（遗传学专业论文）丹参酮生物合成途径相关酶基因的克隆和特征分析.pdf

丹参酮生物合成途径相关酶基因的克隆和特征分析 摘要 丹参始载于神农本草经，为我国传统名贵中药材，具有祛瘀止痛、活血调经、 养心除烦等功效。丹参主要成分包括脂溶性的二萜醌类化合物( 丹参酮类成分) 和水 溶性的酚酸类化合物，二者均具有较强的药理活性，其中以丹参酮i i a 为代表的二 萜醌类化合物在抑菌、消炎、抗氧化及抗癌等方面有着广泛的应用，临床需求巨大。 但是，由于丹参生长周期长( 2 年以上) ，在传统的栽培模式下，面临着品质严重退 化、生产成本相对过高等诸多弊端；通过化学合成的方法，其过程十分的繁琐，成 本极高且易造成环境污染；在离体条件下的细胞培养方法获得的细胞其活性成分积 累量很低而且稳定性很差。因此，利用现代基因工程技术将丹参药用活性成分生物 合成途径中的关键酶基因导入到丹参中，获得转基因的发根、细胞系或再生植株， 并进行大规模的培养，是提高丹参药用活性成分的含量和解决丹参药源问题的最佳 途径。而有关丹参次生代谢产物生物合成途径方面的研究报道较少，因此本实验以 丹参为材料，以c d n a 末端快速扩增( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ，r a c e ) 为技术平台，以同源克隆为基本思路，首次克隆得到了三个与丹参酮类成分次生代 谢相关的基因：( 卜d e o x y d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t es y n t h a s ei ) 卜脱氧木酮糖一5 一 磷酸合成酶工，( 卜d e o x y d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t es y n t h a s eii ) 卜脱氧木酮糖一5 一 磷酸合成酶i i 和( 3 - h y d r o x y 一3 一m e t h y l g l u t a r y 卜c o as y n t h a s e ) 3 一羟基一3 一甲基戊 二酰辅酶a 合成酶的全长c d n a 序列，并从其序列特征分析、表达分析、诱导调控等 方面开展了一系列的工作，并取得了以下成果： 1 、成功地从丹参中克隆出了s m d x s i 基因，该基因全长2 5 1 9b p ，包含一个完 整的2 1 4 5b p 的开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) ，编码7 1 4 个氨基酸残基。 根据蛋白比对的结果，s m d x s i 基因编码的氨基酸序列与其它物种中报道的已知d x s i 蛋白序列具有高度的同源性。序列分析发现该蛋白含有一个硫胺素焦磷酸盐绑定区 域( t h i a m i np y r o p h o s p h a t eb i n d i n gd o m a i n ) ，一个保守的嘧啶绑定区域( d r a g d o m a i n ) ，和一个保守的组氨酸残基。组织特异性表达分析结果表明，s a 9 7 x s i 基因 在丹参中为组成型表达，且叶中的表达比茎和根高，根罩表达很弱。丹参毛状根诱 导处理结果表明，诱导子处理对s m d x s i 基因的表达基本上没有影响，为非诱导应答 型基因。 2 、成功地从丹参中克隆出了泐格，瑾因，该基因全长2 5 2 2b p ，包含一个完整 的2 1 7 5b p 的开放阅读框，编码7 2 4 个氨基酸残基。根据蛋白比对的结果，s m d x s i i 基因编码的氨基酸序列与其它物种中报道的已知d x s i i 蛋白序列具有高度的同源性。 序列分析发现该蛋白含有一个硫胺素焦磷酸盐绑定区域( t h i a m i np y r o p h o s p h a t e b i n d i n gd o m a i n ) ，一个保守的嘧啶绑定区域( d r a gd o m a i n ) ，和一个保守的组氨酸 残基。组织特异表达分析结果表明，觥，瑾因不是一个组成型表达的基因， 觥，瑾因在根里表达量最高，在茎和叶里几乎检测不到表达。丹参毛状根诱导处 理结果表明，泐格，基因至少在转录水平上受到诱导调控，是一个诱导应答型的基 因，m j 、a g + 均能非常有效地诱导铴砒5 i 厂瑾因表达水平的上调。其中m j 的诱导效应 相对显著。 3 、成功地从丹参中克隆出了砌翩般5 基因，该基因全长1 6 5 5b p ，包含一个完整 的1 3 8 3b p 的o r f ，编码4 6 0 个氨基酸残基。根据蛋白比对的结果，砌翩躲5 基因编码的 氨基酸序列与其它物种中报道的已知h m g s 蛋白序列具有高度的同源性。组织特异性 表达分析结果表明，该基因在丹参中为组成性表达，在叶片中的表达最为强烈，在 茎部的表达次之，在根里的表达最弱。丹参毛状根诱导处理结果表明，砌棚舨灌因 至少在转录水平上受到诱导调控，也是一个诱导应答型的基因，m j 、y e 均能诱导 搠段噬因表达水平的上调。 