（遗传学专业论文）hdac6与血管内皮细胞迁移的关系.pdf

摘要 摘要 细胞迁移在人体的正常生理活动和疾病发生中普遍存在，如胚胎发生、损伤 修复、免疫应答、癌转移等过程中均涉及到细胞迁移。研究者发现，组蛋白去乙 酰化酶h d a c 6 在细胞迁移中发挥着重要的作用，目前临床上已有一些h d a c 6 的抑 制剂在肿瘤治疗中得到了应用。本文中选用血管内皮细胞为材料，研究h d a c 6 在血管内皮细胞迁移中的作用，并就其中的分子机制进行初步的探讨。由于血管 性疾病是严重危害人类健康的一个全身性疾病，血管内皮细胞迁移与血管的正常 生理功能及病变有着密切的关系，明确其分子机制对于提高血管性疾病的防治水 平具有重要的意义。此外，肿瘤的发生伴随着血管的生成为其提供营养物质，研 究血管内皮细胞迁移对于肿瘤治疗也有着重要的意义。 本文中我们发现，h d a c 6 依赖其去乙酰化酶的活性促进血管内皮细胞的迁 移，而用i - i d a c 6 抑制剂抑制其酶活性或用s i r n a 下调h d a c 6 表达水平时，血管内 皮细胞的迁移减缓；但是s i r n a 下调内源h d a c 6 表达水平后，外源表达的h d a c 6 能恢复血管内皮细胞的迁移能力。这些证据充分显示了h d a c 6 在血管内皮细胞的 迁移中起着关键的作用。 细胞极化和黏附在细胞迁移中至关重要，本文发现h d a c 6 通过调节血管内皮 细胞的极化和黏附影响其迁移能力。进一步的实验发现h d a c 6 可能是通过与e b l 相互作用来调节细胞迁移的。e b l 可能作为h d a c 6 信号通路的下游分子，在介导 微管捕获中发挥功能。此外，我们还发现h d a c 6 影响血管的生成，这为以h d a c 6 作为靶点治疗血管性疾病和肿瘤提供了理论基础。 关键词：血管内皮细胞；细胞迁移；组蛋白去乙酰化酶6 ( h d a c 6 ) ；细胞极化； 细胞黏附 a b s t r a c t a b s t r a c t c e l lm i g r a t i o ni sac o m m o np r o c e s si nt h ed e v e l o p m e n ta n dm a i n t e n a n c eo f m u l t i c e l l u l a ro r g a n i s m sa n dd i s e a s eo c c u r r e n c e e m b r y o n i cm o r p h o g e n e s i s ，w o u n d h e a l i n g ，i m m u n er e s p o n s e s ，a n dt u m o ri n v a s i o na l lr e q u i r et h eo r c h e s t r a t e dm o v e m e n t o fc e l l si nap a r t i c u l a rd i r e c t i o nt oas p e c i f i cl o c a t i o n i ti sr e p o r t e dt h a th i s t o n e d e a c e t y l a s e6 ，w h i c hi sa b b r e v i a t e da sh d a c 6 ，i si n v o l v e di nc e l lm i g r a t i o n i nt h i s s t u d y , w ef o c u so nv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s ，w h i c hp l a yi m p o r t a n tr o l e s i n p h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a lp r o c e s s e so ft h ev a s c u l a rs y s t e m a nu n d e r s t a n d i n go f t h em e c h a n i s mb yw h i c hc e l l s m i g r a t em a yl e a dt ot h ed e v e l o p m e n to fn o v e l t h e r a p e u t i cs t r a t e g i e sf o rt h ec o n t r o lo fv a s c u l a rd i s e a s e s m o r e o v e r , t h em i g r a t i o no f v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l si s e x p e c t e dt ob e c o m ea ni m p o r t a n tt a r g e tf o ri m p r o v i n g c a n c e rt r e a t m e n t ，b e c a u s ei tp