（遗传学专业论文）紫杉醇前体生物合成的分子生物学和抗癌萜类吲哚生物碱的代谢工程.pdf

覆要史肇博士学位论戈蘩杉璩枷柑瀚幢r 戚的分子嚏传攀暮础嗽墙藉共吲噍生物碱的代谢王穗 紫杉醇前体生物合成的分子生物学和抗癌萜类吲哚 生物碱的代谢工程 指导教师 遗传学专业博士研究生 唐克轩教授 廖志华学号0 1 1 0 2 3 4 5 6 复且大学生命科学学院，遗传工程国家重点实验室，遗传学研究所 复旦一交大一诺丁汉植物生物技术研发中心 上海市邯郸路2 2 0 号，中国，2 0 0 4 3 3 摘要 紫杉醇的生物合成来源于经典的m v a 途径和新近发现的d x p 途径。为研 究紫杉醇前体生物合成途径的分子生物学，本文首先建立了从成熟的曼地亚红豆 杉等裸予植物的各种成熟组织中提取高质量r n a 的方法；在此基础上，采用 r a c e 方法从曼地亚红豆杉中首次克隆了m v a 途径上三个重要基因的全长 e d n a ，包括t m h m g r ( 曼地亚红豆杉3 一羟基一3 甲基戊二酰c o a 合成酶基因) ， t m 咖s ( 曼地亚红豆杉法呢基焦磷酸合成酶基因) ，t m i p i ( 曼地亚红豆杉异戊烯焦磷 酸异构酶基因) ；同时克隆了d x p 途径上的两个限速酶t m d x s ( 曼地亚红豆杉5 一 磷酸脱氧木酮糖合成酶基因) 和t m d r r ( 曼地亚红豆杉5 磷酸脱氧木酮糖还原异构 酶基因) 的全长e d n a ：克隆了为紫杉醇提供二萜骨架( 2 0 碳原子) 的t m g g p p s ( 曼地 亚红豆杉香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因) 的基因组序列，并获得全长c d n a ： 由于这些基因都是首次从裸子植物中获得。故对这些基因及其编码的酶进行了详 尽的生物信息学分析；采用遗传功能互补的方法验证了t m h m g r 、t m f m 、t m g g o p s 基因的功能，结果显示，t m h m g r 能够弥补酵母j r y 2 3 9 4 缺失的h m g r 功能，t m f p s 能够弥补酵母c c 2 5 缺失的f p s 功能，t m g g p p s 能够弥补酵母s f n y 3 6 8 缺失的 g g p p s 功能，证明它们编码相应的功能蛋白；在大肠杆菌中过量表达t m i p i 推动 d x p 途径代谢流向下游流动，促进b 胡萝卜素的生物合成而验证了t m i p i 的功能： s o u t h e r n 杂交结果表明，t m h m g r ，t m f p s ，t m i p i ，t m d r s 在曼地亚红豆杉中都是其 相应基因家族的成员；n o r t h e r n 杂交结果表明，t m h m g r 在曼地亚红豆杉根、茎 和叶中都有表达，但表达量有差异，t m h m g r 在地上部分的表达高于地下部分， 这与紫杉醇的药用部位相一致；t m f p s 在根、茎、叶中都有表达，在根和树干中 的表达量没有明显差异，在针叶中的表达量高于根和树干。首次发现t m g g p p s 是 一个没有内含子的基因，有本底表达水平，在用甲基茉莉酸处理曼地亚红豆杉细 槎旦又晕博士学位耋仝史蟹杉醇前敷生序帕诚曲分子遗传掌基础和啦癌蒋奏一i 嗽生囊扫碱的代姑工程 胞后，其表达量大为提高且维持较长对问，有利于紫杉醇的积累：获得了t m g g p p s 上游调控序列，通过生物信息学分析，发现了与长春花s t r 基因m e j a 反应元件 g - b o x 样的顺式作用元件c a c g t c ，该元件可能是m e a a 诱导t m g g p p s 表达上 调的分子基础；分别采用紫外线和甲基茉莉酸处理曼地亚红豆杉细胞，结果显示， t m d r s 在处理后细胞中的表达水平提高，这表明，紫外线和甲基茉莉酸是促使该 基因表达上调的两个信号；作为紫杉醇前体生物合成途径中的关键基因，t m g g p p s 和t m d v s 都受到m e j a 的影响而上调表达，这个现象的发现为m e j a 诱导紫杉醇 超量积累的分子机制的阐明提供了事实依据。本文关于这些基因的研究为深入阐 明紫杉醇生物合成的分子生物学、分子遗传学和生物化学机理奠定了重要基础， 为紫杉醇的代谢工程提供了更多可能的调控靶点。 喜树碱、羟基喜树碱、长春花碱和长春新碱都是高效的抗癌天然药物，属于 萜类吲哚生物碱( t e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d s ，t i a s ) ，但在植物中的含量都很低。 本文对这些抗癌吲哚生物碱的代谢工程进行了研究。从长春花中克隆了t i a s 生 物合成途径上的关键酶基因t d c 、s t r 和锄，以及调控长春花t i a s 生物合成途 径上多个基因的转录因子o r c a 3 ，构建了双元植物表达载体：p 1 3 0 4 + 姗咖、 p 1 3 0 4 + + g l o h 、p 1 3 0 4 + + o r c a 3 、p 1 3 0 4 + + g j o h + o r c a 3 ，导入了根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 并获得了工程菌株，同时导入卸甲型根癌农杆菌c 5 8 c 1 ( p r i a 4 ) 并获得了工程菌 株；用l b a 4 4 0 4 + p 1 3 0 4 + + f d 挑印遗传转化喜树，用1 5 ug m l 潮霉素筛选，获得 多个独立转化的抗性愈伤组织，在多次继代除菌培养后，用p c r 在继代培养抗 性愈伤组织的基因组d n a 中检测到转入的潮霉素抗性基因、外源目的基因t d c 、 5 护；同时用r t - p c r 检测到了t d c 和m r 的表达；h p l c 分析结果表明，转基因喜 树愈伤组织中羟基喜树碱和喜树碱含量比普通愈伤组织中的含量显著提高，转基 因喜树愈伤组织中羟基喜树碱最高含量达到1 8 7 r a g g 干重，喜树碱最高含量达 到6 5 2 m g g 干重，证明长春花t i a s 生物合成上游途径上的基因可以用于具有 共通途径的喜树t i a s 的代谢工程，提高喜树中喜树碱和羟基喜树碱的含量。