本文系统地从丹参中克隆到了三个与丹参酮生物合成相关的基因，为今后利用 基因工程技术改良丹参、提高丹参酮类次生代谢产物含量打下了坚实的基础；分析 了丹参酮生物合成途径中的三个相关酶基因在丹参不同部位的组织特异表达特征， 为深入了解丹参酮类成分在不同部位的含量差异的遗传基础提供了初步的分子证 据；比较分析了m j 、y e 和a g + 三种诱导子对丹参酮生物合成途径的调控效应，从基 因表达水平上探讨了这些诱导子对丹参酮生物合成途径可能的分子调控机制，具有 十分重要的理论和现实意义。 关键词：丹参；丹参酮；次生代谢；r a c e ；卜脱氧木酮糖- 5 - 磷酸合成酶i ；卜脱氧 木酮糖一5 一磷酸合成酶i i ：3 一羟基一3 一甲基戊二酰辅酶a 合成酶；诱导子 l l a b s t r a c t d a n s h e n ，f i r s tr e c o r d e di nt h es h e nl o n g sh e r b a lc l a s s i c ，w a saf a m o u st r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n a lh e r b ，w h i c hh a se f f e c t ss u c ha s d i s s o l v i n gs t a s i sa n do d y n o l y s i s ， b l o o d a c t i v a t i n ga n dr e g u l a t i n go ft h em e n s t r u a lf u n c t i o n ，n o u r i s h i n gt h eh e a r ta n d r e l i e v i n gr e s t l e s s n e s s t h ea c t i v ei n g r e d i e n t so fs m i l t i o r r h i z aw e r ef a t s o l u b l ed i t e r p e n e q u i n i n ec o m p o u n d sa n dw a t e r - s o l u b l ep h e n o l i ca c i do n e s ，b o t ho fw h i c hh a ds t r o n g p h a r m a c o l o g i c a la c t i v i t y t h ed i t e r p e n eq u i n i n ec o m p o u n d s ，s u c ha st a n s h i n o n ei i a ， w e r ew i d e l ya p p l i e di nb a c t e r i o s t a s i s ，d i m i n i s h i n gi n f l a m m a t i o n ，o x i d a t i o nr e s i s t a n c ea n d a n t i c a n c e re ta l ，s ot h ec l i n i c a lr e q u i r e m e mi st r e m e n d o u s h o w e v e r , b e c a u s eo ft h el o n gg r o w t hc y c l e ( m o r et h a nt w oy e a r s ) ，t h e r ew e r em a n y d e f e c t si nt h es m i l t i o r r h i z a st r a d i t i o n a lc u l t u r e ，s u c ha st h ed e g e n e r a t i o no fq u a l i t y , a n d t h er e l a t i v el a r g ec o s to fp r o d u c t i o n ；t h e r ew e r ea l s om a n yd e f e c t si nt h ec h e m o s y n t h e s i s ， s u c ha st h ec o m p l i c a t e d c o u r s e ，t h eh u g ec o s t ，t h ee n v i r o n m e n tp o l l u t i o n ；t h ea c t i v e i n g r e d i e n t sp r o d u c t i o nw e r ev e r yl o wa n du n s t a b l ei nc e l lc u l t u r e t h em o d e mg e n e t i c e n g i n e e r i n gt e c h n o l o g i e sw e r eu s e dt op u tt h ek e y - e n z y m eo ft h em e t a b o l i cp a t h w a yi n t o t h es m i l t i o r r h i z a sg e n o m ea n dt h e nt h et r a n s g e n e t i ch a i r yr o o t ，t r a n s g e n e t i cc e l ll i n e a n dt h er e g e n e