l a y sk e yr o l e si nt u m o rg r o w t h ，i n v a s i o na n dm e t a s t a s i s i nt h i ss t u d y , w ef i n dt h a tv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l lm i g r a t i o ni sr e g u l a t e db y h d a c 6 ，i nad e a c e t y l a s ea c t i v i t y - d e p e n d e n tm a n n e r t h em i g r a t i o na b i l i t yo f v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l si ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e db yi n h i b i t i o no fh d a c 6a c t i v i t y w i t hs p e c i f i ci n h i b i t o r so rk n o c k d o w no fh d a c 6e x p r e s s i o nw i t hs i r n a s f u r t h e r s t u d y s h o w st h a t o v e r e x p r e s s i o n o fh d a c 6c a nr e s t o r et h e m i g r a t i o n o f s i r n a - t r a n s f e c t e dc e l l s t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a th d a c 6p l a y sak e yr o l ei nt h e m i g r a t i o no fv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s c e l lp o l a r i z a t i o ni sc r i t i c a lf o rt h em i g r a t i o no fc e l l s w ef i n di nt h i ss t u d yt h a t h d a c 6e n h a n c e sv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l lm i g r a t i o nb yp r o m o t i n gc e l lp o l a r i z a t i o n a n da d h e s i o nt u r n o v e r w eh a v ea l s oi n v e s t i g a t e dt h em e c h a n i s mo fh o wh d a c 6 e x e r t si t se f f e c to nc e l lm i g r a t i o n o u rd a t as h o wt h a th d a c 6c o u l di n t e r a c tw i t h e b1v i ai t ss e c o n dh d a cd o m a i n , s u g g e s t i n gt h a te b1m a ya c t sd o w n s t r e a mo f h d a c 6 ，a n dt r i g g e rt h e s e a r c ha n dc a p t u r e m e c h a n i s m s o u rs t u d ya l s or e v e a l st h a t h d a c 6i sc r i t i c a lf o rb l o o dt u b ef o r m a t i o n t a k e nt o g e t h e r , o u rr e s u l t ss u p p o r tt h e n o t i o nt h a th d a c 6 - t a r g e t e dd r u g sm i g h tb eu s e f u lf o rt h et r e a t m e n to fv a s c u l a r d i s e a s e sa n dc a n c e l m e t a s t a s i s k e yw o r d s ：v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l ；c e l lm i g r a t i o n ；h i s t o n ed e a c e t y l a s e6 ( h d a c 6 ) ； c e l lp o l a r i z a t i o n ；c e l la d h e s i o n i