（遗传学专业论文）花色调节基因lc转化洋桔梗的研究.pdf

花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 第一部分 文献综述 一 植物花色基因工程的研究进展 花卉种类繁多，颜色五彩斑斓， 但同时也存在一定的缺陷， 如产量不高等、 新品种少和缺少广谱花色花卉 ( 王东辉，2 0 0 2 ) 。多年来育种学家利用传统杂交 育种及定向 选择育种， 培育出了大量花卉的新品 种， 但这种育种方法有其局限性: 在自 然条件下，植物变异频率较低， 新品种出 现极少: 人工诱变虽变异频率高， 但盲目 性较大; 杂交育种优于这两者， 但也存在远源杂交不亲合， 难以 打破物种 生殖隔离的不足 ( 包满珠等，1 9 9 7 ;徐昌杰等，2 0 0 0 ) 。因此导致采用传统育种 法培育一个新品种需要经过多年多次杂交， 不仅育种周期长， 而且， 有些优良性 状有时难以保持。 近年来，生物技术的发展对花卉园艺业产生了重大影响。1 9 8 7年， m c y e r 等首次 将玉米二轻基黄酮醇还原酶d f r 基因转入矮牵牛， 使矮牵牛的 花色发生了 改 变 ( m e y e r , 1 9 8 7 ) . 基因工程在花卉上的应用，极大地推动了 花卉在形、 味、 育种及产量方面的改良 ， 人们能够将外源基因转入花卉中并得到表达，定向修饰 花卉的某个性状而不改变其他性状， 并己在花型、 花色、 株型等方面取得了重要 进展。 1 . 花色形成机理 植物的花色广义上来讲是指显花植物花器官中一切花瓣状结构的颜色， 狭义 则仅指花瓣的颜色( 安田 齐， 1 9 8 9 ) 。 它主要由 三种色素决定: 类黄酮， 类胡萝 卜 素，甜菜色素。这些色素是一些分子量小于3 0 0 0 的次生代谢物质。 三种色素中 类黄酮为主要色素， 花色素昔是类黄酮色素中的最重要一类， 积累在花瓣表皮细 胞的液泡中， 它控制花的紫罗兰色、 蓝色、 红色和粉红色， 其含量增加或减少都 有可能改变花的颜色。花色素昔的合成途径见图1 ( m a r t i n c 等，1 9 9 1 : b r i t i s h 等，1 9 9 3 ; t a n a k a y 等，1 9 9 8 ) 。 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 第一部分 文献综述 一 植物花色基因工程的研究进展 花卉种类繁多，颜色五彩斑斓， 但同时也存在一定的缺陷， 如产量不高等、 新品种少和缺少广谱花色花卉 ( 王东辉，2 0 0 2 ) 。多年来育种学家利用传统杂交 育种及定向 选择育种， 培育出了大量花卉的新品 种， 但这种育种方法有其局限性: 在自 然条件下，植物变异频率较低， 新品种出 现极少: 人工诱变虽变异频率高， 但盲目 性较大; 杂交育种优于这两者， 但也存在远源杂交不亲合， 难以 打破物种 生殖隔离的不足 ( 包满珠等，1 9 9 7 ;徐昌杰等，2 0 0 0 ) 。因此导致采用传统育种 法培育一个新品种需要经过多年多次杂交， 不仅育种周期长， 而且， 有些优良性 状有时难以保持。 近年来，生物技术的发展对花卉园艺业产生了重大影响。1 9 8 7年， m c y e r 等首次 将玉米二轻基黄酮醇还原酶d f r 基因转入矮牵牛， 使矮牵牛的 花色发生了 改 变 ( m e y e r , 1 9 8 7 ) . 基因工程在花卉上的应用，极大地推动了 花卉在形、 味、 育种及产量方面的改良 ， 人们能够将外源基因转入花卉中并得到表达，定向修饰 花卉的某个性状而不改变其他性状， 并己在花型、 花色、 株型等方面取得了重要 进展。 1 . 花色形成机理 植物的花色广义上来讲是指显花植物花器官中一切花瓣状结构的颜色， 狭义 则仅指花瓣的颜色( 安田 齐， 1 9 8 9 ) 。 它主要由 三种色素决定: 类黄酮， 类胡萝 卜 素，甜菜色素。这些色素是一些分子量小于3 0 0 0 的次生代谢物质。 三种色素中 类黄酮为主要色素， 花色素昔是类黄酮色素中的最重要一类， 积累在花瓣表皮细 胞的液泡中， 它控制花的紫罗兰色、 蓝色、 红色和粉红色， 其含量增加或减少都 有可能改变花的颜色。花色素昔的合成途径见图1 ( m a r t i n c 等，1 9 9 1 : b r i t i s h 等，1 9 9 3 ; t a n a k a y 等，1 9 9 8 ) 。 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 酷类，木质素 苯丙氨酸一 一 州 卜肉桂酸一 卜经基肉 桂酸一 一 争 p a l c 4 h 4 c l 香豆酞 c o a 香豆素，酩类 c h s 噢弄 ( 黄色a 一苯基苯乙烯酮 ( 黄色) 三!土甲 丫1 “n 尸 黄酮 ( 无色) f一黄烷酮 d ( 无色 ) fr c 4 栋 橘 红 异类黄酮 八舀t fg 了.qj ns 五卜 r p o !|1亨 f 3 h 黄酮醉 闷 一 一二氢黄酮醉 ( 无色卜 一 一 - 卜3 ( 砖红) 葡糖普天竺葵素 f3h / f3 。 ， 汀 3 s hy h 二氢株皮酮 ( 无色 - 二氢杨梅黄酮 ( 无色) 杏 dfr , ans , 3 gt df味 ans , 3 gt 花青素糖昔 ( 红色)翠雀素糖昔 ( 蓝色) 图1类黄翻类色素的生物合成途径 f i g . 1 b i o s y t h e t i c p a t h w a y o f f l a v o n o i d 花色的不同和色素的组成有复杂关系 ( 表1 ) 0 表 1花色及色素组成 t a b l e 1 f l o w e r c o l o u r a n d p i g m e n t a l c o m p o s i n g ( h a r b o n e , 1 9 6 5 ) 花色色素组成植物 奶油色及象牙色 黄色 橙色 组 卜 红色 褐色 品红或深红 粉红色 淡紫色或紫色 蓝色 黄酮、黄酮醉 纯胡萝 卜 素 纯黄酮醉 橙酮 类胡萝卜 素和黄酮或查尔酮 纯类胡萝卜 素 天竺葵色素十 橙酮 纯天竺葵色素 类胡萝 卜 素+ 花青素 类黄酮+ 花青素 类胡 萝 卜 素+ 花青素 纯花青素 纯甲 基花青素 纯花翠素 花青素+ 辅色素 花青素金属络合物 花翠素+ 辅色素 花翠素金属络合物 高p h 型花翠素 高含量花翠素 金鱼草、大丽花 黄色蔷薇 樱草类 金鱼草 牛角花、荆豆 百合 金鱼草 天竺葵、一串红 郁金香 c h a s m a n t h c l a p e y r o u s 桂竹香、 蔷薇、 山茶、 秋海棠 牡丹、蔷薇 大鸳鸯茉莉、南美马鞭草 矢车菊 蓝茉莉 飞燕草 报春 郁金香2 、兰色荃 黑色 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 2 .花色基因的分类 花色基因包括花器官的 所有基因， f o r k m a n 将所有的 花色基因分为7 类: 控制类黄酮生物合成单个步骤的结构基因; 与类黄酮修饰有关的修饰基因: 开关全部或部分合成途径的调节基因; 影响类黄酮浓度的基因; 与花朵结构 有关的基因 ( 花瓣特定部位产生色素) ; 影响花色的基因或因子 ( 共着色、金 属离子等) ; 控制花瓣毛、乳突、色素细胞的形状和分布、角质层类型等形态 特征的基因 ( f o r k m a n g , 1 9 9 1 ) 。目 前， 利用基因 工程改良 花色的 研究主要集中 在花色素昔 ( 类黄酮类物质)结构基因和调节基因上。 3 .花色素昔基因的研究 花色素昔的合成是由 多个酶参与的一系列复杂的酶促反应过程。 参与 这一合 成过程的基因可以分成两类: 第一类是不同植物种类共同具有的结构基因，直接 编码花色昔代谢生物合成酶: 第二类是调节结构基因活性、 色素空间和时间积累 的调节基因。目 前这两类基因中均已 有被分离和克隆的。 3 . 1结构基因 目 前， 花色素普合成途径 ( 图1 ) 所涉及到的 所有结构基因已 基本被分离和 克隆。己 被研究、 分离和克 隆的主要结构基因及其克隆方法见表2 ， 其中源自 矮 牵牛、金鱼草和玉米的基因相对较多。 ( 1 ) p a l p a l 基因所编码的酶催化苯丙氨酸形成肉 桂酸，由四个亚基组成。p a l 基因活性受光照尤其是紫外光的调节。 在菜豆基因组中有3 个p a l 基因， 只有1 个p a l 基因可在花瓣中 表达。 如果用p a l 2 的启动子接上g u s 编码区转人烟草和 马铃薯， 在转基因植物的花辨中可测到g u s 的高水平表达。 p a l 2 使花青素呈 粉 红色，在花瓣中的表达只局限于粉红色区域 ( 王关林，1 9 9 8 ) . ( 2 ) c h s 该基因 编码的酶催化香豆酞c o a 和丙二酞c o a 缩合成苯基苯乙 烯酮。 该基因编码的酶最先在欧芹中分离克 隆到 ( h e m l e b e n v 等，1 9 8 2 ) ， 但在矮牵牛 中 研究得比 较透彻。 它是一个多 基因家族， 由8 - 1 0 个成员组成。 c h s 基因只在 花中表达，其中以c h s a 基因的表达量最多，占总c h s m r n a 的9 0 % ，其次是c h s j 基因 ( k o e s r e , 1 9 8 9 ) 0 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 2 .花色基因的分类 花色基因包括花器官的 所有基因， f o r k m a n 将所有的 花色基因分为7 类: 控制类黄酮生物合成单个步骤的结构基因; 与类黄酮修饰有关的修饰基因: 开关全部或部分合成途径的调节基因; 影响类黄酮浓度的基因; 与花朵结构 有关的基因 ( 花瓣特定部位产生色素) ; 影响花色的基因或因子 ( 共着色、金 属离子等) ; 控制花瓣毛、乳突、色素细胞的形状和分布、角质层类型等形态 特征的基因 ( f o r k m a n g , 1 9 9 1 ) 。目 前， 利用基因 工程改良 花色的 研究主要集中 在花色素昔 ( 类黄酮类物质)结构基因和调节基因上。 3 .花色素昔基因的研究 花色素昔的合成是由 多个酶参与的一系列复杂的酶促反应过程。 参与 这一合 成过程的基因可以分成两类: 第一类是不同植物种类共同具有的结构基因，直接 编码花色昔代谢生物合成酶: 第二类是调节结构基因活性、 色素空间和时间积累 的调节基因。