r a t i o np l a n tw e r eg a i n e da n dt oh ec u l t i v a t e do nal a r g es c a l e t h e s e m e t h o d sc a np r o v i d eu san e ww a yt o p r o d u c et a n s h i n o n e sa n dt h i sw a yc a nb e c o n s i d e r e da sa no p t i m a lp a t ht or e s o l v et h ep r o b l e ms u c ha st h el o wp r o d u c t i o no f t a n s h i n o n e sa n dt h et h es h o r t a g eo ft h es m i l t i o r r h i z a sr e s o u r c e s u n t i ln o w , t h e r ea r ef e wr e s e a r c h e sa n dr e p o r t so ft h em o l e c u l a rb i o l o g ya b o u tt h e b i o s y n t h e s i so fs m i l t i o r r h i z a ss e c o n d a r ym e t a b o l i t e s s ot h es m i l t i o r r h i z aw a su s e da s e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l ，r a c ew a su s e da st e c h n o l o g yp l a t f o r ma n dt h eh o m o l o g o u s c l o n eu s e da se x p e r i m e n t a lc o n s i d e r a t i o n si nt h i se x p e r i m e n t t h r e eg e n e s ，i n v o l v e dt h e t a n s h i n o n e s b i o s y n t h e s i s ，w e r e f i r s tc l o n e da n d c h a r a c t e r i z e d ，i n c l u d i n g ： 1 - d e o x y - d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t es y n t h a s e i ，1 - d e o x y d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t es y n t h a s e l i ， 3 - h y d r o x y 一3 m e t h y l g l u t a r y l c o e n z y m ea t h et i s s u ee x p r e s s i o np r o f i l ea n a l y s i sa n dt h e e x p r e s s i o np r o f i l ea n a l y s i st r e a t e dw i t ht h ee l i c i t o r sw e r ea l s ot e s t e di nt h i se x p e r i m e n t i i i t h er e s u l t so b t a i n e dw e r es h o w e da sb e l o w 1 an e wf u l l l e n g t hc d n a ( 2 519 b p ) e n c o d i n g1 - d e o x y d x y l u l o s e 5 - p h o s p h a t e s y n t h a s ei ( d e s i g n a t e da ss m d x si ) w a ss u c c e s s f u l l yi s o l a t e df r o ms m i l t i o r r h & ab y r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ( r a c e ) 。