i 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：竭咖闵队 砷年f 月泓日 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：两墩准 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 一一_ - o - - - - 1 年s 月呻日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年 月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： r 忡一； l 内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) ；秘密1 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) ! 机密- k 2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年) 第一章引言 第一章引言 第一节h d a c s 家族以及h d a c 6 概述 1 1 1 组蛋白乙酰化去乙酰化与基因表达调控 组蛋白是真核生物染色体的重要构成成分。真核生物染色质的基本结构单元 是核小体，它是由d n a 和组蛋白以特殊的方式相连而组成的，4 种组蛋白h 2 a 、 h 2 b 、h 3 和h 4 ，形成一个组蛋白八聚体( 每一种组蛋白各二个分子) ，约2 0 0b p 的d n a 分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体【l 】。 核心组蛋白的n 端尾部通过各种修饰活跃地与d n a 及其他蛋白质互发生作 用，在调节核小体以及染色质结构中发挥作用，从而调节基因的转录【2 】。组蛋白 可有多种修饰方式：甲基化、乙酰化【3 】、泛素化、磷酸化等。其中在组蛋白的修 饰中，研究最多的是乙酰化。研究发现染色体组蛋白的乙酰化修饰与活跃的基因 表达密切相关，而相应基因调节区的乙酰化程度不足通常引起基因沉默。组蛋白 乙酰化去乙酰化修饰是基因转录调控的关键机制之一，而这种修饰作用分别由 组蛋白乙酰转移酶( h a t s ) 和组蛋白去乙酰化酶( h d a c s ) 调控，组蛋白乙酰化状态 取决于组蛋白乙酰基转移酶( h a t s ) 与组蛋白去乙酰化酶( h d a c s ) 之间的活性竞 争，所以h a t h d a c 间接调节基因的转录和沉寂。h a t h d a c 平衡的紊乱会使 基因表达失控，从而导致肿瘤的发生【4 1 。 组蛋白可与d n a 分子紧密结合，使染色质呈致密卷结构。核心组蛋白n 端尾 部区域的赖氨酸残基可进行可逆的乙酰化修饰，研究发现乙酰化修饰大多在组蛋 白h 3 赖氨酸的9 、1 4 、1 8 、2 3 和h 4 赖氨酸5 、8 、1 2 、1 6 等位点。组蛋白乙酰化中 和了其氨基端赖氨酸残基的正电荷，削弱组蛋白与d n a 的接触；组蛋白乙酰化 也可能作为一种信号，改变相邻核小体上组蛋白与组蛋白间的作用，以及组蛋白 和转录因子间的作用这其中任何一种改变均可能影响核小体的结构，产生一个 更加开放的染色质环境，有利于转录因子的结合，从而促进转录【5 】。组蛋白去乙 酰化酶则移去组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基，恢复组蛋白的正电性，带正电荷的 赖氨酸残基与d n a 分子的电性相反，增加了d n a 与组蛋白之间的吸引力，使启 动子不易接近转录调控元件，从而抑制转录1 6 】。 1 1 2h d a c s 家族 第一章引言 组蛋白去乙酰化酶h d a c s ( h i s t o n ed e a c e t y l a s e s ) 是一类锌指依赖的水解酶， 在调节染色质的重构和基因表达方面起着重要的作用 7 1 。 组蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表达过程中重要的调控方式，而负责组蛋 白乙酰化和去乙酰化的是一对功能相互拮抗的蛋白酶h a t 和h d a c ( 图1 1 ) 。 h a t 激活基因转录，而h d a c 的功能相反，为抑制基因的转录，其功能异常被证 实与肿瘤的发生和发展及缺氧状态下的血管增生有直接关系。一般来说，增加组 蛋白乙酰化水平会使染色质浓缩从而抑制基因转录。 寂妒 o 牲队c r 妒 h 、j ：i 也、儿渊。i h 、3 1 比赢。 r r k - v e r s i b kd 屯a c c t y l a t i o na fl y s i n e 托! | j 住 图1 1 赖氨酸残基的可逆去乙酰化旧 目前在人类中现在已发现了1 8 个h d a c s 不同成员 8 】。根据酵母中组蛋白去 乙酰化酶的同源性，将人类中发现的这1 8 个成员分为4 类( 图1 2 ) 。c l a s si 有 4 个不同的成员，分别为h d a c l 、h d a c 2 、h d a c 3 和h d a c 8 。