用 c 5 8 c l ( p r i a 4 ) c 5 8 c l ( p r i a 4 ) + p 1 3 0 窜+ g j o h c 5 8 c 1 ( p r i a 4 ) + p 1 3 0 4 + + o r c a 3 ， c 5 8 c 1 ( p r i a 4 卜p 1 3 0 4 + + g j o h + o r c a 3 分别转化了长春花，获得了多个毛状根，在 多次继代除菌培养后，用p c r 在继代培养的毛状根( c 5 8 c 1 ( p r i a 4 ) 转化获得的长 春花毛状根) 的基因组d n a 中检测到导致并维持毛状根表型的r o l b 和r o l c 基因， 并用r t - p c r 检测到r o l b 和r o l c 基因的表达；在其他三种携带目的基因的工程 菌转化获得的长春花毛状根基因组d n a 中检测到潮霉素抗性基因，r o l b 和r o 心 基因，同时用r t - p c r 检测到潮霉素抗性基因、r o l b 和r o l c 基因的表达。这些 结果表明我们获得了长春花毛状根、转g l o h 的长春花毛状根、转o r c a 3 的长春 花毛状根、共转化册和o r c a 3 的长春花毛状根，为进一步研究转基因对长春 花t i a s 代谢组的影响提供了重要的材料，同时为利用转基因毛状根开展长春花 抗癌萜类吲哚生物碱代谢工程奠定了坚实的基础。 关键词 曼地亚红豆杉、紫杉醇、生物合成途径、分子克隆、生物信息学、3 羟基3 甲基 戊二酰c o a 还原酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、 5 磷酸脱氧木酮糖合成酶基因、5 脱氧木酮糖还原异构酶基因、香叶基香叶基焦 磷酸合成酶基因、r a c e 、基因组步移、遗传互补、功能验证、抗癌萜类吲哚生 物碱、色氨酸脱羧酶、异胡豆苷合成酶、1 0 香叶醇脱氢酶、o r c a 3 、喜树、羟 基喜树碱、喜树碱、长春花、毛状根、遗传转化、代谢工程、转基因 g e n b a n k a c c e s s i o nn u m b e r s a y 2 7 7 7 4 0 ：t m h m g r 全长m r n a ( 已释放) a y 4 6 1 8 1 1 ：t m f p s 全长m r n a a y 5 0 51 2 9 ：t m d x s 全长m r n a a y 5 8 8 4 8 2 ：t m d x r 全长m r n a a y 5 6 6 3 0 9 ：t m g g p p s 基因组序列( 已释放) a y 4 5 3 4 0 4 ：t m g g p p s 全长m r _ n a ( 已释放) 缩略词表 a a c t ：a c e t y - c o a ：a c e t y c o ac - a c e t y l t r a n s f e r a s e ，乙酰c o a ：乙酰c o a 一酰基 转运酶 c d p m e ：4 - ( c y t i d i n e5 - d i p h o s p h o ) - 2 - c m e t h y l d - e r y t h f i t o l ，4 - ( 5 - 焦磷酸胞 苷) 2 c 甲基d - 赤藓醇 c d p - m e p ：4 - ( c y t i d i n e5 - d i p h o s p h o ) - 2 一c - m e t h y l d e r y t h r i t o l 一2 一p h o s p h a t e ，4 - ( 5 焦磷酸胞苷) 2 一c 甲基一d 一赤藓醇- 2 - 磷酸 c m k ：4 - ( c y t i d i n e5 - d i p h o s p h o ) 一2 c m e t h y l - d e r y t h r i t o lk i n a s e ，4 - ( 5 一焦磷酸胞 苷) 2 c 甲基d 赤藓醇激酶 d m a p p ：d i m e t h y l a l l y ld i p h o s p h a t e ，二甲基烯丙基焦磷酸 d x p ：1 - d e o x y d - x y l u l o s e5 - p h o s p h a t e ，l 。脱氧木酮糖一5 一磷酸 d x p s ：1 - d e o x y - d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t es y n t h a s e ，1 - 脱氧一木酮糖一5 磷酸合成酶 握里大学博士学位电文紫杉- 前俸矗耪奢哦的分子遗传掌基础和抗癌薅舆吲噪生扫碱的代谢工程 m o l e c u l a r b i o l o g y o f t h e b i o s y n t h e t i cp a t h w a y so f t a x o lp r e c u r s o r sa n dm e t a b o l i c e n g i n e e r i n go f a n l i 4 u m o r t e r p e n o l dl a d o l e a l k a l o i d s s u p e r v i s o r p h dc a n d i d a t e m a i o r ：g e n e t i c s p r o f d r k e x u a n t a n g z h i h u al i a o s p e c i a l t y ：p l a n tm o l e c u l a r g e n e t i c s i n s t i t u t eo fg e n e t i c s