t h ef u l l - l e n g t hc d n ac o n t a i n da2 14 5 b p o r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) ，e n c o d i n gad e d u c e dp r o t e i no f7 14a m i n oa c i dr e s i d u e s a m i n oa c i ds e q u e n c ec o m p a r i s o na n a l y s i ss h o w e dt h a ts m d x sih a dh i g hs i m i l a r i t y w i t hd x s if r o mo t h e rr e p o r t e dp l a n t s s q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h i sp r o t e i n c o n t a i n e dat p pb a n d i n gd o m a i n ( t h i a m i np y r o p h o s p h a t eb i n d i n gd o m a i n ) ，ac o n s e r v e d ( d r a gd o m a i n ) a n dac o n s e r v e dh i s t i s s u ee x p r e s s i o np r o f i l ea n a l y s i ss h o w e dt h a t s m d x s lw a sd e t e c t e di na l lt e s t e dt i s s u e sb u ta td i f f e r e n tl e v e l sw i t ht h eh i g h e s t e x p r e s s i o ni nl e a v e s ，f o l l o w e db yi ns t e m sa n dr o o t s ，s oi tw a sc o n s i d e r e dt o b ea c o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s i n gg e n e t h ep r o f i l eo fs m d x s lu n d e ri n d u c t i o no fe l i c i t o r s s h o w e dt h a tt h ee l i c i t o r st r e a t m e n t sh a d f e we f f e c to nt h ee x p r e s s i o no fs m d x s lw h i c h w a sn o ta ne l i c i t o r s - r e s p o n s i v eg e n e 2 an e wf u l l - l e n g t hc d n a ( 2 5 2 2 b p ) e n c o d i n g1 - d e o x y d - x y l u l o s e5 - p h o s p h a t e s y n t h a s ei ( d e s i g n a t e da ss m d x s l l ) w a ss u c c e s s f u l l yi s o l a t e df r o ms m i l t i o r r h i z ab y r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ( r a c e ) t h ef u l l l e n g t hc d n ac o n t a i n da2 17 5 b p o r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) ，e n c o d i n gad e d u c e dp r o t e i no f7 2 4a m i n oa c i dr e s i d u e s a m i n oa c i ds e q u e n c ec o m p a r i s o na n a l y s i ss h o w e dt h a ts m d x s i ih a dh i 曲s i m i l a r i t y w i t hd x s i if r o mo t h e rr e p o r t e dp l a n t s s q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h i sp r o t e i n c o n t a i n e dat p pb a n d i n gd o m a i n ( t h i a m i np y r o p h o s p h a t eb i n d i n gd o m a i n ) ，ac o n s e r v e d ( d r a gd o m a i n ) a n dac o n s e r v e dh i s t i s s u ee x p r e s s i o np r o f i l ea n a l y s i ss h o w e dt h a t s m d x s i ie x p r e s s i o nw a sw e a k l yd e t e c t e di nr o o t sa n db a r e l yi ns t e m sa n dl e a v e s ，s oi t w a sc o n s i d e r e dt oan o n c o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s i n gg e