c l a s si i 包括6 个成员，这6 个成员又分为2 个亚类，其中h d a c 4 、h d a c 5 、h d a c 7 和h d a c 9 属于c l a s s i i a ，h d a c 6 和h d a c l 0 属于c l a s s i i b 。h d a c l l 被归为c l a s s i v 。 与h d a c s 家族的c l a s si 、c l a s si i 以及c l a s s i v 不同的是，c l a s s l i i ，又名s i r t u i n s ， 是一类n a d + 依赖的去乙酰化酶，而c l a s si 、c l a s si i 以及c l a s s i v 都属于锌指依 赖的去乙酰化酶。至今为止已在人类中发现了7 种n a d + 依赖的h d a c s ，分别 为s i r t l 7 ，它们都与酵母的s i r t 2 同源【9 】。 t i nd 翻莲茁b t k m o f h d c = i nn u a m m l c b 脚嗣k 岫l a e a t i _ i f u n e t i 期 勘p 如弦耐a t11 4 1 队c ! n 啦h 西h 巾q 秘雠m $ i a 3 n a r d ( a u c 嘛崩嘲如鼙鼍l 耐如越蝴妇蛔l t u ) l 2嘛刊协莨阱蝴呶 搬m c ， 粕r a c k x a 事帆话p 哪。m $ 1 d g l 0 , k n c i m $ 细拳d 谴辨棘崩i 腑k 重j 哇挪d i h r 嘲 懈i y ；n h 喇w 嘲睫嘲一。惜kn ( ：o r - - k h i - o 唧l 钟“h 怕p 孽瞻钟”婶l 霸 q 雕聃 h d c ln u 曲曩 a - 踟胁 c n 岫a 峨h 蝌硝脚啪s i ，嘲喇舷最刊糖静嘲瞄蛳蛔“嘲 嗍h 啉 i 岫骘由喀呻叩坤绷，摹n d ( 豫p 瑚删n 啦l m 。 q 印l b 霸 瑚a c 7h 城臻m c y | 啤n a 蕾m h d c h 毗；c 峨n l d 睡m 哺跚嘲瞄i 畦精 c 柙q 儿髓i a - m i 鞠m o c 拍叩l 嘲弧南u i i t 幽- 帅t 嘲 h d c 1 0n 墉，d 嚣纛0 c h i 啪瑚嚏d 尊m d i d c 脚蛔l c h l rt - m a c i ln w 舨 q q 萌聃 矿矗婶_ 岫ta 嘶i1 1 1 s t 盯i 7 图1 2 人类中发现的h d a c s 分类图 1 o 】 2 第一章引言 1 1 3h d a c 抑制剂 研究者发现，h d a c s 与肿瘤抑制基因的沉默有关，并且能促进恶性细胞的 转化】。这些年来，已研制出了一系列的h d a c 抑制剂，h d a c s 活性异常被证 实与多种癌症发生相关，这促使了h d a c 抑制剂作为抗肿瘤药物的研究【4 】。 h d a c 抑制剂具有抑制体外培养的肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞分化 及促进细胞凋亡的作用。这些抑制剂还能够在非毒性剂量下，以选择性的方式抑 制动物模型中的肿瘤细胞增殖。 目前已有多种h d a c 抑制剂被开发出来，并在临床上得到了应用【l2 1 。h d a c 抑制剂按结构可分为四类：短链和芳香族脂肪酸，如丁酸钠和苯基丁酸钠及混 杂化合物，如d e p u d e c i n ；氧肟酸类，如曲古抑菌素( t s a ) 、s a h a ( s u b e r o y l a n i l i d e h y d r o x a m i ca c i d ) 等；环形四肽类，如t r a p o x i na 、f r 9 0 1 2 2 8 和a p i c i d i n 等； 苯酸胺类。其中丁酸钠及其异构体已进入实体瘤一期临床应用，但由于用药量过 大及对其它酶系统的影响等不良反应，应用受到一定限制。另一种f r 9 0 1 2 2 8 也 已开始临床前和早期临床试验。这两种药物的临床应用标志着h d a c 抑制剂在 肿瘤治疗中已经进入实际应用阶段。近来氧肟酸类h d a c 抑制剂的研究倍受瞩 目，这一类h d a c 抑制剂被证明可在小剂量、低浓度情况下导致肿瘤分化、并 选择性地抑制肿瘤生长而对正常细胞无毒副作用，更适用于临床，它主要包括 s b h a 、s a h a 、c b h a 和p r o x a m i d e 等。 对于h d a c 6 来说，因其具有两个催化结构域，导致h d a c s 家族的一般抑 制剂丁酸钠对其不起作用。t s a 是h d a c s 家族的广域性抑制剂，而t u b a c i n 是 h d a c 6 的特异性抑制剂。t s a 和t u b a c i n 都是z n 2 + 螯合剂，能够与h d a c 6 的 第二个催化结构域的锌指基序结合，阻遏h d a c 6 与其底物或其他蛋白分子( 如 p p l 、h s p 9 0 、d i a 、d y n e i n 或t u b u l i n ) 结合而发挥作用【”】。 