（遗传学专业论文）一个新的wolbachia插入序列因子wise的分离和鉴定.pdf

二竺塑塑丝竺型竺堡垒生型塑王塑! 里塑坌塑塑些塞一一 摘要 w 0 1 b a c h i a 是一类寄生于许多节肢动物细胞质内的类立克次氏体细 菌。该细菌与节肢动物群体内的生殖、发育异常现象相关，其中最常见的 一种是胞质不相容性( c y t o p l a s m i ci n c o m p a t i b i l i t y ，c i ) ，它赋 予了感染w o l b a c h i a 的个体相对与非感染个体在生殖上的优势。 为了研究c i 现象的分子机制，我们利用代表性差异分析法q 碴p r 罅 e n t a t 主。行哥 叼i t r 百菇矗c e 一- a n a l y s i s ；r d a ) 、分析了c i 表型不同的w o l b a c h i a 的基因组差异。我们用连接介导的p c r 法( 0 岫啻嘶+ 制e c r i a 一 e d p e 鼢_ l m ：p 研计对其中一条差异片段进行了全长序列克隆，计算机 分析结果表明这是一个插入序列( 正1 n s 朗咚圭s e q u e n e 曲一f s 我们将 其命名为w o l b a c h j a 插a 序列因子( 世。士乩k 妇j 曼_ z t l s 3 y t 土o ns e q u e n - 一 p f 豇前醯t 广w r s e 9 。佬全长1 19 2 b p ，包含一对3 i b p 的不完全匹配 l 的反向重复序列和长9 9 6 b p 的转座酶基因，编码3 3 1 个氨基酸，并在靶d n a 插入位置产生2 b p 的正向重复序列c t 。我们同时还比较了w i s e 转座酶同 其它几种同源转座酶的相似性。 s o u t h e r nb l o t 结果表明：在强烈诱导c i 的w o l b a c h i a 品系w r i ( 存在于果蝇d r o s o p h i l a s i m u l a n sr i v e r s i d e 品系) 的基因组 中，w i s e 至少有五份拷贝，但在我们检测的其它几种w o l b a c h i a 品系中 ， 没有检测到明显的阳性信号。丫 j ， 关键词：w o l b a c hj a ，胞质不相容性，代表性差异分析法，w o lb a c h j a 插 入序列因子 二尘堑塑丝竺型竺堡垒壁型里王塑! ! ! 堕坌堕塑鉴壅 a b s t r a c t w o i b a c h i aa r e a g r o u p o fr i c k e t t s i a l i k e b a c t e r i a t w h i c h p a r a s i t i z e i naw i d e r a n g e o fa r t h r o p o d s t h e s e b a c t e r i aa r ea l w a y s a s s o c i a t e dw i t h t h ea b n o r m a l p h e n o m e n a d e v e l o p m e n t f o u n di n o n e a r t h r o p o d s 7 r e p r o d u c t i o na n d o fw h i c h js c y t o p l a s m i c i n c o m p a t i b i l i t y ( c i ) w o l b a c h i a e n d o wt h e i rh o s t sw i t h r e p r o d u c t i v ea d v a n t a g e o v e rn o n i n f e c t e dc o u n t e r p a r t s t h r o u g ht h e s em o d i f ic a ti o n s i no u rr e s e a r c h ，r d a ( r e p r e s e n t a t i o n a l d i f f e t e n c e a n a l y s i s ) w a s u s e dt od e t e c tt h ed i f f e r e n c e sb e t w e e n w o l b a c h i as t r a i n s h a v i n g d i f f e r e n t a b i l i t y t oi n d u c e c i o n eo ft h ed n af r a g m e n t si s 0 1 a t e d f r o mr d aw a s c l o n e d b y l m p c r t h er e s u l to f c o m p u t e ra n a l y s i s r e v e a l e di ti s a ni n s e r t i o n s e q u e n c e ( i s ) a n d t h e nw a s d e s i g