s t a t ek e y l a b o r a t o r y o fg e n e 6 e e n g i n e e r i n g f u d a n - s j t u - n o t t i n g h a m p l a n t b i o t e c h n o l o g yr d c e n t e r s c h o o lo fl i f es c i e n c e s f u d a n u n i v e r s i t y 2 2 0h a n d a n r o a d ，s h a n g h a i ，p rc h i n a 2 0 0 4 3 3 s u m m a r y t a x o l ，o n eo f t h em o s tp o t e n ta n de f f i c i e n ta n t i - t u m o ra g e n t s ，i so r i g i n a t e df r o m t h ec l a s s i cm v a p a t h w a ya n dr e c e n t l yu n v e i l e dd x pp a t h w a y i no r d e rt om a p t h e b i o s y n t h e s i s o ft a x o lp r e c u r s o r sa tt h el e v e lo fm o l e c u l a rg e n e t i c s ，a ne a s ya n d e f f i c i e n tp r o t o c o lw a sd e v e l o p e df o ri s o l a t i n gg o o d q u a l i t yt o t a lr n af r o mv a r i o u s m a t u r et i s s u e si n c l u d i n gf r u i t s ，l e a v e s ，s t e m sa n dr o o t so ft a x u sp l a n t o nt h eb a s i so f t h i sp r o t o c o l ，t h ef u l l - l e n g t hc d n a so ft h r e ek e y g e n e s i n v o l v e di nt h em - v a p a t h w a y w e r ec l o n e dt h r o u g hr a c em e t h o d ，c h a r a c t e r i z e da n df u n c t i o n a l l yi d e n t i f i e d ，w h i c h w a s r e s p e c t i v e l yt m h m g r ( t h eg e n ee n c o d i n g3 - h y d r o x y 3 - m e t h y l g l u t a r y l c o a r e d u c t a s ef r o mt a x u sm e d i a ) ，t m f p s ( t h eg e n ee n c o d i n gf a m e s y l d i p h o s p h a t es y n t h a s e f r o mt a x u sm e d i a ) a n dt m i p i ( t h eg e n ee n c o d i n gi s o p o n t e n y ld i p h o s p h a t ei s o m e r a s e f r o mt a x u sm e d i a ) t w ok e yg e n e se n c o d i n gt h ec o m m i t t e d s t e pe n z y m e si n v o l v e di n t h ed x pp a t h w a y , t m d x s ( t h eg e n e e n c o d i n g1 一d e o x y - d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t e s y n t h a s e f r o mt a x u sm e d i a ) a n dt m d x r ( t h eg e n ee n c o d i n g 1 - d e o x y - d x y l u l o s e 5 - p h o s p h a t e r e d u c t o i s o m e r a s ef r o mt a x u s m e d i a ) ，a n d t h e g e r a n y l g e r a n y l d i p h o s p h a t es y n t h a s eg e n ef r o mt a x u sm e d i aa n di t sc o r r e l a t i v eg e n o m i cs e q u e n c e w e r ea l s oc l o n e da n dc h a r a c t e r i z e d t h ed i f f e r e n tm u t a n ty e a s ts t r a i n sw e r ea p p l i e dt o r e s p e c t i v e l yi d e n t i f y t h ef u n c t i o no ft m h m g r , t m f p sa n dt m g g p p sb yf u n c t i o n a l l y g e n e t i cc o m p l e m e n t a t i o n ；t h ef u n c t i o n o f t m p i