目 前这两类基因中均已 有被分离和克隆的。 3 . 1结构基因 目 前， 花色素普合成途径 ( 图1 ) 所涉及到的 所有结构基因已 基本被分离和 克隆。己 被研究、 分离和克 隆的主要结构基因及其克隆方法见表2 ， 其中源自 矮 牵牛、金鱼草和玉米的基因相对较多。 ( 1 ) p a l p a l 基因所编码的酶催化苯丙氨酸形成肉 桂酸，由四个亚基组成。p a l 基因活性受光照尤其是紫外光的调节。 在菜豆基因组中有3 个p a l 基因， 只有1 个p a l 基因可在花瓣中 表达。 如果用p a l 2 的启动子接上g u s 编码区转人烟草和 马铃薯， 在转基因植物的花辨中可测到g u s 的高水平表达。 p a l 2 使花青素呈 粉 红色，在花瓣中的表达只局限于粉红色区域 ( 王关林，1 9 9 8 ) . ( 2 ) c h s 该基因 编码的酶催化香豆酞c o a 和丙二酞c o a 缩合成苯基苯乙 烯酮。 该基因编码的酶最先在欧芹中分离克 隆到 ( h e m l e b e n v 等，1 9 8 2 ) ， 但在矮牵牛 中 研究得比 较透彻。 它是一个多 基因家族， 由8 - 1 0 个成员组成。 c h s 基因只在 花中表达，其中以c h s a 基因的表达量最多，占总c h s m r n a 的9 0 % ，其次是c h s j 基因 ( k o e s r e , 1 9 8 9 ) 0 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 ( 3 ) c h 工 苯基苯乙烯酮在c h 工 基因所编码的酶的催化下转变成黄烷醇。目 前， 在矮牵牛中已分离到两个c h i 基因，其中c h i a 基因仅在花组织中表达，在矮牵 牛花瓣中的c d n a 全长约为7 2 6 b p ， 而c h i b 则仅在未成熟的花粉中表达( v a n t u n e n a j , 1 9 8 8 ) 0 ( 3 ) f 3 h f 3 h基因编码的酶催化无色的黄烷酮变成二氢黄烷醇，并将它转移到 液泡中转化成花色昔， 但这个酶在一般条件下不稳定。 f 3 h 基因最早在在金鱼草 被克隆， 其编码的酶具有两个亚基 ( s p a r v o l i f 等，1 9 9 4 ) , ( 4 ) f 3 h f 3 h催化二氢黄酮醇变成二氢栋皮酮，其突变后能 使花中 积累花 葵素， 使花更多地呈现橙色和红色。 f 3 h 已 在香石竹等植物中克隆到，并且， 在不同 植物中被不同的 组织控制， 如在矮牵牛组织中f 3 h 由f f t l 和i n控制， 而在金鱼草中 则由e o s z n a 控制 ( 林泉，1 9 9 8 ) 0 ( 5 ) f 3 5 h f 3 5 h 已在矮牵牛 ( b e l d m 等，1 9 8 9 ) 、马鞭草、茄子、 龙胆 等植物中分离克隆到。 在前两种植物中f 3 5 h 的功能由h f l , h f 2 控制， h f l , h f 2 表达将趋向合成翠雀素普，使花偏蓝。缺乏f 3 5 h的植物，如玫瑰、郁 金香等就不存在蓝花 ( 林泉，1 9 9 8 ) . ( 6 ) d f r d f r 在n a d p h : 存在下催化生 成不稳定 无色花色素 ( w i n k e l - s h i r l y b , 2 0 0 1 ; m a r l e s m a s 等，2 0 0 3 ) . d f r 已 从玉米、 金鱼草、翠菊等植物中 获得，它 的突变能使花色呈象牙色或白色. d f r 在不同植物间的表达存在由空间专一性基 因调节， 在花瓣中的表达与c h s 和c h i 相协调。 ( 7 ) a n s a n s合成的酶将无色花色素催化成花色素，目 前己从拟南芥、玉米 ( m e s s o n a 等，1 9 9 0 ) 等植物中获得。 ( 8 ) 3 g t ( u p 3 g t ) 3 g t 是第一个用转座子标签法克隆到的类黄酮类色素 合成的 结构基因。 其编码的酶能将花色素转变为花色昔， 使花的最大吸收光谱向 紫外线 端移动而呈浅蓝色。 同时， 稳定性和水溶性提高， 减少色素从液泡中 渗漏( z h e n g z l , 1 9 9 4 ) 0 ( 9 ) 其他基因 除花色素昔合成途径 ( 图 1 )中所涉及到的结构基因以外，其他 的 结构基因也会对花色产生影响， 如编码催化花色昔甲 基化、 糖基化和酞基化酶 的基因。目 前，己 经有部分这些基因被发现，如u d p g( 花色普- 5 - 0 - 葡糖基转移 酶) ，a a t( 芳香酞基转移酶)等 ( f u i i w a r a h 等，1 9 9 8 ; n a k a y a m a t 等，2 0 0 0 ) 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 基因。 