（内科学专业论文）crfr2在中枢神经系统肿瘤中表达的研究.pdf

目录 删刚幽i f i f i i y 19 0 0 芍百5 。 中文摘要1 英文摘要3 研究论文c r f r 2 在中枢神经系统肿瘤中表达的研究 前言”“”“”一”一”一”一一6 日u 吾“”“”“”“”“”“”一“。o 材料与方法6 结果“一“一“一”“”1 3 附图1 4 附表1 9 讨论“一”2 0 结论一一“”“”一2 3 参考文献2 3 综述促肾上腺激素释放因子( c r f ) 家族神经肽及其受体2 的 研究与进展2 5 致谢一一一”一“”一4 1 个人简历4 2 中文摘要 c 砒眦在中枢神经系统肿瘤中表达的研究 摘要 c r f 是一种重要的下丘脑神经肽，主要分布在下丘脑，调节机体在 应激状态下的下丘脑垂体肾上腺轴( h p a ) 的功能，对应激状态下的内分 泌、自主神经系统、免疫系统、生理学及行为学等方面的反应也有协调作 用。此外，c r f 还广泛分布在外周组织中，功能涉及到心血管、胃肠道、 皮肤、泌尿、生殖及肿瘤增殖、体温等方面。c r f 有二种具有生理学活 性的受体，即c r f r l 和c r f r 2 ，c r f 通过与其受体结合发挥效应。c r f i 也 是c r f 的一种重要受体，现有的研究文献报道在一些类型的人类恶性肿 瘤中也已经发现有c i 心r 2 的表达，并在一些动物模型实验中证实c i 心r 2 与肿瘤的增殖、转移、肿瘤血管的发生和免疫逃避等有关。而至今国内外 尚未有c i 心i 也在中枢神经系统神经上皮源性肿瘤中表达的明确报道。 目的：探讨促肾上腺皮质激素释放因子受体2 ( c r f r 2 ) 在人类中枢神 经系统胶质瘤组织、垂体瘤组织及人类神经胶质瘤细胞株u 8 7 中的表达 情况。 方法：随机收集临床手术切除的病理诊断明确的各种类别的胶质瘤 3 0 例，1 0 例垂体腺瘤及购买人类胶质母细胞瘤株u 8 7 ，应用c i 心r 2 抗体 分别对所收集到的组织标本和培养细胞进行免疫组化染色( i h c 和i c c ) 并分析结果。提取培养细胞u 8 7 的总r n a ，设计引物，进行r t - p c r 实 验，对扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，分析c r f r 2 1 1 1 】 a 在u 8 7 上的表达。 应用医学统计学软件s p s s l 3 o ，对c r f r 2 与肿瘤标记物m g m t 、g f p a 、 p 5 3 、舢9 及胶质瘤的病理分级分别进行直线相关关系的统计分析，进 而分析c r f i 也的表达与胶质瘤的关系。 结果：免疫组化样本中可见c r f r 2 阳性肿瘤细胞，着色部位位于细 胞膜部位。多为体积较大、核大或可见核分裂、核浆比例也较大的细胞， 其中有些阳性染色稍强呈棕褐色，有些稍弱呈淡黄色，且着色呈散在或片 状分布不均。组织中绝大多数间质细胞呈阴性，在有些病例还可见血管内 皮细胞或坏死区也表达为阳性。在不同的样本中，阳性细胞百分率存在较 大差异，约在5 9 0 。1 0 例垂体腺瘤均表达阳性，其中5 例泌乳素腺 中文摘要 瘤表达为中度阳性至强阳性，1 例促甲状腺激素腺瘤表达强阳性，1 例促 肾上腺激素腺瘤表达为弱阳性和3 例生长激素腺瘤均表达为弱阳性至中 度阳性。在3 0 例胶质瘤中，星形胶质细胞瘤1 6 例，c r f i 也表达阳性的有 5 例，占总星形胶质细胞瘤的3 1 2 5 ( 5 1 6 ) ，其中病理分级为i i 级的6 例，i i i i i 级2 例，均无阳性表达，6 例i i i 级标本中2 例无阳性表达，2 例 弱阳性，1 例中度阳性，1 例强阳性，2 例i v 级标本中有1 例表达中度阳 性；病理级别均为级的多形性胶质母细胞瘤3 例中有l 例表达强阳性，2 例阴性；8 例少支胶质细胞瘤病理分级i i 级4 例，i i i i i 级3 例，i v 级1 例，均无阳性表达；室管膜瘤共2 例全部表达为阴性，其中病理级别为i i 、 i i i 级各一例；髓母细胞瘤1 例无阳性表达。u 8 7 细胞株中免疫组化分析 c i 讧r 2 表达为阴性，i m p c r 的扩增产物琼脂糖凝胶电泳显示无条带，提 示c r f r 2 m r n a 在u 8 7 培养细胞中无表达。对c r f r 2 与m g m t 、g f p a 、 p 5 3 、m m p 9 及胶质瘤的病理分级分别进行直线相关关系的分析，得到的 r 值分别是o 1 5 7 、o 1 5 0 、o 1 5 7 、o 2 4 8 、o 3 6 3 ；p 值分别为o 4 0 8 、o 4 3 0 、 o 4 0 8 、o 1 8 5 、o 0 4 9 。c i 强r 2 与肿瘤分级的关系r 值o o 3 6 3 1 ，p = o 0 4 9 铲o 0 5 ，而与其他4 种指标的p 值都大于o 0 5 。 结论：在上述所研究的神经肿瘤类型中，在垂体腺瘤中，c i 强r 2 在 泌乳素腺瘤和促甲状腺激素腺瘤，促肾上腺激素腺瘤及生长激素腺瘤中均 有阳性表达。而在人类胶质母细胞瘤株u 8 7 中c i 心r 2 表达为阴性；c i 江r 2 在部分星形胶质细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤中有程度不一的阳性表达， 但在少枝胶质细胞瘤、髓母细胞瘤及室管膜瘤中皆表达为阴性。统计结果 认为c i 心r 2 与m g m t 、g f p a 、p 5 3 、m m p 9 之间的直线相关关系无统 计学意义；而c i 心r 2 与胶质瘤的病理分级有正的直线相关关系，即c l 心r 2 在胶质瘤上的表达随着胶质瘤病理级别的增加而增加，分析认为c r f i 迎 在胶质瘤上表达有统计学意义和临床意义。 