w a si d e n t i f i e db yo v e r e x p r e s s i n gi ne c o l is t r a i nx l l 一b l u ew i t ht h ec a r o t e n o i d p r o d u c i n gp l a s m i dp a c b e t a ，w h i c h 强旦大学栩咕嘣啦嗡e ：文紫杉- 事前体生物合战的分号疃传尝基础和抗癌赭尝一l 噪生物碱的代翻鲁王疆 r e s u l t e di np u s h i n gf o r w a r dt h em e t a b o l i cf l u xt ot h ed o w n s t r e a mo f t h ed x p p a t h w a y s o u t h e r nb l o t a n a l y s i s r e v e a l e dt h a t t m h m g r ，t m f p s ，t m i p i o rt m d x sw a sn o ta s i n g l e g e n eb u tb e l o n g e dt oi t sg e n ef a m i l yi nt a x u sm e d i a n o r t h e r nb l o ta n a l y s i s s h o w e dt h a tt m h m g ra n d 加啦珂e x p r e s s e di nt h er o o t s ，s t e m sa n dn e e d l e so ft a x u s m e d i a ，b u tw i t hh i g h e rl e v e lo fe x p r e s s i o nf o rt m h m g ri nt h en e e d l e sa n ds t e m s ，t h a t w a sc o i n c i d e n tw i mt h ef a c tt h a ts t e m sa n dn e e d l e sw e r eu s e df o re x t r a c t i n gt a x o la n d i t sd e r i v a t i v e s t m f p se x p r e s s e dc o n s t i t u t i v e l yi nr o o t s ，s t e m sa n dn e e d l e s t m g g p p s w a sa ni n t r o n - f x e eg e n ew i t ht h el o wl e v e lo fc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o n ；w h e nt a x u s m e d i ac e i l sw e r et r e a t e dw i t hm e j a t h ee x p r e s s i o no f t m g g p p s i n c r e a s e dg r e a t l ya n d m a i n t a i n e dh i g he x p r e s s i o nl e v e li nar e l a t i v e l o n gt i m et h a t w a sh e l p f u lt ot h e a c c u m u l a t i o no ft a x 0 1 ag - b o xw a sf o u n di nt h eu p s t r e a ms e q u e n c eo ft m g g p p s ， w h i c hw a st h es a n l ea st h em e j a - r e s p o n s i v eg b o xo f t h es t r i c t o s i d i n es y n t h a s eg e n e i nc r o s e u s ，a n dt h i sm i g h te x p l a i nt h a tt m g g p p sw a s 叩一r e g u l a t e db ym e j a w h e n t a x u sm e d i ac e l l sw e r et r e a t e d 研廿lu va n dm e j a ，r t - p c ro ft m d x sr e v e a l e dt h a t u va n dm e j ac o u l du pr e g u l a t ei t se x p r e s s i o n t h er e s p o n s e so f t m g g p p sa n dt m d r s t om e j a m i g h tg i v er e a s o n st h a tm e j a i n d u c e do v e rp r o d u c t i o no ft a x 0 1 i tw a s i m p o r t a n tt o c l o n ea n dc h a r a c t e r i z et h eg e n e sd e s c r i b e db e f o r e ，w h i c hw a sv e r y h e l p f u lt om a p t h et a x o lb i o s y n t h e t i cp a t h w a y sa tt h el e v e lo f m o l e c u l a rg e n e t i c sa n d b i o c h e m i s t r ya n da l s op r o v i d e dm o r ep o t e n t i a lt a r g e t sf o rm e t a b o l i ce n g i n