表2植物花色素昔结构基因的分离和克隆 t a b l e 2 s o m e o f t h e c l o n e d s t r u c t u r a l g e n e r e l a t e d t o f l o w e r c o l o r 分离和克隆的方法 鉴别筛选和杂交筛选 ( d i f f e r e n t i a l s c r e e n i n g a n d s c r e e n i n g b y h y b r i d i z a t i o n ) 同 源配对技术( h o m o l o g y - b a s e d t e c h n i q u e s ) 抗血清方法 ( a n t i s e r u m m e t h o d ) 作者 h e m l e b e n v ( p e t r o s e l i n u m h o t e n s 日 m at t hi o l a i n c a n a2 0 0 3e c k e r m a n n c 转座子 标签技术 ( t r a n s p o s o n t a g g i n g ) 矮 牵牛 ( p e t u n i a ) m e l o n f r u i t 金鱼草 ( a n t i n 叻 i n u re ) 矮牵牛 ( p e t u n i a ) 九r l a n s n i e r a v a n t u n e n a j d i a l l i n a s g s p a r v o l i f 丫胜去u“ h自0 六f f 3 h鉴别筛选与基因图谱 2 0 0 3 2 0 0 2 p e l t j l b e r i t o g n o l o i ( d i f f e r e n t i a l s c r e e n i n g a n d g e n e m a p ) f 3 5 h p c r 扩增技术( p c r a m p l i f i c a t i o n )( p e t u n i a ) ( c o r n )/ ( p o t a t o ) ( c o r n ) 2 0 0 3m o r i s 转座子标 签技术 ( t r a n s p o s o n t a g g i n g ) 转座子标签技术 ( t r a n s p o s o n t a g g i n g ) 转座子标签技术 ( t r a n s p o s o n t a g g i n g ) 2 0 0 3d e j o n g鹅 2 0 0 3j a a k o l a l 玉米 ( c o r n )2 0 0 3 f u k u c h i - m i z u t a n i m dfrans3gt 3 ， 2调节基因 花色素昔生物合成由多步酶促反应完成， 在这一复杂的过程中， 调控基因影 响着结构基因的表达方式、 表达强度和积累， 每一步酶促反应均是调控基因作用 的靶位点。通过结构基因酶活性或m r n a 表达分析可详细了解带有不同调控位点 的植物的调节作用部位， 已证实许多调控基因作用于两个或多个花色素昔生物合 成途径的结构基因( d o o n e r h k , e t a 1 . 1 9 9 1 ) 。目 前利用转座子标签等技术，已 在不同植物中分离和克隆了 一系列花色素昔的调节基因 ( 周音等， 2 0 0 0 ) 0 调节基因主要可以 分为两类: m y 。 型转录因子和m y b 型转录因子 ( 表3 ) 。 这 两 类调节基因都能结合特定d n a 序列， 活化相应启动子， 并且可能存在相互激活 作用 ( g o f f s a 等，1 9 9 2 ; m a r t i n c 等，1 9 9 1 ) ，但也有实验报道并无相互激活 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 作用 ( b o v y a 等， 2 0 0 2 ) 。目 前对花色素着生物合成调节的研究主要集中于金鱼 草、 矮牵牛、 玉米等材料 ( d o o n e r h k 等，1 9 7 7 ; t o n e l l i c 等， 1 9 9 1 ; l u d w i n g s r , 1 9 8 9 ; m a r t i n c 等，1 9 8 8 ) ， 现在在玉米中的研究尤为 透彻。 表3目 前己 知的部分型调节基因 t a b l e 3 s o m e o f t h e r e g u l a t o r y g e n e s c 基因类型来源作者及克隆时间 p l - c h r r l c s c l s n e l u t a d e l i l a a n 1 , a n 2 , a n 4 , a n l l g l 3 f a p - 1 玉米 ( c o r n ) 玉米 ( c o r n ) 玉米 ( c o r n ) 玉米 ( c o r n ) 玉米 ( c o r n ) 玉米 ( c o r n ) 金鱼草 ( a n t i r r h i n u m ) 金鱼草 ( a n t i r r h i n u m ) 矮牵牛 ( p e t u n i a ) 矮牵牛 ( p e t u n i a ) 拟南芥 ( a r a b i d o p s i s ) j a e - y