n e t h ep r o f i l eo fs m d x s i iu n d e r i n d u c t i o no fe l i c i t o r ss h o w e dt h a ts m d x s l lw a sr e g u l a t e di nt h et r a n s c r i p t i o nl e v e la t l e a s t ；i tw a sa ne l i c i t o r s r e s p o n s i v eg e n e ，m e t h y lj a s m o n a t e ( m j ) a n ds i l v e ri o n ( a g + ) b o t hc a ne f f e c t i v e l yu p r e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no fs m d x s i i , b u tm j se f f e c t sw a sb e t t e r t h a na g + i v 3 an e wf u l l l e n g t hc d n a ( 16 5 5 b p le n c o d i n g3 - h y d r o x y 一3 - m e t h y l g l u t a r y l - c o a s y n t h a s e ( d e s i g n a t e da ss m h m g s ) w a ss u c c e s s f u l l yi s o l a t e df r o ms m i l t i o r r h i z ab yr a p i d a m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ( r a c e ) t h ef u l l - l e n g t he d n ac o n t a i n da13 8 3 b po r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) ，e n c o d i n gad e d u c e dp r o t e i no f4 6 0a m i n oa c i dr e s i d u e s a m i n o a c i ds e q u e n c ec o m p a r i s o na n a l y s i ss h o w e dt h a ts m h m g sh a dh i g h s i m i l a r i t yw i t h h m g sf r o mo t h e rr e p o r t e dp l a n t s t i s s u e e x p r e s s i o np r o f i l ea n a l y s i ss h o w e dt h a t s m h m g se x p r e s s i o nw a sd e t e c t e di na l lt e s t e dt i s s u e sb u ta td i f f e r e n tl e v e l sw i t ht h e h i g h e s te x p r e s s i o ni nl e a v e s ，f o l l o w e db yi ns t e m sa n dr o o t s ，s oi tw a sc o n s i d e r e dt ob ea c o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s i n gg e n e t h ep r o f i l eo fs m h m g su n d e ri n d u c t i o no fe l i c i t o r s s h o w e dt h a ts m h m g sw a sr e g u l a t e di nt h e t r a n s c r i p t i o nl e v e l a tl e a s t ；i tw a sa l l e l i c i t o r s - r e s p o n s i v eg e n e ，m e t h y lj a s m o n a t e ( m j ) a n dy e a s te x t r a c t ( y e ) b o t hc a n e f f e c t i v e l yr e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no fs m h m g s i nt h i se x p e r i m e n t ，t h r e eg e n e si n v o l v e di nt h et a n s h i n o n e sb i o s y n t h e s i sw e r ei s o l a t e d f r o ms m i l t i o r r h i z a , w h i c hc a nb ev e r yh e l p f u lf o ri n h a n c