e e r i n go f t a x 0 1 c a m p t o t h e c i n ，v i n b l a s t i n e a n dv i n c r i s t i n ew e r e p o t e n t a n t i - t u m o r a g e n t s ，a l l b e l o n g i n gt o t i a sb u tw i t hv e r yl o wc o n t e n t si np l a n t a t h e r e f o r e ，m e t a b o l i c e n g i n e e r i n go f t h e s et i a sw o u l db eag o o da l t e r n a t i v ew a yt os o l v et h es h o r t a g e p r o b l e mo ft h e s ea g e n t s t h e t h r e e k e yg e n e s ，i n c l u d i n gt d e ( t h eg e n ee n c o d i n g t r y p t o p h a nd e c a r b o x y l a s e f r o mc a t h a r a n t h u s r o s e u s ) ，s t r ( t h eg e n ee n c o d i n g s t r i c t o s i d i n e s y n t h a s e f r o mcr o s e u s ) a n d g l o h ( t h eg e n ee n c o d i n gg e r a n i o l 1 0 - h y d r o x y l a s ef r o mcr o s e u s ) ，w e r ei s o l a t e db yr t - p c r a n du s e df o rc o n s t r u c t i n g p l a n te x p r e s s i o nv e c t o r s o r c a 3 ，at r a n s c r i p t i o nr e g u l a t o ri n v o l v e d i nt h et i a s b i o s y n t h e t i cp a t h w a yi ncr o s e u s ，w a sa l s oc l o n e da n du s e df o rc o n s t r u c t i n gp l a n t e x p r e s s i o nv e c t o r a f t e r as e r i e so fm o l e c u l a ro p e r a t i o n ，f o u r p l a n te x p r e s s i o nv e c t o r s w e r eo b t a i n e d ：p 1 3 0 4 + t d c + s t r ，p 1 3 0 4 + + g l o h ，p 1 3 0 4 + + o r c a 3 ，p 1 3 0 4 + + g l o h + o r c a 3 ， a n dt h er e s u l t i n gf o u rv e c t o r sw e r ei n t r o d u c e di n t o 4 9 r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r a i n l b a 4 4 0 4a n dd i s a r m e ds t r a i nc 5 8 c 1 ( h a r b o r i n gp r i a 4 ) t og e n e r a t ee n g i n e e r e d s t r a i n s c a m p t o t h e c aa c u m i n a t a ( c h i n e s eh a p p yt r e 曲w a sg e n e t i c a l l yt r a n s f o r m e d 棋旦盖肇悄唾蝈鄙时e _ 文繁杉醇前体生物台戚的分号嚏传学基础和抗癌萜类吲哚生袖碱的代坩工程 w i t hl b a 4 4 0 4h a r b o r i n g p 1 3 0 七t d c + s t r s e v e r a li n d e p e n d e n tt r a n s f o r m a n t so f c h i n e s eh a p p yt r e ew e r eo b t a i n e db ys c r e e n i n gw i t hh y g r o m y c i n ( 15i | t g m 1 ) a f t e r s u b - c u l t u r ef o rs e v e r a lr o u n d s o ns e l e c t i v e m e d i u m ( m s + n a a5 0 m g l + b a o 5 m g l + 2 , 4 一do 3 m g l + h y g r o m y c i n 2 5 p g m 1 ) t h et r a n s g e n i c s t a t u so ft h e h y g r o m y c i n - r e s i s t a n tt i s s u e so fc h i n e s eh a p p yt r e ew a sc o n f i r m e db yp c r f o rt h e p r e s e n c e o ft h e h y g r o m y c i n - r e s i s t a n tg e n e t d c a n ds f ra n dt h e f o r e i g ng