o u l j o u n g / 2 0 0 3 c h a n d l e r v l ( 1 9 8 9 ) l u d w i g s r ( 1 9 8 9 ) p a t t e r s o n g i ( 1 9 9 1 ) c o n e k c ( 1 9 8 6 ) /s i n g e r t ( 1 9 9 8 ) t o n e l l i c ( 1 9 9 1 ) m a r t i n c ( 1 9 9 1 ) g o o d r i c h j ( 1 9 9 2 ) s p e l t c ( 2 0 0 0 ) r a m s a y n a ( 2 0 0 3 ) d e p a t e r s ( 1 9 9 7 ) 型型型型型型型型型型型 ycycycycyb油 mmmmmm ccc，b，d 畔畔my畔则 玉米含有m y c 和m y b 两种类型的调节基因， 几乎作用于整个植物花色素昔生 物合成的所有结构基因， 在c h s 基因表达阶段可能例外。 m y c 型的r 基因家族决 定花色素普色素表达的时间、 分布和数量， 并且在种子和植株的不同部位， 每个 基因都决定一种组织特异性色素 ( g a b r i e l l a c o n s o n n i 等，1 9 9 3 ) : 在不同 光和 细胞分裂素条件下， m y b 型调节基因只能增加花色素昔色素的积累， 而不能使某 种特定花色素昔色素表达( p i a z z a p 等， 2 0 0 2 ) . r 基国调控种子糊粉层( d o o n e r h k等，1 9 7 7 ; l i n n f等，1 9 9 0 ) 、盾片节和幼苗中胚轴的 c h s基因表达阶段 ( t o n e l l i c , e t a 1 . 1 9 9 1 ) 。金鱼草的2 个调节基因d e l i l a 和e l u t a 对早期c b s 和c h i 基因表达阶段表现微量调控， 主要对花色素昔生物合成的后阶段起调节作 用 ( a l m e i d a j 等，1 9 8 9 ; m a r t i n c 等， 1 9 9 1 ) 。 在f 3 h 到u p 3 g t 的4 个合成阶段， 调节基因d e l 工 l a 是必需的，而e l u t a 和r o s e a 对这4 个阶段结构基因的调控表 现为量的调节。 矮牵牛中， 结构基因c h s , c h i , f 3 h 不被4 个调节基因a n 1 a n 2 , a n 1 0 和a n 1 1 调节 ( m a r t i n c等， 1 9 9 1 ; g e r a t s a g等，1 9 9 1 ) ，同时这四个调节 基因 对u p 3 g t 酶活性和d f r 的m r n a 表达量调控类似于在金鱼草中， 这表明对矮 牵牛花色素昔合成的调控开始于d f r 以后各阶段，比金鱼草( 开始于f 3 h以后各 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 阶段) 晚一个阶段受到调控 ( 余迪求，1 9 9 1 ) 0 目 前在单子叶植物玉米中研究调节基因对结构基因的调控发现， 在单子叶植 物玉米中， 这两类调节基因可能存在相互激活作用， 同时在空间上存在某种协同 作用，能够以 共同的空间信号调控各自 的活动从而调控不同的结构基因的表达。 b o v y a 等人 ( 2 0 0 2 )的试验结果证实了 这一假设。 他们将这两类调节基因c l 和 l c 转入番茄中，发现单转c i 基因黄酮醇物质并没有表达，而单转l c 基因黄酮 醇 物质表达， 同时转两种基因黄酮醇的 表达量大大增加。 d e j o n g w s 等人( 2 0 0 3 ) 对马铃薯的花色素昔生物合成的研究中发现， 不同的m y c 型调节基因也能控制不 同花色素普色素的合成。 在单子叶植物中调节基因通过转录因子激活花色结构基 因来控制花色， 但在双子叶植物中还存在调节基因通过影响花瓣汁液p h 值最终 改变花色 ( s p e l t c e t a 1 . , 2 0 0 2 ) 。 这表明双子叶植物的花色形成比单子叶植 物更复杂，受到更多调节基因的调控。 4 . 花色的其他影响因子 花色除了受到基因的内部控制以 外， 还受其他因子影响， 如花色素营的结 构: 花色素昔所有的轻基数，甲基化糖基化程度、数目、种类等都会影响花色表 达， 使花从橙色到黑色表现出 广泛的颜色 ( m a z z a g等，1 9 9 3 ) 0 细胞的液泡 内p h 值: 在植物液泡中， 花色素昔通常以 阳 离子形式存在， 因此， 花瓣表皮细胞 液泡内p h 值发生变化通常能引 起花色的改变， 一般p h 上升花色由 红变蓝， 月季 很多种类中的花瓣p h 为3 . 5 6 -5 . 3 6 ， 而开淡蓝或紫色花的月季其p h 则偏高( 邱 辉龙等， 1 9 9 8 ) 0 分子堆积作用: 分子堆积指分子间堆积和分子内堆积。 分子间 堆积包括花色昔的自 连作用和辅助着色作用，从而产生从紫到蓝色色系的现象， 其色彩对p h 值的微小变化极其敏感 ( t a n a k a y 等，1 9 9 8 ) .