r r o u k 培养基) 【8 】配方如下所示。 表1z a r r o u k 培养基成分 成分 浓度( g l ) n a h c 0 31 6 8 0 n a n 0 3 2 5 0 n a c l1 0 0 k 2 s 0 4 1 0 0 f e s 0 4 7 h 2 0 0 0 1 e d t a n a 0 0 8 m g s 0 4 7 1 - 1 2 0 0 2 0 c a c l 2 0 0 4 h p 0 4 0 5 0 a s ( 微量元素1 1m l b 6 ( 微量元素) 1m l 8 温州医学院硕士学位论文 表2 微量元素溶液a 5 的组成成分 成分 浓度( g l ) z n s 0 4 7 h 2 0 c u s 0 4 5 h 2 0 m 0 0 3 h 3 8 0 3 m n c l 2 4 h 2 0 0 2 2 0 0 8 0 0 2 2 8 6 1 8 1 表3 微量元素溶液b 6 的组成成分 成分 浓度( 1 0 4 l ) i n i - 1 4 v 0 3 k 2 c r 2 ( s 0 4 ) 4 2 4 h 乏o n i s 0 4 7 h 2 0 n a 2 w 0 4 2 h 2 0 c o m 0 3 h 6 h 2 0 t i 2 ( s 0 4 ) 3 2 2 9 6 0 9 6 0 0 0 4 7 8 5 0 1 7 9 4 0 4 3 9 8 0 4 0 0 0 0 将钝顶螺旋藻按1 ：2 0 0 的比例接种于新鲜配置的培养液中，置于3 0 、8k l x 的光照强度、7 5 湿度的全自动光照培养箱中培养。待藻处于生 长对数期时候，按照1 ：2 0 的接种量转接入新鲜配制的培养液中，一组保 持在3 5 、8k l x 光照下继续培养4 8 小时，另一组则转到3 5 ，黑暗条 件下培养相同时间。待藻生长至平稳期时，收集藻细胞。 2 1 2 钝顶螺旋藻收获 用2 0 0 目的筛网过滤收藻细胞。将收集好的藻细胞放于烧杯中，加入预冷 的含1 mn a c l 、p h = 6 0 的磷酸盐缓冲液搅拌洗涤。9 0 0 0r p m m i n 离心5m i n ， 收集上层的螺旋藻，弃去下层的老、死、结块的螺旋藻。补充洗涤用的磷酸盐 缓冲液，重复三次。直至下层基本没有沉淀为止。吸取上层螺旋藻细胞置于烧杯 中加入蒸馏水搅拌洗涤，用2 0 0 目的筛网除盐，重复3 5 次，确保完全除去盐 分。7 0 保存备用。 2 1 3 基因文库的构建与测序 螺旋藻大片段基因组d n a 的提取按照茅云翔等所采用的方法【9 l ，大片段基 因组d n a 经超声波随机剪切，胶回收末端补平后，以p u c l 8 为克隆载体，分别 构建插入片段为1 2k b 和4 6k b 的螺旋藻基因组文库，最后再构建3 0 4 0k b 的螺 9 温州医学院硕士学位论文 旋藻基因组f o s m i d 文库，然后使用了自动测序l 义m e g a b a s e1 0 0 0 以及a b l 3 7 3 0 进行克隆末端的双向测序。大规模基因组测序策略是基于全基因组鸟枪法【1 0 】。 2 2 基因组序列拼接与注释 2 2 1 序列拼接 螺旋藻基因组的序列拼接和质量评估采用了计算机h p 5 7 0 g 3 ， p h r e d p h r a p c o n s e d 软件包以及许多自编的p e r l 程序。在拼接的过程中，具有序列 相似性的不同r e a d s ( 每一个测序反应所得到的一段序列称为一个r e a d ) ，首先被 拼接成许多个c o n t i g s ( 克隆重叠群) 。 而后进行的c o n t i g s 定位。在所构建的p u c l 8 质粒基因组d n a 文库和f o s m i d 文 库这个基因组文库中，主要通过克隆两端测序r e a d s 的关系，来判断c o n t i g s 之间 的位置关系。如果某个克隆两个末端的序列分布位于两个不同的c o n t i g s 上，并且 这两个末端序列之间的距离与克隆的大小基本吻合，那么就可以认为这两个 c o n g t i g s 属于一个s c a f f o l d ( 基因组框架) ，本文通过p u c l 8 文库和f o s m i d 文库末 端测序信息，定位了所有的c o n t i g s 。 