n a t e d a sw i s e ( 1 o i b a c h i a i n s e r t i o n s e q u e n c e e 1 e m e n t ) t h i sn e a r l y h a sas iz eo f1 1 9 2 b p i n v e r t e d r e p e a t sa n d d i s c o v e r e d w i t h 3 1 一b p 9 9 6 b p o r f i n s e r ti o n s e q u e n c e i m p e r f e c t t e r m i n a l w h i c he n c o d e sa p u t a t i v e 3 3 1 一a a t r a n s p o s a s e i t s t r e n s p o s i t i o n g e n e r a t e s a 2 b p d i r e c t r e p e a t c ti nt h ei n s e r t e ds i t e o f t a r g e t d n a t h e s i m i l a r i t y c o m p a r i s o n b e t w e e nt h e t r a n s p o s a s e o fw i s ea n do t h e r h o m o l o g o u st r a n s p o s a s e s w a sa l s od o n e s o u t h e r n b l o t t i n g r e v e a l e dw i s ei s s 0 1 e l yf o u n d i nw r is t r a i nw o l b a c h j a ，w h i c h1 i v ei n d r o s o p h i l a 二尘堑塑竺! 型竺塑垒堡型璺至型竖旦塑坌蔓塑竺塞一 s i m u a 力sr i v e r s i d e ( d s r ) s t r a i n a n di n d u c es t r o n gc i w r ic 。n t a i n sa t l e a s tf i v ec o p i so fw i s eb u tw i s e i s n o tp r e s e n ti n a n yo t h e r r e l a t e dw o l b a c h i as t r a i n s e x a m i n e d k e yw o r d s ：w o l b a c h i a ，c i ，r d a ，w i s e ：尘塑塑些! 型竺堡垒壁型里王q 竺! ! ! 塑坌塑塑鳖室 引言 w o l b a c h i a 和胞质不相容现象 w 0 1 b ac h i a 是一类寄生于多种节肢动物细胞内的类立克次氏体细 菌，这类细菌通过宿主卵细胞质纵向传播至子代。在长期的与宿主相互作 用过程中，w o l b a c h i a 进化出独特的生存策略，其主要特征是对宿主生 殖系统的修饰作用，这其中尤以细胞质不相容性( c y t o p l a s m i c i n c o m p a t i b i l i t y ，c i ) 最为引人注目。近年来，对于w o j b a c h i a 及其所引 起的c i 现象的研究取得了很大的进展，现对近年的研究成果综述如下。 一背景简介 w o l b a c h i a 最初于19 3 6 年为h e r t i g 在c p i p i e n s 物种复合体中发 现( 1 ) 。l a v e n ( 2 ) 等人在5 0 年代发现在c u l e x 属的蚊子中，某些种内的 交配是不相容的，即这类交配不产生或产生数目极少的子代，他们还同时 发现这类不相容交配呈母系遗传( 细胞质遗传) 方式，从而将这种现象命 名为细胞质不相容性。7 0 年代早期，y e n 和b a r r 的研究将c i 与 w o l b a c h i a 联系起来( 3 ) ，他们发现在用抗生素将w o l b a c h i a 从c u f f e x 体内清除以后，c i 现象也随之消失。在随后的2 0 多年时间中，在许多昆 虫种系内发现了c i 现象，包括甲壳昆虫( 4 ) ，象鼻虫( 5 ) ，寄生性胡蜂类 昆虫( 6 ) ，稻飞虱( 7 ) ，a e d e s 属蚊子( 8 ) ，以及果蝇( 9 14 ) 。在这些昆 虫中，研究者们能在显微镜下观察到类立克次氏体的细菌，而且在经过抗 生素处理后，c i 现象消失。这些都意味着某种细菌与c i 现象的关联。在 相关的研究中，人们发现其它呈母系遗传的寄生细菌与宿主的异常性比现 象和性别决定有关( 1 5 ) 。其中，在等足类动物中发现的雌性化诱导因子 ( 16 ) 和在胡蜂类昆虫中发现的孤雌生殖诱导因子1 17 ) 有与w o l b a c h i a 相 类似的特性，在经抗生素处理后，宿主雌性化和孤雌生殖现象均告消失。 