鳌合作用: 花色素 昔b 环上的0 - d i h y d r o x y l ( 邻二轻基) 可与细胞液中的m g , f e . 等离子鳌合，形 成高 度着色且稳定的金属鳌合物，导 致花色偏向 蓝紫色 ( 郑志亮，1 9 9 6 ) . 花 瓣表皮细胞形状: 细胞形状有利于增加对入射光的吸收的花会产生较深的颜色， 反之花色则比 较明亮。 一般认为细胞呈圆锥形有利于增加入射光进入表皮细胞的 比例。因此，具有圆锥形突起的花瓣颜色都较深 ( 于晓南等， 2 0 0 2 ) . 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 阶段) 晚一个阶段受到调控 ( 余迪求，1 9 9 1 ) 0 目 前在单子叶植物玉米中研究调节基因对结构基因的调控发现， 在单子叶植 物玉米中， 这两类调节基因可能存在相互激活作用， 同时在空间上存在某种协同 作用，能够以 共同的空间信号调控各自 的活动从而调控不同的结构基因的表达。 b o v y a 等人 ( 2 0 0 2 )的试验结果证实了 这一假设。 他们将这两类调节基因c l 和 l c 转入番茄中，发现单转c i 基因黄酮醇物质并没有表达，而单转l c 基因黄酮 醇 物质表达， 同时转两种基因黄酮醇的 表达量大大增加。 d e j o n g w s 等人( 2 0 0 3 ) 对马铃薯的花色素昔生物合成的研究中发现， 不同的m y c 型调节基因也能控制不 同花色素普色素的合成。 在单子叶植物中调节基因通过转录因子激活花色结构基 因来控制花色， 但在双子叶植物中还存在调节基因通过影响花瓣汁液p h 值最终 改变花色 ( s p e l t c e t a 1 . , 2 0 0 2 ) 。 这表明双子叶植物的花色形成比单子叶植 物更复杂，受到更多调节基因的调控。 4 . 花色的其他影响因子 花色除了受到基因的内部控制以 外， 还受其他因子影响， 如花色素营的结 构: 花色素昔所有的轻基数，甲基化糖基化程度、数目、种类等都会影响花色表 达， 使花从橙色到黑色表现出 广泛的颜色 ( m a z z a g等，1 9 9 3 ) 0 细胞的液泡 内p h 值: 在植物液泡中， 花色素昔通常以 阳 离子形式存在， 因此， 花瓣表皮细胞 液泡内p h 值发生变化通常能引 起花色的改变， 一般p h 上升花色由 红变蓝， 月季 很多种类中的花瓣p h 为3 . 5 6 -5 . 3 6 ， 而开淡蓝或紫色花的月季其p h 则偏高( 邱 辉龙等， 1 9 9 8 ) 0 分子堆积作用: 分子堆积指分子间堆积和分子内堆积。 分子间 堆积包括花色昔的自 连作用和辅助着色作用，从而产生从紫到蓝色色系的现象， 其色彩对p h 值的微小变化极其敏感 ( t a n a k a y 等，1 9 9 8 ) .鳌合作用: 花色素 昔b 环上的0 - d i h y d r o x y l ( 邻二轻基) 可与细胞液中的m g , f e . 等离子鳌合，形 成高 度着色且稳定的金属鳌合物，导 致花色偏向 蓝紫色 ( 郑志亮，1 9 9 6 ) . 花 瓣表皮细胞形状: 细胞形状有利于增加对入射光的吸收的花会产生较深的颜色， 反之花色则比 较明亮。 一般认为细胞呈圆锥形有利于增加入射光进入表皮细胞的 比例。因此，具有圆锥形突起的花瓣颜色都较深 ( 于晓南等， 2 0 0 2 ) . 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 5 . 花色的基因工程改良 5 . 1 花色的基因工程改良 策略 花色一般都由多基因控制， 因此利用基因工程技术改变花色性状的基本策略 是还原法， 即想要修饰某个性状， 首先要明确该性状的 特异生化物质， 然后对形 成该生化物质的代谢途径进行基因工程操作，具体就是分析催化各反应步骤的 酶、编码这些酶的基因和它的表达调控 ( 傅荣昭等，1 9 9 5 ) .因此，对于多步骤 代谢、 多基因控制的花色来说， 控制某种关键酶的表达往往是改变花色的一个很 好的切入点。 增强这种关键酶的表达， 可以促使代谢合成沿催化产物的方向进行， 反之， 则朝另一分支进行， 导致另一种代谢物的积累。 通过增加或减少花色素昔 生物合成中 代谢产物的累积， 就是改变植物组织中色素的含量和组分， 最终改变 植物的 花色。 目 前， 利用农杆菌介导法或基因枪法为基础的基因工程改良 花色的 研究基本上都是按照这个策略来进行的。具体方法如下: 5 . 1 . 1核酶的应用 核酶是一种具有剪切催化功能的r n a 分子， 它可特异性地剪切单链r n a 分子 使其失活。 通过在植物中 利用基因 枪法导入特定的核酶， 使花色素昔合成过程中 某些结构基因所转录的r n a 被特异性剪切， 使其不能正常翻译成蛋白， 最终导致 色素代谢产物的减少， 使组织的色素发生改变。 该技术可用来特异性抑制类黄酮 或类胡萝卜 素生物合成基因的表达，从而改变花色 ( 林泉，1 9 9 8 ) . 5 . 1 . 2反义技术 花卉花色改良 中的反义技术是指 将关键酶的反义链连接启动子后转化植物， 这种反向d n a 转录成的m r n a 能与内 源的互补m r m a 结合， 抑制靶基因的活性和相 应酶的合成， 从而改变花色。 