e n e e x p r e s s i o ni nt r a n s g e n i ct i s s u e sw a sd e m o n s t r a t e db yr t - p c r s u b s e q u e n t l yh p l c w a s a p p l i e d t od e t e c tt h ec o n t e n t so f10 一h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ( h c p da n d c a m p t o t h e c i n ( c p t ) i nt r a _ n s g e n i ct i s s u e s n 他r e s u l ts h o w e d t h a tb o t ho fh c p ta n d c p tc o u l db ed e t e c t e di na l it h et e s t e df i v ei n d e p e n d e n tt r a n s g e n i cc e l ll i n e so f c h i n e s eh a p p yt r e e ，b u tn o ti nn o n t r a n s f o r m e dc o n t r o ln o r m a lc e l ll i n e s a m o n gt h e f i v et r a n s g e n i ct i s s u e so fc h i n e s eh a p p y t r e e ，t h eh i g h e s tc o n t e n t so f h c p ta n dc p t r e a c h e d1 8 7m g ，gd wa n d6 ，5 2m e g gd w r e s p e c t i v e l y c a t h a r a n t h u sr o s e u sw a s g e n e t i c a l l yt r a n s f o r m e dw i t hc 5 9 c 1 ，c 5 8 c 1 + p 1 3 0 4 + + g l o h ，c 5 8 c l + p 1 3 0 4 + + o r c a 3 ， a n dc 5 8 c 1 + p 1 3 0 4 + + g l o h + o r c a 3 ，a n dt h eg e n e so fi n t e r e s t ，i n c l u d i n gg l o h ，o r c a 3 ， b o t ho fg l o ha n do r c a 3 ，w e r ee x p r e s s e di nk 岫r o o t so fc r o s e u s ，c o n f i r m e db y r t - p c r f i n a l l y , d i f f e r e n tt r a n s g e n i ch a i r yr o o tl i n e so f cg o s e m sw e r ee s t a b l i s h e d ， w h i c h p r o v i d e dt h e b a s i sf o rt h ef u r t h e rs t u d yo fm e t a b o l i ce n g i n e e r i n go ft i a si nc m j w k e y w o r d s t a x u sm e d i a ，t a x o l 雷, b i o s y n t h e t i cp a t h w a y s ，m o l e c u l a rc l o n i n g ，b i o i n f o r m a t i c s ， h m g r ，f p s ，i p i ，a k s ，d x r ，g g p p s ，r a c e ，g e n o m i cw a l k i n g ，g e n e t i cc o m p l e m e n t a t i o n ， f u n c t i o n a li d e n t i f i c a t i o n , a n t i - t u m o rt e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d s ，t a c ，s t r ，g l o h ，o r c a 3 ， c a m p t o t h e c aa c u m i n a t a , 1 0 - h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ，c a m p t o t h e c i n ，c a t h a r a n t h u s r o s e u s ，h a i r yr o o t , g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ，m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g , t r a n s g a n e 花t i a s 代谢组的影响提供了重要的材料，同时为利用转基因毛状根开展长春花 抗癌萜类吲哚生物碱代谢工程奠定了坚实的基础。 