一个新的w o l b a c h i a 插入序列因子o s e ) 的分离和鉴定 所有这些节肢动物细胞内寄生细菌均不能在体外培养的条件下存活， 这给对于这类微生物的研究，包括分类、生理等等带来了较大的困难。在 9 0 年代初，随着分子生物学的发展，研究工作取得了较大进展。 0 n e i l l 等人利用高温多聚酶链式反应( p c r ) ，成功地扩增了 w o l b a c h i a 的16 sr r n a ( 18 ) 。随后，研究者们利用p c r 方法扩增、克 隆了多种细胞内寄生菌的1 6 9r r n a ，2 3 sr r n a 等基因片断并且进行了 序列测定，对于这些分子数据的系统发生分析表明c i 细菌、雌性化因子 以及孤雌生殖诱导因子形成了个单源发生的种群一w o l b a c h i a ( 18 2 1 ) 。这一类的细菌在长期的与宿主相互作用过程中，进化出独特的生存机制 ，它们成了改变宿主动物的生殖和发育过程的专家。然而，由于16 s r r n a 基因的进化速度很慢，因此用这个基因无法区分w o l b a c h i a 的不同 品系。随后，w e r r e n 等用进化更快的细菌细胞循环基因f t s z 提高了 w o l b a c h i a 9 支内的系统发生分辨率( 2 2 ) 。但是以上基因都不能用于解 决具有不同生殖表型的w o l b a c h i a 品系之间的系统发生关系，最近克隆 的编码w o l b a c h i a 主要外膜蛋白的基因w s p 解决了这个问题，w s p 基因是 目前已知的w o l b a c h i a 内多态性最高的基因，来自2 8 个w o l b a c h i a 品系 的w s p 基因序列的比较表明它们的差异可达2 3 ，它也是目前已知的 w o l b a c h j a 基因中进化速度最快的基因，因而可用来对w o l b a c h i a 进行 最为精细的系统发生研究( 2 3 ) 。z h o u 等基于已知的2 8 个w o l b a c h i a 品 系的w s p 的部分序列，设计了系列的p c r 引物来区分不周宿主来源的 w o l b a c h i a ，并为这些不同的品系进行了分组( 24 ) 。 尽管如此，目前对于w o l b a c h i a 的研究总体而言还不够深入，对 于它们与宿主作用的分子机制就更是知之甚少。目前已克隆、分离的数 个w o l b a c h i a 基因都缺乏与c i 现象的直接联系。w o l b a c h i a 基因组 计划( w o l b a c h i ag e n o m ep r o j e c t ) 已在进行之中，而且果蝇的全 基因组测序已经完成，这必将极大地推动对w o l b a c h i a 诱导的c i 现 象分子机制的研究。 = 尘堑塑竺竺壁塑堡垒堡型里至塑! 璺堕坌壅塑些室 一 二胞质不相容现象 军x v ，早x 旱x ， 旱xc f r 早， 章x ( ；姜， ! x ，仝x 图一所示的是在二倍体生物中的情形，如果宿主的性别决定是二倍一 单倍体方式的话，相容的交配子代性比是正常的，而不相容的交配只产生 雄性后代( 2 8 ) 。此外，一种宿主可以被两种w o l b a c h i a 感染，这种超感 染相对于只感染两者之一的宿主表现出与图一a 相同的不相容性状( 2 9 ) 。 迄今为止，对于w o l b a g 力i a c i 作用的机制了解不多。较为普遍接受 的一种模型是“修饰一拯救”模型。根据这一模型，w o l d a c 力i a 修饰了 宿主的精子，而只有相同或相近品系的w o l b a c h i a 能在卵细胞中拯救这 种修饰作用。相应的生化模型是w o l b a c h i a 移走了精子染色体上的某些 蛋白质，父本染色体在受精后不能正常凝集，在第一次有丝分裂时不能正 常分配到两个子代细胞中去。在二倍体生物中，这种情形造成了胚胎致 二尘堑塑竺堡型塑堡垒坐型里三塑! ! ! 堕坌塞塑鳖塞 一 死：而在二倍一单倍体性别决定的生物中，其表型则是子代全部或大部为 雄性。而如果卵细胞也被同种w o l b a c h i _ 童感染，w o l b a c h i a 也移走卵子 染色体上的同种蛋白质，父本、母本染色体的凝集同时滞后，第一次有丝 分裂在总体上也呈滞后状态，从而两套染色体都能正常分配到子代。而在 双向不相容交配中，由于雌雄个体感染了不同的w o l b a c h i a ，它们可能 移走了不同的染色体蛋白质，所以不同的w o l b a c h i a 不能拯救精子中的 修饰作用。r i p a r b e l l i 等人的研究揭示了在不相容的交配中，来自父本 的染色体确实不能正常地与母本染色体同时凝集f28 ) 。 在利用了分子生物学手段进行分类分析以后，研究者们发现了一些不 能诱导c i 的w o l b a c h i a ( 30 ) 。理论预测，w o l b a c h i a 可根据其诱导c i 以及拯救能力分为四类：1 i n d + r e c + ，即能诱导c 1 也有拯救能力，2 i n d + r e c 一，即只能诱导c i 但不能拯救，3 i n d r e c + ，即不能诱导c i 但有拯 救能力，4 i n d r e c 一，即不能诱导c i 也不能拯救c i 。