荷兰自 由 大学首先采用此方法改变矮牵牛花色( v a n d e r 等，1 9 8 8 ) 。 他们将反义c h s 基因片段导入矮牵牛，使转化株产生有各种花 斑和开白花的新品种。 此技术的优点是调节基因活动而不改变基因结构， 从而可 避免外源基因对植物体自 身基因组的 破坏。 5 . 1 . 3共抑制技术 共抑制技术是指将植物本身具有的基因的正向拷贝导入植物， 使该基因的内 外源d n a 片段一起发生共抑制。 共抑制得到的转化体性状稳定， 但其内源基因已 被抑制。李艳等将 c h s a基因导入矮牵牛，利用共抑制作用降低了矮牵牛的内 花色调节基因lc转化洋桔梗的 研究 源c h s 基因的表达，导致花色改变 ( 李艳等， 2 0 0 1 ) 。由s u z u k i 等人 ( 2 0 0 0 )的 研究显示，不同花色基因的共抑制作用是不同的， 如f 3 5 h 的共抑制使蓝猪 耳开粉红花，而d f r 和c h s 的共抑制则开白或蓝白 相间的花。 5 . 1 . 4导入外源结构基因 导入某种植物本身没有或缺乏的基因， 来补充合成某些颜色的基因。 如玫瑰 中缺乏f 3 5 h 而没有蓝色，导入这种基因就有可能得到蓝色玫瑰。 天竺葵、 樱草没有黄色， 莺尾没有鲜红色， 导入相关基因也可能得到新的花色。 澳大利亚 的c a l g e n e p a c i f i c 基因公司和日 本s u n t o r y 合作将克隆到的f 3 5 h 转入到 蔷薇， 得到了新的 蓝色蔷薇 ( h o l t o n t a 等，1 9 9 3 ) . 5 . 1 . 5导入调节基因 调节基因可以激活特定靶基因( 结构基因) ， 使花色素昔代谢途径发生改变， 最终使花色改变。玉米b 基因 ( m y c 型) 导入白花三叶中引起了其叶片着色方式 的改变。 h e a t h e r 等人将l c , c 1 基因导入首蓓中导致花色发生改变 ( r a y h 等， 2 0 0 3 ; b o v y a 等，2 0 0 2 ) . 5 . 2 花色结构基因和调节基因的应用 目 前， 利用花色结构基因和调节基因， 借助基因工程技术已使很多植物的花 色发生改变。 通过抑制一个或多个花色素昔合成过程中的结构基因， 可以改变花 色素昔含量的积累， 得到具有白 色或浅色的花。 目 前利用这一方法已 经得到了 许 多 花色变浅的转基因植物，见表4( 张石宝等， 2 0 0 1 ) . 分析表4 的研究结果显示， 在开深色花的植物中导入花色素昔合成途径中的 上游结构基因的正义或反义序列， 结构基因的作用在一定程度受到抑制， 花色最 终变浅: 而在开浅色系花的植物中导入花色素昔合成的下游结构基因， 花色则会 出 现一定程度的 变深， 如在白 色康乃馨中分别导入f 3 5 h , d f r 基因 和h f l , d f r 基因， 花色分别呈现紫罗兰和紫色 ( 张石宝等， 2 0 0 1 ) . 澳大利亚的c a l g e n e p a c i f i 。 基因公司和日 本s u n t o r y 合作将克隆到的f 3 5 h 转入到蔷薇， 得到 了新的蓝色蔷薇 ( h o l t o n t a 等，1 9 9 3 ) . 花色调节基因 l c 转化洋桔梗的研究 表4 己获得的改变花色的转基因花卉 t a b l e 4 t r a n s g e n e t i c f l o r a l c r o p s o f m o d i f i e d c o l o r 受体植物 ( 原花色) h o s t s p e c i e s ( c o l o r ) 矮牵牛 ( 紫色) 矮牵牛 ( 紫罗兰色) 矮牵牛 ( 紫色) 菊花 ( 红色) 非洲菊 ( 红色) 康乃导 ( 粉红色) 玫瑰 ( 红色) 蝴蝶草 ( 蓝色) 康乃馨 ( 红色) l i s i a n t h u s( 紫色) 矮牵牛 ( 紫色) 矮牵牛 ( 白 色) 矮牵牛 ( 深紫) 矮牵牛 ( 红色) 导入的外源基因 e x o g e n o u s g e n e 反义c h s - a 正义c h s - a 正义c h s - a 正义 c h s 反义 c h s 反义c h s . d f r 正义c h s 正义 c h s 正义c h s . d f r 正义c h s . d f r 反义c h s , d f r 反义f 3 h 反义c h s 正义c h s 正义 c h s 正义 c h s 正义 d f r 表型 p h e n o t y p e 白色 白色 白色 白色 浅红 粉红 浅粉 粉红 白色 浅蓝 浅蓝 白色 白 色 白色或紫白相间 淡黄 淡紫 砖红色 目 前， 通过不同学者的研究发现， 在植物中导入一系列的调节基因， 也可得 到花色和株色发生改变的转基因植株，并且，这种改变是可遗传的 ( 表5 ) 。 