关键词 曼地亚红豆杉、紫杉醇、生物合成途径、分子克隆、生物信息学、3 羟基3 甲基 戊二酰c o a 还原酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、 5 磷酸脱氧木酮糖合成酶基因、5 脱氧木酮糖还原异构酶基因、香叶基香叶基焦 磷酸合成酶基因、r a c e 、基因组步移、遗传互补、功能验证、抗癌萜类吲哚生 物碱、色氨酸脱羧酶、异胡豆苷合成酶、1 0 香叶醇脱氢酶、o r c a 3 、喜树、羟 基喜树碱、喜树碱、长春花、毛状根、遗传转化、代谢工程、转基因 g e n b a n k a c c e s s i o nn u m b e r s a y 2 7 7 7 4 0 ：t m h m g r 全长m r n a ( 已释放) a y 4 6 1 8 1 1 ：t m f p s 全长m r n a a y 5 0 51 2 9 ：t m d x s 全长m r n a a y 5 8 8 4 8 2 ：t m d x r 全长m r n a a y 5 6 6 3 0 9 ：t m g g p p s 基因组序列( 已释放) a y 4 5 3 4 0 4 ：t m g g p p s 全长m r _ n a ( 已释放) 缩略词表 a a c t ：a c e t y - c o a ：a c e t y c o ac - a c e t y l t r a n s f e r a s e ，乙酰c o a ：乙酰c o a 一酰基 转运酶 c d p m e ：4 - ( c y t i d i n e5 - d i p h o s p h o ) - 2 - c m e t h y l d - e r y t h f i t o l ，4 - ( 5 - 焦磷酸胞 苷) 2 c 甲基d - 赤藓醇 c d p - m e p ：4 - ( c y t i d i n e5 - d i p h o s p h o ) - 2 一c - m e t h y l d e r y t h r i t o l 一2 一p h o s p h a t e ，4 - ( 5 焦磷酸胞苷) 2 一c 甲基一d 一赤藓醇- 2 - 磷酸 c m k ：4 - ( c y t i d i n e5 - d i p h o s p h o ) 一2 c m e t h y l - d e r y t h r i t o lk i n a s e ，4 - ( 5 一焦磷酸胞 苷) 2 c 甲基d 赤藓醇激酶 d m a p p ：d i m e t h y l a l l y ld i p h o s p h a t e ，二甲基烯丙基焦磷酸 d x p ：1 - d e o x y d - x y l u l o s e5 - p h o s p h a t e ，l 。脱氧木酮糖一5 一磷酸 d x p s ：1 - d e o x y - d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t es y n t h a s e ，1 - 脱氧一木酮糖一5 磷酸合成酶 d x r ：1 - d e o x y d - x y l u l o s e5 - p h o s p h a t er e d u c t o i s o m e r a s e ，1 - 脱氧木酮糖5 磷酸还 原异构酶 f p s ：f a m e s y ld i p h o s p h a t es y n t h a s e ，法尼基焦磷酸合成酶 g 3 p ：d g l y c e r a l d e h y d e 一3 一p h o s p h a t e ，3 - 磷酸甘油醛 g g p p s ：g e r a n y l g e r a n l y ld i p h o s p h a t es y n t h a s e ，香叶基香叶基焦磷酸合成酶 g p p s ：g e r a n y ld i p h o s p h a t es y n t h a s e ，香叶基焦磷酸合成酶 h d s ：h y d r o x y m e t h y l b u t e n y l - 4 - d i p h o s p h a t es y n t h a s e ，羟甲基丁烯基一4 一磷酸合成 酶 h m b p p ：h y d r o x y m e t h y l b u t e n y l - 4 一d i p h o s p h a t e ，羟甲基丁烯基4 磷酸 h m g c o a ：3 - h y d r o x y - 3 m e t h y l g l u t a r y l - c o a ，3 - 羟基一3 一甲基戊二酰c o a h m g r ：3 - h y d r o x y 一3 一m e t h y l g l u t a r y l c o a r e d u c t a s e ，3 - 羟基- 3 一甲基戊二酰c o a 还 原酶 h m g s ：3 - h y d r o x y 一3 m e t h y l g l u t a r y l - c o as y n t h a s e ，3 - 羟基- 3 甲基戊二酰c o a 合 成酶 i d s ：i p p d m a p p s y n t h a s e ，异戊烯基焦磷酸，二甲基烯丙基焦磷酸合成酶 i p i ：i s o p e n t e n y ld i p h o s p h a t ei s o m e r a s e ，异戊烯基焦磷酸异构酶 i p p ：i s o p e n t e n y ld i p h o s p h a t e ，异戊烯基焦磷酸 m c t ：2 - c m e t h y l d e r y t h r i t o l 一4 - p h o s p h a t ec y t i d y l t r a n s f e r a s e ，2 - c 甲基- d - 赤藓醇 4 磷酸胱氨酰转移酶 m d c ：m e v a l o n a t e 5 d i p h o s p h a t ed e c a r b o x y l a s e ，甲羟戊酸- 5 - 焦磷酸脱羧酶 m e - c p p ：2 - c m e t h y l e r y t h r i t o l2 ，4 - c y c l o d i p h o s p h a t e ，2 - c 一甲基赤藓醇- 2 ，4 - 环焦