其中i n d + r e c 一在 进化上是不稳定的，因此很可能不能在自然群体中检测到。i n d + r e c + ，i n d r e c 一早期即被发现( 3 1 ) ，b o u r t i z 等人在最近的研究中终于发现了 i n d r e c + 的w o l b a c h i a 品系( 3 2 ) 。用w 0 1 b a c h i a 染色体基因作系统 发生树时发现，所有具有相似拯救能力的w o l b a c h ia 在系统发生树上的 位置也非常相近，推测与补偿相关的基因( 或基因簇) 位于w o l b a c h j a 的染色体上，而另一方面，w o l b a c h i a 修饰精子染色体的能力似乎同这 些w o l b a c h a 在系统发生树上的位置没有关系，因此修饰相关的基因 ( 或基因簇) 可能位于质粒或者可移动的遗传因子( 如转座子) 上。 w o l b a c h j a 寄生于宿主的细胞质内，而且如前所述，是通过卵的细 胞质传播的。在如图一所示的单向不相容交配中，我们可以看出w o l b a c 力j a 赋予其宿主相对于非感染昆虫生殖上的优势，从而在一个非感染群体 中迅速扩散。所以，w o l b a c h i a 的这种特性对于寄生于细胞质内的细菌 有着进化上的意义。与此同时，w o l b a c h i a 也能带动宿主其他细胞质因 子( 如m i t o c h o n d r i a l ，等) 在个群体中取代其他的同种细胞质因子。 事实上，t u r e l l i 等人对c a l i f o r n i ad r o s o p h i l as i m u l a n s 群体的 二尘塑塑堑竺! 生竺塑垒壁型堕王q 竺! 旦塑坌堕塑鉴垄 研究已经证实了这一点( 3 1 ，3 3 ) 。w o l b a c h i a 在群体中的扩散是一个非 常复杂的过程，除了与w o l b a c h i a 诱导c i 的能力有关以外，还受到w o l b a c 由j a 纵向传播效率、宿主基因型、环境等因素的影响( 1 2 ) 。较为常她 的一种情况是w o l b a c h i a 感染给宿主带来一定的适应负担，其与w o l b a c j a 诱导c i 相互作用的结果则是w o l b a c h i a 比率在群体中保持一定的平 衡。 我们很容易看出双向不相容交配在事实上形成了一种生殖隔离，从而 w o l b a c h i a 感染很有可能加速种间分化的过程( 19 ，28 ) 。最近的研究表 明w o l b a c h i a 可能感染了约16 的昆虫物种( 2 2 ) ，这一方面反映了w o l b a c b i a 的分布广泛，从另一个角度看，这也可能是由于在长期进化历程 中，w o l b a c h i a 在昆虫的物种分化中扮演了重要的角色造成的。 三w o l b a c h i a 和c i 现象的研究和应用前景 对于w o l b a c h i a 引起的c i 现象的研究有着理论和实践上的双重意义 。理论上，由于w o l b a c h i a 的广泛分布及其对宿主引起的c i 现象，w o l b a c h i a 是研究昆虫进化的很好的材料，研究w o l b a c h j a 宿主对于w o l b a c h i a 反应导致的进化以及w o l b a c h i a 和宿主相互作用的进化，是进化遗传 学上非常有意义的课题。此外，c i 现象与w o l b a c h i a 宿主的发育过程也 有着紧密的联系，如精子发生、卵子发生以及胚胎早期发育的染色体形态 、生化变化。研究c i 现象有助于我们更好的理解这些发育过程的机制( 3 4 ) 。 在实践上，研究者们根据w o l b a c h i a 诱导的c i 特性提出了一种不同 于传统的转基因昆虫策略( 3 5 ) 。众所周知，传统的治理媒介昆虫的方法 主要依靠生物化学防治( 如使用化学杀虫剂) ，这种方法虽然曾经取得巨 大的成功，但现在却面临越来越多的问题，如造成环境负荷，抗性媒介昆 虫的出现等等。早在19 68 年，就有科学家提出一种新的防治策略，即： 应该“改造”昆虫，降低其作为载体传播病毒的能力，而非消灭它们。随 着分子生物学和遗传工程技术的发展，转基因昆虫策略由梦想变为可能。 二竺堑塑塑竺! 苎竺堡垒堡型望三坚! ! 里堑坌壅翌鳖塞 。 一 对于转基因昆虫而言，有两个问题必须解决：1 ) 如何使转基因昆虫取代 自然昆虫群体并在自然界传播。2 ) 找到可以稳定转入和表达目的基因 的有效方法。 第一个问题的难点在于我们很难确保转基因昆虫具有生殖上的优势， 即便能够确证这一点，利用转基因昆虫生殖上的优势使其取代自然群体也 需要极长的时间。利用w o l b a c h i a 诱导的c i 特性，我们可以转化w o l b a c h i a 自身或其他细胞质因子，比如其它寄生于细胞质内的寄生菌，再利用 w o l b a c h i a 诱导的c i 特性，使转入昆虫的基因得以在自然群体中扩散。 