表5 已获得的改变花色的转荃因花卉 t a b l e 5 t r a n s g e n e t i c f l o r a l c r o p s o f m o d i f i e d c o l o r 受体植物表型 h o s t s p e c i e s 导入的外源基因 e x o g e n o u s g e n ep h e n o t y p e 红白相间 绿中带红点 作者及年份 a u t h o r / t i m e 烟草 ( 花色桃红) 白花三叶( 叶片钝绿) 首偕 ( 花色白 色) 拟南芥 ( 花色红色) 烟草 ( 花色粉红) p l - c h r b l c r 和 c l r 和 c l 粉红 花色变深 红色 j a e - y o u l j o u n g / 2 0 0 3 m a j n i k / 2 0 0 0 r a y h 刀0 0 3 l l o y d a m / 1 9 9 2 l l o y d a m / 1 9 9 2 j a e - y o u l j o u n g 等人分离了p l - c h r 基因， 他们研究认为p l - c h r 可能存在 一个小的基因家族，将它导入开桃红花的烟草内得到了白红相间的花色 ( j a e - y o u l j o u n g 等， 2 0 0 3 ) . m a j n i k 将玉米b 基因 ( m y c 型)导 入白 花三叶中 引 起了 其叶片着色方式的改变，且 这种变化可稳定遗传 ( m a j n i k j 等， 2 0 0 0 ) e 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 s p e l t c 等 ( 2 0 0 2 ) 还发现调节基因a n l , a n 2 等能影响花瓣汁液的p h 值，使突 变体细胞内p h 发生改变， 从而影响花色。 最近又有人报导导入玉米l c 基因后首 蓓花色由白 色转为粉红 ( r a y h 等，2 0 0 3 ) 0 上述研究表明， 目 前我们对植物花色的改造主要可以通过主要可从两个方面 入手: 在植物中导入花色结构基因和花色调节基因， 而且两种基因遗传转化都是 可行的.本实验室目 前的工作之一，就是将r 族花色调节基因中的l c 基因导入 不同花色的同种植物中，希望获得花形、花色发生改变的转基因的新品系。 5 . 3花色基因工程改良的问题与展望 花色改良 的基因工程与其他的基因工程相比有其特殊性， 具体表现如下: 1 . 启动子的 特殊性。 花 色改良 须 使基因 在 花 器官 表 达， 这就 要求有一种 特殊的 花特 异表达启动子。目 前， 矮牵牛 ( v a n d e r m e e r i m 等，1 9 9 0 ) 、 拟南芥 ( w a t a n a b e k 等， 2 0 0 3 ) 等的c h s 系列启动子， 都是不错的选择。 2操作系统复杂。 花色是 多代谢途径， 因此导入一个基因或只考虑一个方面可能很难达到预期的花色改变 的效果。 现在很热门的培育蓝色花卉就是一个很好的例子。 蓝花需要有四个条件 ( 李美茹等， 2 0 0 3 ; h o l t o n t a , 1 9 9 4 ) :翠雀素即蓝色基因、高p h 值 ( 5 . 0 ); 甲 基化、 酞基化程度高 和存在助色素黄酮或黄酮醇。因此单纯导入f 3 5 h 并 不一定得到蓝色花卉。 3 . 选材难。 要进行基因工程操作， 必须有一个比较成熟的 转化系统。目 前， 花卉的成熟转化系统建立的不多， 只有一些模式植物如矮牵牛 等。 因此， 首先需要的就是建立更多的花卉的成熟转化系统， 本实验室目 前很大 的工作就是尝试建立不同的花卉转化体系. 4 . 可能 对植物造成致命的伤害。 类黄 酮类的代谢不仅与色素有关， 同时它还与花粉粒的形成及其植物的发育有关。 因 此阻断类黄酮合成代谢中的某一过程就有可能阻碍了花粉粒的形成， 最终导致雄 性不育 ( s h a g l 等，1 9 9 6 ) . 尽管花卉的基因工程存在上述的特殊性和难度， 同时在环境的安全性方面也 存在问题: 基因逃逸而污染环境， 产生的次生有害代谢物质， 花卉杂草化等， 但 是它的市场前景仍然非常乐观，原因在于: 1花卉业作为现代高效农业的代表之一， 具有高投入、 高产出、 高效益的典 型特点， 其经济利益远远 高于粮棉等农作物，平均利润可高达 4 0 % -6 0 % ，有的 更高达 1 0 0 % 。据联合国贸易组织的最新统计资料显示，2 0 0 4 年世界花卉消费额 花色调节基因l c 转化洋桔梗的研究 己经超过2 0 0 亿人民币。 但是，在目前的花卉国际贸易中，发达国家占8 0 % .发 展中国家只占2 0 % 0 荷兰作为世界上最大的切花出口国，盆景盆花出口国，其每 年的 鲜切花、花卉球茎、观赏树木和植物出口总值达6 0 亿美元。据中国花卉协 会的统计， 中国花卉业从八十年代起步， 九十年代后进入快速发展期。目 前， 我 国的花卉生产总面积已 达8 . 6 万公顷，居世界第一，年产总值达%亿元，年创 汇1 . 3 亿美元， 增长速度超过任何一个花卉发达国家。 目 前的花卉发展已 从简单 的数量型增长转向效益型增长， 花卉产业己初具规模。 近年来， 随着经济的发展、 生活水平的提高和消费观念的转变， 花卉正走入千家万户， 花卉消费额持续递增， 形成一个潜力无穷的