i n gt h et a n s h i n o n e s p r o d u c t i o n a n ds m i l t i o r r h i z a sg e n e t i ci m p r o v e m e n t ；t i s s u ee x p r e s s i o np a t t e r na n a l y s e so ft h e s e c l o n e dg e n e sp r o v i d e sp r i m a r ym o l e c u l a re v i d e n c ef o rf u r t h e ru n d e r s t a n d i n go ft h e g e n e t i cb a s i s o ft a n s h i n o n e sc o n t e n t d i v e r s i t yi n d i f f e r e n tp a r t s ；e x p r e s s i o np r o f i l e a n a l y s e st r e a t e dw i t ht h ee l i c i t o r sw e r ec a r r i e do u tt op r o v i d eu s e f u li n f o r m a t i o nt o f u r t h e ru n d e r s t a n di n d u c t i o ne x p r e s s i o na n dm o l e c u l a rr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fg e n e s e n c o d i n gr e l a t e de n z y m e si n v o l v e di nt a n s h i n o n e s b i o s y n t h e s i s k e y w o r d s ：s a l v i am i l t i o r r h i z a , t a n s h i n o n e ，s e c o n d a r ym e t a b o l i t e ，r a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n a e n d s ，1 - d e o x y d - x y l u l o s e5 - p h o s p h a t es y n t h a s ei ，1 - d e o x y d - x y l u l o s e5 - p h o s p h a t e s y n t h a s ei i ，3 - h y d r o x y 一3 - m e t h y l g l u t a r y l c o as y n t h a s e ，e l i c i t o r v 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：班日期：渺彳r - 弓留 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 储摊：强聊签绷甲：沙广夕 卜海师范大学硕 ：学位论文第一章综述 第一章综述 】j i l 刖 舌 中国是一个药用植物资源十分丰富的国家，目前在我国已有统计的药物植物 就达1 1 1 1 8 种( 含1 2 0 8 个种以下单位) ，而对于药物植物的利用自古已有之，在 传统中医学中，植物一直是药物的重要来源之一。随着现代科学的发展，植物作 为药物开发的新来源的地位越加凸显，而且在世界范围内各国科学家对研究和开 发植物药的热情有增无减，这主要是因为药用植物体内形形色色的次生代谢产物 所具有的药用价值和生理活性。在生物体内，利用某些初生代谢产物为“原料”， 在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化学物质，这些特殊的化学物质即为次生 代谢产物( s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ) ，如生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。 它们是植物中一大类并非生长所必需的小分子有机化合物，但是对于植物抵御外 界不利因素和适应复杂的自然环境起着至关重要的作用心1 。植物次生代谢物的应用 历史悠久，各民族传统草药和香料的有效成份大多是植物次生代谢物。至今人们依 赖于从植物中提取的重要的药物就有5 0 多种，全世界依赖于从植物中获取的药物 的人口更是高达7 5 船3 。因此对于人类而言植物次生代谢产物具有十分重大的意义， 因为它具有一定的生理活性及药理作用，如生物碱具有抗炎、抗菌、扩张血管、 强心、平喘、抗癌等作用；黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗艾滋病、抗菌、 抗过敏、抗炎等多种生理活性及药理作用，且无毒副作用，对人类的肿瘤、衰老、 心血管疾病的防治具有较好的效果。