h d a c 抑制剂已有一部分进入到临床阶段( 图1 3 ) 。各种h d a c 抑制剂的 作用靶点见图1 4 。 塑璺竺! 堂竺壁堕! ! 堕塑巴鲤垫鲢! 垒墨堕磐兰 g 唧c b 啊p 删e 矗0 喇崎舶n 咖吐玎纠h 瞳it 啦l h 国e i ip l - h i - _ 图1 3 已进入临床的i - ) a c 抑制剂【1 4 】 3 第一章引言 m = 望 e c 4 - j o u z 弓 曼 d e 0 m 卜 n i 们 = l a r d l ik 盟l 妇：a 霜如 h d a c ln u a e u s 卜l d a c 2n u d e u s h d a c 3n u d e u s h d a c 8 o a s s 勰l h d a c 4 h d a c s h d a e 7 h d a c 9 a 童髓j 【l h t u b a c i nlh d a c 葛 h d a c l o a a $ 摹琏 h d a c l l 弱曩曩囊薹瑟 联一5 2 7l s i r t l s l r 唆 s i r t 3 s l 吨4 s i r t 5 s i r t 6 s t r t 7 釉u a e u s n u d e u s c y 白d p l a s m n u d e u s c y t o p l a s m n u d e u s c y t o p l a s m n u c t e u s c y t o p l a s m m o s t l yc y t o p l a s m m o s u yc y t o p l a s m n u d e u s c y t o p l a s m n “c l e u s c y t o p l a s m n u c l e u s ，mt t o c h o n d r l a m i t o c h o n c l r i a m i t o c h o n d r i a n u c t e u s n u d e u s s 妇囊c 倒i a 魍蜘嘲篆 a n d r o g e nr e c e p t o r p 5 3 m y o d e 2 f - 1 s h p $ t a t 3 g t u c o c o r t i c o i dr e c e p t o r b c 卜6 y y l s t a r 3 r e l a y y - l ( 麓7 再j s h p s r 油 乞3 g a _ r 一l g c m a h p * l s m a d 7 g c m i l h p - 1 p i a g l p l a 9 2 = - t u b u l i n h s p g o s h p s m a d 7 p 5 3 f o x o n f - 筐b p 6 c i a h i s t o n em a - t u b u h n a c e t y i - c o as y n t h e r a s e s g t u t a r n a t ed e h y d r o g e n a s e d n ap o l y m e r a s eb r n ap o l y m e r a s el 图1 4h d a c 抑制剂作用示意图【1 5 】 h d a c 抑制剂诱导的生物学效应主要表现为抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、 阻滞细胞周期、促进细胞分化以及抑制血管生成。几乎所有的h d a c 抑制剂均 可以诱导c d k 抑制剂p 2 1 w ”1 的表达，抑制周期素与c d k 的活性。但是不同h d a c 抑制剂作用于不同肿瘤细胞引发前述效应机制并不完全相同。迄今为止，对 h d a c 抑制剂抗肿瘤作用机制研究得并不十分清楚。h d a c 抑制剂虽能引起组 4 m。mxu：u嗄uon一碧 一。一o厶mmz一价卜z价 第一章引言 蛋白高度乙酰化，活化一些基因的表达，但是这些所活化的基因在整个被激活转 录的基因中所占比例不足2 。此外也有研究表明，由h d a c 抑制剂诱导的高度 乙酰化组蛋白与h d a c 抑制剂引起的细胞生长抑制之间并没有相关性。而进一 步研究发现，细胞内许多非组蛋白能够在h a t 的作用下发生乙酰化修饰，而在 h d a c 抑制剂作用下这些蛋白质也能够发生乙酰化。提示非组蛋白分子的乙酰化 可能在h d a c 抑制剂的抗瘤机制中起着更为重要的作用。已被证实能够在h a t 或h d a c 抑制剂作用下发生乙酰化修饰的蛋白包括p 5 3 、p 7 3 、g a t a 1 、e 2 f 1 、 c j u n 、r b 、热休克蛋i 刍( h s p ) 9 0 、h s p 7 0 、c s r c 、雄激素受体等。乙酰化修饰 对这些蛋白分子功能及稳定性的影响正成为研究热点。 h d a c 抑制剂的作用机制h s p 9 0 是目前发现的能够在h d a c 抑制剂作用下 发生乙酰化修饰的具有重要功能的蛋白。作为细胞中最重要的分子伴侣蛋白， h s p 9 0 参与细胞中一些重要蛋白分子构象的稳定和激酶活性的调节。