对于自然界中业已被感染的昆虫群体，我们可以通过引入超感染来实现这 一目的。 对于转入外源基因有两种策略：一是直接转外源基因到昆虫体内，二 是先把外源基因转化到昆虫的共生菌体内，再把共生菌转入昆虫体内，让 外源基因在共生菌中表达并分泌到昆虫体内( 可以通过在外源基因前加上 一段分泌信号肽达到这一目的) 。与前一种方法相比，后一种方法有以下 优点：首先，转化细菌要比转化复杂的真核昆虫细胞容易的多，其次，转 化好的共生菌可以同时运用到多种媒介昆虫中，最重要的是，胞质共生菌 可以通过w o l b a c h i a 引起的c i 很容易地就在自然群体中传播。 质粒和转座子是转移和表达外源基因的常用载体。但到目前为止在w o b a c h j a 中还没有找到质粒，在e c o l i 中常用的质粒能否同样适用于转 化w o b a c h i a ，目前也没有有关这个问题的任何报道。相比之下，转座 子也许是更好的选择，一方面，转座子可以将外源基因插入w 。i b a c h j a 染色体，从而获得稳定表达外源基因的w o l b a c h i a ，另方面，对w o l b a c h i a 插入序列( i n s e r t i o ns e q u e n c e ，i s ) 的分离研究最近已有突破 。s h i n j im a s u i 等第一个分离到w o l b a c h i a 插入序列( 3 6 ) ，最近，我 们克隆至一个更具i s 结构特征的w o l b a c h i a 插入序列因予( w o l b a c h i a i n s e r t i o ns e q u e n c e e l e m e n t ，w i s e ) 。这些都为进一步的研究打 下了基础。 二竺塑堕竺竺型竺堡全生型望兰! 竺! ! ! 塑坌堕堡兰塞一 一材料 材料和方法 1 昆虫品系与菌株 果蝇品系d r o s o p h i l a s i m u l a n sr i v e r s i d e( d s r ) ， d r o s o p h l l a m a r it i a n a ( m a u ) ，d r o s o p h i l a s i m u l a r t s ”8 ”1 1 1 。 ( d s w ) ，d r o s o p h i l as i m u l a n s ”3 1 1 。d r o s o p h i l a s i m u l a n s r i v e r s i d e ( d s w d s r )，d r o s o p h i l a s i m u l a n s “ d r o s o p h i l a i n a r it i a n a( d s w m a u ) ，d r o s o p h i l a s i m u l a n s n o u m e a ( r 3 a ) ，d r o s o p h i ja m e l a n o g a s t e rc a n t o n s ( d m ) ， d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 6 7 “3 ( y w ) ，均由y a l e 大学s c o t t o ，n e i l l 博士提供，除d s w 外均携带共生菌w o l b a c h i a ，其中d s r 、 d s w d s r 携带w o l b a c h i a 为w r i ，m a u 、d s w m a u 携带w o l b a c h i a 为w m a ，r 3 a 、d m 、y w 携带的w o l b a c h i a 依次为w n o 、w m e i c s 、 w m e l 。其中w r i ，w n o ，w m e l 能诱导c i 表型，而w m a ，w m e i c s 则不 能。果蝇d s r ，m a u ，r 3 a ，d m ，y w 经四环素处理后体内的w o l b a c h i a 均被清除，其简称为d s r t ，m a u t ，r 3 a t ，d m t ，y w t ，在本实验中用作 阴性对照。 大肠杆菌( e c o l i ) x l lb l u e 为本实验室保存菌株：大肠杆菌 ( e c o l i ) b l 2 1 ( d e 3 ) ，是用于高效表达p e t 系列的宿主菌，本实验室保存。 2 酶与质粒 限制性内切酶、t 4d n a 连接酶购自n e we n g l a n db i o l a b s 公 司；p f ud n a 高温多聚酶购自s t r a t e g e n e 公司；t a qd n a 高温多聚 酶购自p r o m e g a 公司；p g e m - t 用于t a 克隆，购自p r o m e g a 公司。 p e t - 3 2 a 表达载体购自n o v a g e n 。 二尘堑竺些竺堂! ! 塑垒壁型塑王q 塑! ! ! 