随着经济发展，伴随而来的环境污染、对生 态环境的严重破坏以及对资源的掠夺性开发等造成了中草药物种急剧减少甚至消 亡h 3 ，因此如何保护利用开发中草药资源成为了科学家们极为关心的一个话题，各 种替代的生产途径也应运而生，如：提取分离纯化方法的优化、化学模拟合成、 微生物( 细菌和真菌) 发酵、利用植物组织培养和细胞培养生产次生代谢产物等畸1 ， 但是这些方法都存在着各自的缺点，并没有从根本解决药用植物的药源问题。基 因工程技术在近年来获得了长足的发展，基因克隆，载体构建和遗传转化等技术 使得我们可以克服物种间的遗传障碍，定向培养创造出高产的优势药用植物以缓 解药用植物资源的压力。目前我国利用生物技术的手段从根本上提高药用植物次 生代谢产物含量方面的研究尚处于起步阶段 6 1 ，因此开展相关的研究将是非常有 第一章综述j ：海师范人学硕l ：学位论文 意义的。 1 1 丹参的研究概况 1 1 1 丹参的药用价值 丹参又名紫丹参、红根、赤参、活血参等，始载于神农本草经，为唇形科鼠 尾草属植物丹参s a v i am i l t i o r r h i z ab u n g e 的干燥根及根茎。具有祛癖止痛、活血通 经、凉血消痈、清心除烦之功，常用于治疗月经不调，经闭痛经，胸腹刺痛，热痹 疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠，肝脾肿大。心绞痛等7 1 。妇人明理论记载：“四物 汤治妇人病，不问产前产后经水多少，皆可多用，惟一味丹参散，主治与之相同， 盖丹参能破宿血，补新血，安生胎，落死胎，止崩中带下，调经脉，其功大类当归、 地黄、芍药故也。”同华子本草：“养神安志，通利关脉，治冷热劳，骨节疼痛， 四肢不遂，排脓，止痛，生肌，长肉，破宿血，补新生血，安生胎，落死胎，止血 崩，带下，调妇人经脉不匀，血邪心烦，恶疮疥癣，瘿赘肿毒，丹毒，头痛，赤眼， 热温狂闷。”开宝本草：“养血，去心腹痼疾结气，腰脊强，脚痹，除风邪留热。 这些论述充分说明了丹参的主要功能和药用价值。 1 1 2 丹参的生物学特性 丹参为唇形科鼠尾草属植物，多年生直立草本植物，茎叶茂盛，根系发达。高 约3 5 8 0 c m ，密被柔毛，多分枝。根圆柱形，肉质，外面砖红色，内乳白色，长约 5 1 5 c m ，直径4 - - - 1 6 m m ，疏生支根。奇数羽状复叶，叶柄长l 7 5 c m ，小叶3 5 片， 长1 5 8 c m ，宽o 。8 5 c m ，项端小叶较大，小叶卵形或椭圆状卵形，先端渐尖，基 部宽楔形或斜圆形，多缘具圆锯齿，两面被柔毛，下面较密。轮伞花序6 至多花， 组成顶生或腋生总状花序，密被腺毛或长柔毛：苞片披针形，被腺毛；花萼钟状， 长约l 1 3 c m ，先端二唇形，萼筒喉部密被白色柔毛：花冠兰紫色，二唇形，长 2 2 7 c m ，冠筒外伸，上唇约1 2 1 5 c m ，镰刀状，向上竖立，先端微缺，下唇短于 上唇，3 裂，中裂片长宽，侧裂片短，筒内有毛环，能育雄蕊2 个，着生于下唇的 中上部，伸至上唇片，花丝长3 5 4 c m ，药隔长1 7 - 2 0 m m ，上臂约1 4 - - 1 7 m m ，药室 发育，下臂的药室不发育，顶端联合。小坚果黑色，椭圆形。花期5 9 月，花后见 果。果后根系生长旺盛，粗壮，以种子和根断繁殖，后者生长较快【引。 2 ：海师范入学硕1 二学位论文 第一章综述 1 1 3 丹参的主要化学成分 丹参药用成分主要包含两类：一类是脂溶性的二萜类化合物，另一类是水溶性 的多聚酚酸类化合物。脂溶性二萜类化合物，具较强的生物学活性，在丹参中的含 量也较高。2 0 世纪三十年代r 本学者中尾万三1 9 】首次从丹参材料中分离得到了脂溶 性成分中的丹参酮i 、i i 、i i i ( t a s h i n o n ei 、i i 、i i i ) ，紧接着1 9 4 1 年拢浦吉证实 了丹参酮是丹参酮i ia ( t a s h i n o n ei ia ) 和丹参酮i ib ( t a n s h i n o n ei ib ) 的混合物，并 且发现了隐丹参酮的存在【1 0 , 1 1 】。随着色谱方法的发展和应用，在6 0 年代，中国和日 本学者先后从丹参中分离得到异丹参酮i 、异丹参酮i i a 、异隐丹参酮、羟基丹参 酮i i a 、丹参酸甲酯等化合物1 1 2 1 3 1 。1 9 7 0 年，h a y a s h i 等t 1 4 ，1 5 】从丹参中分离得到丹参 新酮( m i l t i r o n e ) ，次年又分离得到了丹参酚。1 9 7 6 年房其年等i l6 】报告从丹参根粉里 新发现一种左旋二氢丹参酮i ( d i h y d r o t a n s h i n o n ei ) 和3 个微量存在的新丹参酮， 即丹参新醌甲( d a n s h e n x i n k u n a ) 、丹参新醌乙( d a n s h e n x i n k u nb ) 和丹参新醌丙 ( d a n s h e n x i n k u nc ) ，并分别测定它们的化学结构。随后次甲丹参酬1 7 j ( m e t h y l e n e t a n s h i n q u i n o n e ) 、次甲丹参醌i ，1 ，2 二氢丹参醌( 1 ，2 - d i h y d r o t a n s h i n q u i n o n e ) i s 】、 菲洛醇( f e r r u g i n 0 1 ) 1 9 】、丹参邻醌( 丹参新酮i ) 1 2 0 、丹参新醌丁【2 l 】、丹参二醇a 、 丹参二醇b 、丹参二醇c 、新丹参酮和3 a 羟基丹参酮i i a 【2 2 】、丹参内酯等化合物也 陆续被发现。