目前已有近 百种蛋白分子被确认为h s p 9 0 的底物蛋白，包括突变型p 5 3 、b c r - a b l 、e r b b 2 、 r a f - 1 、a k t 及核内受体等，由于这些底物蛋白涉及肿瘤细胞增殖及抗凋亡特性的 调节，阻断h s p 9 0 的分子伴侣功能，可以有效介导底物蛋白经泛素蛋白酶体通 路降解，从而发挥抗肿瘤功效，因而h s p 9 0 已经成为目前抗肿瘤靶向治疗的重 要靶点n 6 1 。 新近的研究发现，h d a c 6 是h s p 9 0 的去乙酰化酶，h d a c 抑制剂诱导的 h s p 9 0 乙酰化正是通过抑制h d a c 6 的活性而实现的。h d a c 6 属于h d a c i i b 类 去乙酰化酶，其主要分布在细胞质中，它不仅仅能够使h s p 9 0 发生去乙酰化， 还能够使伽微管蛋白发生去乙酰化。已知微管蛋白参与细胞中的多种生命活动， 在细胞的分裂和增殖中起十分重要的作用。研究证实当微管蛋白的乙酰化增加 时，其稳定性也随之增加，且微管蛋白与细胞中的多种重要蛋白如h s p 9 0 、 h s p 7 0 、h s p 4 0 、s t a t h m i n 、h o p 、b a g 2 等结合。微管蛋白乙酰化修饰后对其结 合蛋白及其生物学功能是否会产生影响尚待进一步的实验探讨。 h d a c 抑制剂发挥作用的其他可能机制还包括，h d a c 抑制剂可以阻断与 细胞增殖相关的m a p k 信号转导通路，同时使细胞发生g o g l 期或g 2 一m 期阻滞。 h d a c 抑制剂能够同时激活死亡受体和线粒体激活的细胞凋亡信号通路。此外， n a k a m u r a 等【1 7 】研究表明，h d a c 抑制剂能够抑制端粒酶基因的表达，表明h d a c 抑制剂还能够通过干预细胞的衰老程序而发挥其抗增殖作用。 1 1 4 h d a c 6 简介 1 1 4 1 h d a c 6 的分子结构 h d a c 6 基因定位于x 染色体p 1 1 2 2 2 3 区带【1 8 】，约2 1 9 2 3 b p ，由2 8 个排列 5 第一章引占 在从4 1 b p 到6 7 7 b p 的外妊子编码，5 一端开放读码框显露出t a t a 和c c a a t 盒( 缺 乏) 的启动子，这个肩动子含有l k b 长c p g 岛。从蛋白质结构来讲，h d a c 6 独特 的拥有两个催化区域( 图15 ) ：一个起始于第2 1 5 位氩摹酸，另个起始于第 6 1 0 位，两个催化区高度同源而且均含有一个j 泛素结合的锌指结构区。c 一末端 的锌指结构区既能与聚泛素化的错误折叠蛋白结合，又能与肌动蛋白结合。在c 端第一催化区域一h 6 1 l a ( 第一催化区域是指h 2 1 6 a ) 与羧基末端泛素结合区域之 州有一个十四肽的丝氨酸谷氨酸重复序列，该结构是一个细胞质滞留信号，使 h d a c 6 稳定锚定在细胞质中。体外去己酰基活性位点土要位于c 端第二催化区 域即h 6 l l a 。 h d a c 6 n e s s e l 4 _ 臣二) 匿二 _ _ _ 卜! d d ld d 2 z n f u b p c a t a l y b ca d i v l w 图1 5h d a c 6 结构域示意图【嗍 u b i q u r i n b i n d i n g h d a c 6 是h d a c s 家族中晶独特的一个成员。h d a c 6 独一无的拥有2 个催 化结构域，这极大地引起了生物进化研究者的兴趣。人们将两个催化结构域分别 突变试图找出到底哪个催化结构域对酶活性至关重要。g r o z m g e r 等口”实验发现 这两个催化结构域均拥有独立的酶活性。但有趣的是：z h a n g 等 2 q 实验却发现 h d a c 6 的酶活性依赖于两个h d a c 结构域的完整性，z o u 等口4 却认为只有第二个 h d a c 结构域具有酶活性。 1 1 4 2h d a c 6 的细胞内亚定位 体内h d a c 6 主要分布在细胞胞浆脚1 、核周区域和细胞的生长前沿区，在心、 肝、肾、胰等脏器中高表达】。 除了h d a c 6 的酶活性，搞清楚它的细胞内亚定位对于理解h d a c 6 的功能 同样重要。早期研究者发现，在老鼠体内h d a c 6 几乎全定位在细胞质中只有当 细胞处于特殊的环境下时，h d a c 6 也会进入到细胞核内。如图1 5 所示：h d a c 6 的n 端具有一个n e s 序列，它是一个核输出信号，能够指导合成的h d a c 6 运 输到细胞质中。h d a c 6 的c 端还存在s e l 4 基序，确保运输到细胞质中的h d a c 6 滞留并稳定于细胞质中。n e s 和s e l 4 这两个基序，就像双保险一样，把h d a c 6 6 第一章引言 牢牢的锚定在细胞质中，这似乎也暗示着在进化过程中有一种选择压力迫使 h d a c 6 被排到细胞质中。 1 1 5h d a c 6 的生物学功能 1 、h d a c 6 与细胞形态、黏附以及迁移 在细胞内，h d a c 6 位于细胞的动态性高的部位，如极化的细胞的突起部位， 包括领导区和腹足。