塑坌塑翌兰重一 3 主要试剂 1 ) 胶回收d n a s o li6 m 0 1 l n a i s o l i i经p b s 处理的s i 0 2 粉重悬于3 m o l l n a i ，至终浓度 10 0 m g m l s o l i i i5 0 r e t o o l ln a c l 1 0 m m 0 1 lt r i s c l ( p h 7 5 2 5 m m 0 1 le d t a ( p h 8 0 使用时加等体积的无水乙醇 21h o i m e s b o n n e rb u f f e r 0 1m o l l t r i s h c l ( p h 7 5 o 3 5m 0 1 ln a c l 1 0m m o l l e d t a ( p h 8 0 2 s d s 7m 0 1 lu r e a 其余常用试剂参照分子克隆实验指南( 37 ) 和n o v a g e n 操作手册。 二方法 1 常规分子克隆操作，如碱裂解法小规模抽提质粒d n a ，限制性内切酶 酶解反应，d n a 连接反应，大肠杆菌转化等按分子克隆实验指南( 3 7 ) 进行。 2 p c r 反应 反应体系： 模板1 u l 5 端引物( 2 0 u m o l l ) 0 5 u l 3 ，端引物1 2 0 u m o l l ) 0 5 u l 全堑塑竺堡! 丝竺塑叁壁型里三型堡里塑坌塑塑鉴星 一一 d n t p 混合物( 1o n m o l l ) 0 5 u l 10 缓冲液2 u l 2 5 n _ 【i m o l l m g c l 2 2 u 1 t a q 酶( 5 u u 1 ) 0 2 u l 无菌水1 3 。3 u l 2 0 u l p c r 反应条件是：首先在9 4o c 下变性3 分钟，然后9 4 。c 下1 分钟，5 5o c 下1 分钟，7 2o c 下1 分钟完成一个循环，共进行3 5 次 循环，最后7 2 。c 下1 0 分钟。 3 d n a 片段回收 将胶条置于2 倍胶体积的s o li 中，5 5 。c 放置3 5 分钟至胶溶， 加入s o l i i5 6 u l ，摇匀后室温放置5 分钟，13k 离心1 分钟，弃 上清，加s o l1 1 10 5m l ，重悬沉淀，1 3k 离心1 分钟，弃上清， s o l i i i 重复洗涤1 2 次，沉淀于5 0 。c 干燥1 0 分钟，用适量t e 或 双蒸水重悬沉淀，室温放置5 分钟。1 3k 离心1 分钟，取一h 清。 4 代表性差异分析法 ( 1 ) 引物的设计和接头的产生 用于制备扩增子的r 系列引物： 5 a g c a c t c t c c a g c c t c t c a c c g c a 37 ( r b g l24 ) ， 57 g a t c t g c g g t g a3 ( r b g l l 2 ) 。 用于第一轮杂交与扩增的j系列引物： 5 7a c c g a c g t c g a c t a t c c a t g a a c a 3 7 ( jb gl24 ) ， 5 7g a t c t g t t c a t g 3 ( j b 9 1 1 2 ) 。 用于第二轮杂交与扩增的n系列引物： 5 7a g g c a a c t g t g c t a t c c g a g g g a a 3 7 ( n b g l24 ) ， 5 7g a t c t t c c c t c g 3 ( n b g l l 2 ) 。 接头产生是将等摩尔浓度的各系列引物等体积混合进行退火，反应条 件是：温度逐渐从5 0 。c 下降到1 0 。c ，1 小时。 ：j ：塑! ! 竺竺壁竺堑垒坚塑型羔! 兰! i 曼塑竺璺塑兰垄 一 ( 2 ) 制备扩增子 将经b g ji i 酶解消化的检测子和驱赶子d n a 各l u g 分别与0 5 n m 。l 的j 系列接头引物混合l6 。c 连接过夜，以连接产物为模板，用j 系列引物进行p c r 扩增，所得产物即为扩增子，用b g l i i 酶解扩增予 以除去接头。 ( 3 ) 差异性富集 将0 5u g 与j 系列接头引物连接的“检测”扩增子和4 0u g “驱 赶”扩增子混合，变性，6 7 。c 杂交2 0 小时，用t a q 酶补平产物末 端，然后用jb g l 24 引物进行p c r 反应，p c r 产物经b g li i 酶解后重 新连接上n 系列接头引物进行第二轮削减杂交和扩增，产物克隆入 p g e m t 载体进行测序和分析。具体操作参见文献( 3 8 ) 。 5 连接介导的p c r ( 1 ) 单引物延伸 将经合适限制性内切酶酶切过夜的总d n a 用两倍体积10 0 乙醇沉 淀，沉淀经离心后用7 0 乙醇洗涤1 2 次，最后溶解于适量t e 或双蒸 水中作为单引物延伸反应的模板。单引物延伸反应的反应体系同p c r 反 应( 唯一不同的是单引物延伸反应只需一种引物) ，反应条件是：9 5 。c 5 分钟，6 0 。c30 分钟，76o c1 0 分钟。 ( 2 ) 退火产生接头 将等摩尔浓度的l m i 、l m 2 引物等体积混合进行退火，反应条件同方 法3 ( 1 ) 。 ( 3 ) 连接反应 将单引物延伸反应产物与经退火所产生的部分双链寡聚核苷酸接头混 合进行连接反应，反应体系参照分子克隆实验指南，反应条件是1 6 。c 温育过夜。 ( 4 ) 巢式p c r 第一轮p c r 的模板是连接产物，引物是l m i 和外侧引物， 第二轮p c r 的模板是第一轮p c r 产物的10 。稀释物，引物是l m i 和 一个新的w o l b a c h i a 插入序列因子( m s e ) 的分离和鉴定 内侧引物，p c r 反应体系和反应条件均参照方法2 进行。 6 基因克隆、测序和数据整理、分析 p c r 反应结束后，直接吸取1p lp c r 反应产物与p g e m - t 载体 ( p r o m e g a ) 进行连接反应，转化子经酶切鉴定正确后测序，每次随机测 定3 个独立克隆的序列，以它们的一致顺序为准。序列测定由博亚生物技 术有限公司完成。所得数据在计算机上用d n a s t a m 、g c g 等软件进行整 理和分析，部分分析在国际互联网上相关网站完成。 7 果蝇的总d n a 抽提 取果蝇于适量h o l m e s b o n n e rb u f f e r 中，将果蝇碾碎，用等体积 的酚氯和等体积的酚各抽提一次，重复以上抽提过程直至上清变为无 色，转移上清，加入两倍体积无水乙醇，一2 0 。c 放置1 小时，1 3k 离 心1 0 分钟，弃上清，沉淀溶于含2 0 u g u lr n a s e 的适量t e 中，3 7 o c 温育3 0 分钟，用等体积的酚氯和等体积的酚各抽提一次，转移上 清，加入两倍体积无水乙醇和l 1 0 体积3m o l l 的n a a c ( p h 5 2 ) ， 一2 0 。c 放置至少1 小时，1 3k 离心1 5 分钟，弃上清，沉淀用7 0 乙醇洗涤，烘干后溶于适量t e 。 8 s o u t h e r nb 1 0 t 印迹分析 总d n a 经b g li i 完全酶解后进行s o u t h e r n 印迹分析，以针对转 座酶的特异性引物4 5 f ：5 ，c c at g g g a ta c tc a ag a ga t3 ，和 r d a r i ：5 a a tg a tc g at g tt c tc t at g c37 扩增作为杂交探针 。同一张膜放射自显影后洗脱探针，以针对w o l b a c h i a s p 基因的探 针再次进行杂交。所有具体步骤均按分子克隆实验指南( 3 7 ) 进行。 9 蛋白表达 参见n o v a g e n 操作手册。 ：尘堑塑竺竺型竺堡垒生型堕三塑! ! ! 竺坌塞塑鳖塞 结果与讨论 一代表性差异分析法( r d a ) 分离w o l b a c h i a 的差异基因 ( 一) r d a 可有效地分析基因组的差别 我们的研究着眼于w o l b a c h i a 诱导c i 现象的分子遗传研究，着重 点在研究不同w o l b a c h i a 之间的差异。由于w o l b a c h i a 不能体外培 养，而转化w o l b a c h i a 等技术尚未建立，我们希望利用分子生物学手段 来分析诱导不同c i 表型的w o l b a c h i a 之间的基因组水平上的差异并最 终分离出与c i 现象相关的d n a 多态性标记乃至相关的基因( 簇) 。本研 究将促进我们对w o l b a c h i a 与其宿主相互作用的了解，有助于对于昆虫 发育过程中重要过程的理解。同时，c i 相关基因也有望应用于转基因昆 虫在自然群体中的传播。 代表性差异分析法( r e p r e s e n t a t i o n a l d i f f e r e n c e a n a l y s i s ，r d a ) 是实现这一目的的有力工具。r d a 是一种在消减杂交 的基础上发展起来的用于研究基因组之间差异的方法。该法的优点在于 通过限制性内切酶消化基因组d n a 降低了基因组的复杂性，再经过多轮 消减杂交的动力性富集并结合p c r 的指数扩增，从而使差异性的靶基因 片段得以大量富集。 我们选择了两种感染有w o l b a c h j a 且c i 表型不同的果蝇品系 d s w d s r 和d s w m a u 分别作为r d a 实验中的检测子( t e s t e r ) 和驱赶子 ( d r i v e r ) ，其中d s w d s r 感染有来自于d s r 的强烈表达c i 的 w o l b a c h i a 品系，而d s w m a u 感染有来自于m a u 的不表达c i 的 w o l b a c h i a 品系。另外，由于d s w d s r 和d s w m a u 具有相同的遗传背 景，这样在做r d a 的过程中可以最大限度地降低宿主片段的干扰。 二) 获得r d a 产物 r d a 流程图见图二。分别抽提检测子d s w d s r ，驱赶子d s w m a u 的总 二全堑塑丝竺! 生竺垫垒生型璺王型堡! ! 