到目前为止已经从丹参及其同属植物中分离得到了几十种丹参酮类化 合物。而对水溶性的多聚酚酸类化合物的研究起步较晚，研究表明丹参水溶性成分 主要是丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 等【2 3 2 4 1 。最早发现的丹参素化学名为b 3 ，4 二羟基苯乳酸( p 一3 ，4 - d i h y d r o x y b e n y l l a c t i c a c i d ) ，是各种丹酚酸的基本化学结构。迷迭香酸( r o s m a r i n i ca c i d ) ，由一分子丹参 素与一分子咖啡酸( 丹参素的脱水产物) 缩合而成；丹酚酸a ( s a l v i a n o l i ca c i d a ) 由 一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成；丹酚酸b ( s a l v i a n o l i ca c i db ) 由三分子月| 参 素与一分子咖啡酸缩合而成；丹酚酸c ( s a l v i a n o l i ca c i dc ) 则由二分子丹参素缩合而 成，上述酚酸类成分在受热时均可通过缩合键的裂解得到丹参素和咖啡酸。 1 1 4 丹参酮类物质的药理作用 现代研究表明丹参所含的丹参酮类物质具有多种药理活性，现将其概括如下： ( 1 ) 抗肿瘤作用，丹参酮类物质具有细胞毒性可直接杀伤肿瘤细胞。丹参酮类物质 大多都具有菲醌或萘醌结构，其菲环或萘环结构可与d n a 分子相结合，而呋喃环、 第一章综述上海师范人学硕l ：学位论文 醌类结构可产生自由基引起d n a 损伤，从而抑制肿瘤细胞d n a 的合成。据黄韧敏等汹1 报道，无毒剂量的月_ 参酮类物质可诱导癌细胞的凋亡。而l i a n g 乜剐等体外实验的结果 表明丹参酮类物质可以诱导肿瘤细胞分化成为正常或者接近正常的细胞，而对正常 细胞无杀伤作用。( 2 ) 抗菌消炎作用，房其年等晗7 3 发现隐丹参酮、丹参酮i i b 、丹参 酸甲酯、羟基丹参酮i ia 和二氢丹参酮i 对金黄色葡萄球菌及其耐药菌株有较强抑菌 作用，高玉桂等啪1 研究表明，丹参酮对以金黄色葡萄球菌为主的急性感染具有显著 疗效。( 3 ) 保护心肌的作用，动物实验表明丹参酮类物质能够通过清除氧自由基而 保证心肌的缺血再灌注而达到保护心肌的作用1 。( 4 ) 抗动脉粥样硬化，丹参酮i ia 磺酸钠能阻止巨噬细胞源性生长因子对平滑肌细胞增殖的促进作用，而达到抗动脉 粥样硬化的目的m 1 。( 5 ) 抗心律失常，于海波等通过大鼠的心室肌细胞的研究表明 丹参酮类化合物能显著地阻断内向钙电流，进而引起动作电位时程缩短。通过防止细 胞内，尤其是线粒体内的钙超载，可用于心肌缺血再灌注性损伤和心律失常的防治口1 3 2 o ( 6 ) 其它作用，丹参酮i i a 是一种天然的抗氧化剂，对肝细胞中d n a 由于脂质过氧 化引起的损伤有一定的保护作用 3 3 o 顾克显b 们用精囊和前列腺重量法证明丹参酮有 抗雄性激素的作用，认为丹参酮具有雌激素样活性，治疗座疮疗效快、无明显不良 反应。 1 2 丹参植物组织培养研究 传统的药用植物活性成分的提取方法会消耗大量的野生资源，当采集和消耗量 超过自然资源的再生能力时，必然会导致物种的濒危甚至灭绝，而自然环境的曰益 恶化会在此基础上进一步导致药用植物的资源匮乏。传统的药用植物栽培存在着许 多的不足，如：引种困难，栽培生产周期长、种质退化、病虫害严重等口5 1 ，因此寻 找一条可替代途径非常有必要的。人工组织培养正好可以解决传统栽培所存在的不 足，被认为是替代传统栽培生产目的植物次生代谢途径的理想途径啪3 。目前关于丹 参的植物组织培养研究主要集中在以下几个方面：离体培养植株再生、人工诱导多 倍体、细胞培养和毛状根的离体培养。 1 2 1 丹参的试管苗快速繁殖 丹参的快速繁殖技术是利用基因工程进行遗传改良的基础，同时也是优良品种 的种质保存的基础。王建英等 的研究表明，丹参的叶片，叶柄可以在m s + 6 b a 2 m g l 。的培养基上形成丛生苗，丛生苗切下后接种于1 2 m s 上可生根并发育成完整 4 e 海师范入学硕l ：学位论文 第一章综述 植株，移栽土中能够存活。蔡朝辉等踟对丹参的快繁做了更深入更系统的研究，结 果表明6 b a 诱导出芽的效果很明显，以丹参叶为外植体，接种于附加0 5 1 m g l d 的 m s 培养基上时，产生丛芽的效果最好。在诱导丛生芽的培养基上，n a a 诱导愈伤组 织的作用尤为明显。在1 2 m s 培养基上添i j i ：i i b a0 2m g l 以可提高生根率。赵洁等啪3 进一步探讨了在附加0 5 1 m g l 1 的6 b a 的m s 的培养基上光质和温度对芽诱导频率的 影响，结果表明绿光诱导芽频率最高，其次为白光、黄光、黑暗、蓝光，红光诱导 芽频率最低。温度为3 0 0 c 时，芽的诱导频率最高。 1 2 2 人工诱导丹参多倍体的形成 在染色体