c o n t i g s 的定位完成以后，就可以根据c o n t i g s 的木端序列设计引物，通过 p c r 扩增以及产物测序的方法填j l c o n t i g s 之问的空隙或直接以上述克隆为模板， 设计末端引物延伸补洞。对每个g a p 洞设计一对引物，要求引物要在至少2 个r e a d s 覆盖的高质量u n i q 区( 对于挑克隆直接测序，如果找不至t j u n i q 区的引物，在r e p e a t 区也可以) ，并挑出所有覆盖了引物区域的克隆，选2 3 条做为模板送交测序。一 次补不上的g a p 洞要多做几次，可以尝试更换引物或者克隆，最后即得到完整的基 因组。挑出所有单覆盖度和低质量区，重测相关位置的r e a d s 来增加可信度。 2 2 2 基因预测与功能注释 在测序完成，得到全基因序列图谱后，需要分析这一条有数十万个4 种碱基 对排列而成的长链所包含的遗传信息，即基因注释。基因组注释是一个需要许多 相关软件，经过多个步骤才能完成的过程。基因组注释的内容分为3 个层次：一 是核酸水平基因注释，即确定基因组的组成元素在整个基因组中的位置。二是蛋 白水平基因组注释，即确定所有预测的o r f 是什么。三是过程水平基因组注释， 就是把整个基因与一个生物体的生物过程相联系，对于微生物来说，就是描绘出 各个基因相互调控的网络图，如代谢通路、基因表达调控网络等。 基因组中o r f 的预测首先是g l i m m e r 3 0 2 软件完成的1 1 1 l ，设置参数为： m i n i m u m g e n el e n g t h = 1 5 0b p 。所有预测得到的大于5 0 个氨基酸的o r f 以及基因 间的序列都通过b l a s t 程序与n c b i 的n r ( 非冗余蛋白质) 数据库进行了比对 l o 温州医学院硕士学位论文 ( o r f 同源的判定标准为联配有大于3 0 的一致性，较小的o r f 有8 0 以上的序 列比对上，e 值小于l e 6 ) 。根据比对结果，我们对所预测到的o r f 以及基因组 中的非编码序列都进行了进一步的人工检查。例如，如果有两个o r f 位于基因组 中同一段序列的不同读码框中( 即两个o r f 相互重叠) ，一般保留较长的o r f ，删 除较短的o r f 。但是，如果较短的o r f 在n r 数据库中存在有同源序列，则对这 个o r f 予以保留1 1 2 j 。 2 2 3c o g 功能分类及k e g g 代谢途径注释 当基因组中所有的o r f 确定之后，我们又将这些o r f 同n c b i 的c o g ( c l u s t e r so f o r t h o l o g o u sg r o u p s ) 1 1 3j 数据库进行了比对，然后对b e s th i t 结果进行 c o g 归类，并利用k e g g ( h t t p ：w w w g e n o m e j p k e g g ) 对螺旋藻及其它蓝藻的 基因组序列构建全基因组范围内的代谢途径。为了得到更多的关于这些o r f 的功 能信息，我们还将这些o r f 的编码产物同e b i ( 欧洲生物信息学研究所) 的i n t e r p r o 数据库以及n c b i 的c d d ( c o n s e r v e dd o m a i nd a t a b a s e ) 数据库进行了比对和分析， i n t e r p r o 数据库现在整合了包括p r o s i t e ，p r i n t s ，p f a m ，p r o d o m ，s m a r t ， t i g r f a m s ，p i r s f 以及s u p e r f a m i l y 等在内的1 4 个蛋白质数据库1 1 4 , 1 5 】。 2 3 钝顶螺旋藻总蛋白的提取1 1 6 j 。 1 1 将干净的研钵和配好的丙酮溶液a 、b 以及干净称重编号的5 0m l 离心 管至于2 0 冷却；将收集好的螺旋藻置于液氮中冻1 0 1 5m i n 。 2 ) 称取一定量的螺旋藻冷冻块放入预冷的研钵中，加入液氮冷却，研磨 至粉末状；转移至预冷的5 0m l 离心管中。 3 ) 用1 0 倍体积的t c a 溶液a 悬浮，置于一2 0 2 3h ；取出后，4 ，3 5