h d a c 6 参与微丝依赖的膜皱运动，正是这些膜皱运动使微 丝和一些蛋白分子得以循环利用。h d a c 6 同时还能调节微管蛋白的乙酰化水平， 增加微管的动态性，而微管是细胞形态的支撑者，且细胞极性的建立和维持也需 要微管的参与。另外，黏附位点的周转也离不开微管的动态性变化【2 5 1 。 2 、h d a c 6 与肿瘤转移 h d a c 6 的活性与细胞的恶性转化有关。h d a c 6 调节h s p 9 0 的去乙酰化， h s p 9 0 的去乙酰化后导致乳腺癌转移抑制子b r m s l 不再稳定，b r m s l 的失活 降低转移抑制子的活性，从而影响癌的恶性转移【2 6 】。另外，h d a c 6 还能与h d a c 4 和h d a c 8 一起调节转化生长因子( t g f p 1 ) 介导的平滑肌0 【肌动蛋白的表达。 平滑肌a 肌动蛋白与肿瘤细胞的形态维持，组织修复以及癌发生密切相判2 5 1 。 3 、h d a c 6 与病毒入侵 许多病毒的入侵，需要乙酰化的皮质微管蛋白的帮助。病毒颗粒进入细胞， 首先得与膜上受体结合，质膜融合，然后病毒颗粒被内吞到细胞内。h d a c 6 通 过影响皮质微管的乙酰化水平，抵抗病毒的入侵【2 。7 1 。 4 、h d a c 6 与免疫应答 h d a c 6 使微管蛋白去乙酰化，从而调节免疫突触的形成以及相邻细胞间的 信号传递。免疫反应时，h d a c 6 转移并聚集在t 细胞和抗原呈递细胞( a p c 细 胞) 的接触部位，通过调节微管蛋白的乙酰化水平影响免疫应答过程。 5 、h d a c 6 与胞内错误折叠大分子的降解 h d a c 6 的c 端z n f u b p 结构域能够结合泛素单体和泛素多聚链，介导细 胞内一些蛋白的降解 2 8 1 。细胞内一些损伤的蛋白以及错误折叠的蛋白，在h d a c 6 的介导下形成大的聚集体，这些大的聚集体最后被运输到溶酶体中被降解( 图 1 6 ) 。 7 可 。蛔鲋。拶 铡a g g r e s o m e s 图l6 h d a c 6 介导的蛋白聚集体的降解i 1 1 6 与h d a c 6 相互作用的蛋白 h d a c 61 要定位于胞浆t i ，在细胞内h d a c 6 的底物主要是d 一微管蛋白、 h s p 9 0 和皮质肌动蛋白。但是存体外，h d a c 6 还具有去乙酰化组蛋白的能力。 此外h d a c 6 还可以与衅其他蛋白形成复合物来行使功能，如与v c p 结合介 导蛋n 的降解，与m d i a 2 结合动态调节微丝的变化，与动村蛋白复合物p l s 0 9 l u e d 的结合介导细胞内物质的运输，与蛋自磷酸酶p p i 的催化可 _ 基结合等( 图l7 ) 。 嘲17h d a c 6 的底物、相瓦作用的蛋白以及相关的乍物学功能【州 第一章引言 第二节细胞迁移 1 2 1 细胞迁移的重要性及普遍性 细胞迁移普遍存在于生物界中，是一种从简单的单细胞生物到复杂的哺乳动 物中都普遍存在的活动。在生命起源的过程中，细胞运动、细胞迁移至关重要。 早期的细胞通过细胞的变形和伪足实现趋近食物和远离伤害。在高等动物的生命 活动中，细胞迁移与胚胎发育、伤口愈合、免疫应答、组织发育等活动都密切相 关【3 0 ，3 h 。此外，人类许多重大疾病，如肿瘤发生与转移等，也与细胞迁移密切 相关 3 2 - 3 4 。无论是原生动物还是高等哺乳动物细胞，在检测到合适的刺激信号时 ( 如阿米巴细胞检测到食物信号) ，会伸出一种扁平的薄层外膜系统即片状伪足， 通过其领导区前沿的不断伸展和基部的收缩，以及细胞与支撑物之间的黏附、解 黏附的动态循环，朝向刺激源运动【3 5 】。 很多情况下，细胞迁移运动并不是随机和无目的的，而是受到趋化因子的触 发和诱导【3 6 1 ，在趋化因子出现后，它通过与细胞表面受体的相互作用，诱导出 各种细胞内的应答【3 7 1 ，如细胞极化产生、骨架重排、小泡运输加快等，这些应 答反应最终协助细胞完成迁移运动。细胞的迁移运动方式由其自身状态和微环境 共同决定。体外培养的细胞处于不同的基质环境时，会选择不同的迁移运动方式。 在二维培养基质上细胞的迁移方式主要分为个体迁移和群体迁移。而在三维培养 基质上的细胞，其迁移方式主要分为间充质迁移和阿米巴迁移【3 8 1 。 与细胞迁移有关的生理过程 细胞迁移是多种生理过程的前提，例如创伤恢复，神经嵴细胞的移行， 急性炎症中白细胞的渗出还有癌细胞的转移。 l 、胚胎发生：高等动植物成体的结构非常复杂，但都是来自于一个受 精卵。受精卵不断分裂，分裂出的细胞会移动，还会通过基因的开启或关 闭进入分化途径，形成特异的细胞，执行其被指定的功能【3 9 1 。 2 、损伤修复：损伤会对机体造成身体部分细胞和组织的丧失，机体需 要对损伤进行修复。修复有两种不同的形式，再生和纤维性修复。这两个 过程都涉及细胞迁移【4 0 1 。例如上皮组织中的一种一一鳞状上皮如果出现缺 损，其边缘和底部的细胞就会分裂增生，并向缺损中心迁移。虽然很多种 类的细胞都具有分裂再生的能力，如上皮细胞，但是它们最终能否成功修 复受损组织却要依赖于细胞外基质。