塑坌曼塑坚重一 d n a ，然后用b g ji i 酶解消化并制备扩增子。将制备好的“检测”扩增 子和显著过量的“驱赶”扩增子混合在一起，分别用j 系列和r 系列引物进 行两轮差异性富集，所得r d a 产物主带在s 0 0 b p 左右，与预期结果完全吻 合( 见图三) 。 c l o n ea n d a n a l y z e 图二r d a 示意图 ：全堑堕竺竺型竺堡查堡型望至q 塑! 旦塑坌堕塑篓星 一 图三r d a 产物电泳图 1 r d a 产物，2 分子量m a r k e rd l 2 0 0 0 ( 三) 鉴定r d a 产物 我们所得的r d a 产物实际上组成了一个d n a 次级库，将以上r d a 产物 与p g e m t 载体连接，转化，挑选转化平板上的白色转化子，以p g e m - t 载 体上的s p 6 m t 7 引物进行p c r 鉴定，经p c r 鉴定的阳性克隆通过质粒抽提 和酶切进行再次鉴定，随机挑选四个两次结果都呈阳性且插入片段大小有 差异的克隆( 分别为r d a i ，r d a 4 ，r d a 5 ，r d a l l ) 进行测序。测序结果 经d n a s t a r 软件分析，表明这四个克隆分别为四段不同的开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r e ) ，进一步将测序结果进行b l a s t 搜索，结果 表明：r d a i 克隆未与任何基因表现出有同源性，r d a 4 克隆与一些细菌转 座酶有同源性，r d a 5 克隆与很多细菌的谷光甘肽调控的钾离子通道蛋白 ( g l u t a t h i o l i e r e g u a t e dp o t a s s i u m e f f l h xs y s t e m p r o t e i n ) 编码基因有很高的同源性，而r d a i l 克隆则与噬菌体的一些o r f 有很高 的同源性。 我们在这四段r d a 片段两侧分别设计四对引物( 引物序列见附录) ，对 d s w d s r 和d s w 进行p c r ，结果表明：从d s w d s r 中都能扩增出相应大小 的片段，而d s w 均为阴性结果( 结果未附) ，这说明我们所分离到的r d a 片 段确实是w r i 中的w o l b a c h i a 片段。 在我们获得的r d a 片段中，r d a 4 克隆由于与转座酶有高度同源性而尤 其引起我们的兴趣( 原因详见“讨论”部分) ，因此我们决定对这个片段进 行进一步的克隆和鉴定工作。 二尘堑堕丝兰! 竺丝塑垒生型里至q 竺! ! ! 堕坌堕塑些星 一 二w i s e ( w o i b a c h i ai n s e r t i o ns e q u e n c ee i e m e n t ) 的克隆和鉴 定 ( ) 目的基因的克隆 连接介导的p c rf l i g a t i o n m e d i a t e dp c r ，l mp c r ) 被用来克隆 目的基因的全长d n a 。为了克隆目的基因的5 上游序列，酶解d s r 总d n a ，然后用引物r d a r 对酶解产物进行单引物延伸以产生平头末端，所得产 物与引物l m i ，l m 2 经退火所产生的部分双链寡聚核苷酸的平头端进行连 接。以内侧引物r d a r 和l m i 对连接产物进行第一轮p c r 。p c r 产物稀释后 再以外侧引物r d a r i 和l m i 进行巢式p c r ( 图四) 。同时对d s r t 做同样的l m p c r 以作为阴性对照，克隆和测序与d s r t 样品有差异的p c r 产物( 图 五a ) 。 克隆目的基因的3 ，下游序列所用方法与上述一致，所用内外侧引物分 别是r d a f 和r d a f i 。对有差异的p c r 产物进行克隆和测序( 图五b ) 。 p c r 移，我们获得一段长约1 6 k b 的序列，它包含了长9 9 6 b p 的完整 开放阅读框。为了排除t a q 酶扩增引入的差错，以确定基因的确切序列，我们又设计了 引物r d a f 2 ，4 5 f ，r d a r 2 ，并设计合适引物组合进行p c r ，通过核对三个相同序 列，从而确定了序列的正确性( 引物序列见附录) 。 二! 望堕! _ 竺型丝苎塑塑翌! 壁! 塑至! 竺! ! ! 塑坌塞塑鳖壅 图五l m p c r 扩增w i s e 基因 滋 协箍蚶为为 慧一 加箭 怒一 酷鼬黧 北亡 儿眦拈黧 二全堑塑塑竺型竺堑尘壁型堕王尘丝! 旦塑坌堕塑竺塞一一一 ( 二) 新克隆的基因是一个w o l b a c h i a 插入序列因子( w i s e ) 我们克隆的序列包含一段编码3 3 1 个氨基酸的长9 9 6 b p 的完整开放阅 读框，b l a s t 分 斤表明它与转座酶有很高的同源性，我们在开放阅读框的 两侧同时发现两段长3 i b p 的不完全匹配的反向重复序列( i m p e r f e c t i n v e r t e dr e p e a ts e q u e n c e ，i r s )