例如细胞外基质的一种成分一一透明 质酸，存在于迁移细胞的周围，它能够抑制细胞间的粘附，促进细胞迁移。 3 、免疫反应：炎症反应最重要的功能是将白细胞送到炎症灶，所以白 细胞的渗出是炎症反应最重要的特征【4 。白细胞离开血管的中心部，边集 9 第一章引言 于血管壁，不断滚动直至最后在胞膜表面选择素的作用下与内皮细胞黏附。 然后白细胞会在内皮细胞连接处伸出伪足，以阿米巴运动的方式穿过间隙 到达炎症灶，需时2 到1 2 分钟。游出的白细胞然后会在炎症灶附近搜索细 菌产物，补体成分，细胞因子和白三烯。这些物质能吸引甚至激活白细胞， 将白细胞带到炎症部位并发挥其吞噬，免疫和组织损伤作用。 4 、神经系统的形成：高度极性的神经细胞在定向迁移过程中，需要一 种长距离的细胞内信号传递过程，协调神经细胞的不同部位对外界导向信 号的反应。目前已知多种发育性神经系统疾病是由于神经细胞迁移紊乱造 成的，患者常表现出智障、癫痫等症状。因此，对神经细胞迁移导向基本 机制的研究将有利于人们对这类发育性神经系统疾病的认识和防治【4 2 1 。 5 、癌症转移：肿瘤转移是恶性肿瘤生物学特征之一，也是临床治疗的 难题，其中细胞迁移是肿瘤浸润和转移的必备条件【4 3 1 。目前，对于调节细 胞迁移和侵袭的相关机制仍知之甚少。恶性肿瘤细胞从原发部位经淋巴、 血液、体腔等途径播散到其他部位的过程为肿瘤的迁移，这是其区别于正 常细胞的生物学特征之一。肿瘤的迁移是其危及宿主生命及影响治疗效果 的主要原因。恶性肿瘤细胞之所以能够迁移，是因为它与正常细胞具有诸 多方面的不同，如：生长调控机制的丧失、质膜流动性改变、细胞运动能 力的改变、细胞异型性增加、粘附性改变、细胞极性改变等等【4 训。 细胞迁移是目前细胞生物学研究的一个主要方向，科学家们试图通过对细胞 迁移的研究，在阻止癌症转移、植皮等医学应用方面取得更大成果。也因为细胞 迁移独有的运动特性，成为当今生物学热门研究方向。 1 。2 2 细胞迁移的过程 细胞迁移指的是细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而 产生的移动。过程中细胞不断重复着向前方伸出突足，然后牵拉胞体的循环过程。 细胞骨架和其结合蛋白是这一过程的物质基础，另外还有多种物质对之进行精密 调节。细胞迁移是一个主动耗能的过程，它需要细胞骨架的参与。细胞骨架，尤 其是肌动蛋白组成的微丝骨架，在细胞运动过程中扮演了非常重要的角色m j 。 若以移动方式与型态来比较，细胞迁移是通过胞体形变进行的定向移动，这 有别于其他；如细胞靠鞭毛与纤毛的运动、或是细胞随血流而发生的位置变化， 而且就移动速度来看，相比起后两者，细胞迁移要慢得多。但此细胞迁移“步缓 力微”的运动特性，却是细胞觅食、损伤的痊愈、胚胎发生、免疫、感染和癌症 转移等等生理现象所涉及到的【铂】。 细胞迁移运动过程主要包含以下四个循环步裂47 】( 图1 8 所示) ：细胞极化， 1 0 第一章引言 形成前部与后部之分；在细胞迁移的前导端，局部细胞膜出现前伸而形成伪足 突起结构；细胞前导端与细胞外基质产生新的黏跗，尾端脱黏附及回缩；细 胞骨架收缩，引起细胞位置的整体易位1 3 5 。以上步骤循环进行，细胞将一步步 向目的地前行。细胞黏附、迁移和极化的保持等过程都依赖于整合素的靶向作用 及其所包含黏附位点的重组动力，也即在细胞日口端的胞吐作用能够为细胞提供新 的黏附受体柬辅助细胞迁移，同时这些运动的受体在细胞的尾部通过胞吞内化， 故由此形成以胞吞和胞吐为调节方式的整合素循环m 删】。 1 】p o l t i o no f t h ec e i l 鼍壅塞”里霉苎竺血芒当t ! = a d j u s t t h r e s h o l d ，调整t h r e s h o l d 让细胞变色后点“a p p l y 9 99 接着 p r o c e s s b i n a r y 一 w a t e r s h e d ，最后a n a l y z e 一 m e a s u r e 便得到了一个反应细胞数 目的数值。最后定义过表达h d a c 6 的那组迁移率为1 0 0 ，过表达p e g f p n l 和p e g f p n l h d a c 6 m u t 的除以p e g f p n l h d a c 6 便分别是它们的迁移率。结 果见图3 2 所示。 图3 2h d a c 6 过量表达时血管内皮细胞迁移结果的统计分析，共统计了4 组平行的图。 定义h d a c 6 的那组迁移率为1 0 0 3 1 2h d a c 6 的表达下调抑制血管内皮细胞的迁移 接着我们想看一下内源的h d a c 6 是否也在血管内皮细胞迁移中起作用。这 里我们用s i r n a 下调h u v e c 细胞内的h d a c 6 蛋白。其中s i h d a c 6 # 1 是h d a c 6 基因编码区的s i r n a ，s i h d a c 6 # 2 是h d a c 6 基因非编码区的s i r n a 。划痕实 验前先s i r n a 处理细胞4 8 小时，实验结果如图3 3 所示，对照组s i r n a 2 4 小时 时已经迁移满了，而实验组s i r n a2 4 小