关键词：c r f r 2 ；胶质瘤；垂体腺瘤；u 8 7 细胞株；表达 英文摘要 r e s e a r c h0 f t h ee x p r e s s i o n0 fc i u f r 2i nt h et u m o r0 ft h ec e n t r a l n e r v o u ss y s t e m a b s t r a c t c r f i s 锄i m p o r t a n th y p o t h a l a m i cn e u r o p 印t i d e ，a n dd i s t r i b u t e di nt h e h y p o t h a l a m u s ，w h i c hm a i n l yr e g u l a t e st h eh y p o t h a l a m u s p i t l l i t a 妒a d r e n a l ( h p a ) a x i s 如c t i o nw h e nt h eb o d yi su n d e rs t r e s s ，c o o d i n a t e st h ee n d o c r i n e s y s t e m ，t h ea u t o n o m i cn e r v o u ss y s t e ma n di m m u n es y s t e mm n c t i o nu n d e r s t i e s s c r fi sa l s o w i d e l y d i s t r i b u t e di n p e r i p h e r a lt i s s u e s ，a n dh a sa m o d e r a t i n ge f f e c to nc a r d i o v a s c u l a r ，g a s t r o i n t e s t i n a l ，r 印r o d u c t i v e ，s k i n ，e t c c r fh a s 觚or e c 印t o r s ：c r f r la n dc r f r 2 ，w h i c hh a v ep h y s i o l o g i c a l a c t i v i t y ，i tp l a yi t se f 佗c tt h r o u g ht h ec o m b i n a t i o nw i t hi t sr e c 印t o r c i 心r 2i s a ni m p o r t a n tr e c e p t o ro fc r f e x i s t i n gr e s e a r c ha n dl i t e r a m r er e p o r t e dt h a t e x p r e s s i o no fc i 江a n dc i 心i 也h a v ea l s ob e e nf o u n di ns o m et y p e so f h u m a n m a l i g n a n c i e s ，a n di n s o m ea n i m a lm o d e l si th a sb e e nc o n f i m e dt h a tt h e c i 江i 也r e l a t e dt ot u m o rp r o l i f e m t i o n ，m e t a s t a s i s ，a n g i o g e n e s i sa n di m m u n e e v a s i o n ，e t c s of 打，a th o m ea n da b r o a d ，t h e r eh a sy 戗n or 印o r to nt h e e x p r e s s i o no fc i 江i 也i nn e u r o e p i t h e l i a lt u m o r si nt h ec e n t r a ln e n ，o u ss y s t e m p u r p o s e ：t oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fc o r t i c o t r o p i nr e l e a s i n gf a c t o r r e c e p t o r2 ( c i 讧r 2 ) i nt h eg l i o m aa n dp i t u i t a qt l l m o r si nt h ec e n t r a ln e o u s s y s t e m ，a 1 1 di nh u m a nu 8 7g l i o m ac e l l s m e t h o d s ：s u 玛i c a lb i o p s ys p e c i m e n so fs o m et y p e so ft u m o r sw h i c hh a d d e f i n i t ep a t h o l o g i c a ld i a g n o s i s ，3 0c a s s e so fg l i o m a ，1oc a s e so fp i t u i t a 拶 a d e n o m a ，w h i c hw e r er a n d o m l yc o l l e c t e d ，a 1 1 dc u l t u r e dh u m a ng l i o b l a s t o m a c e l ll i n eu 8 7 w ea p p l i e dc r f i 也a n t i b o d yt ot h et i s s u es a n l p l e sc o l l e c t e da n d c e l l sc u l m r e di ni m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n ga n dt h e na n a l y z et h er e s u l t s t h et o t a li aw e r ee x t r a c t e df 砧mu 8 7c e l l sc u i t u r e d ，a i l dd e s i g n e dt h e p r i m e ro fc r f r 2 m r n af o rt h er t p c re x p e r i m e n t s ，锄p l i f i e dp r o d u c t s w e r em a d ef o ra g a r o s eg e le l e c 钒) p h o e s i s ，a n da n a l y z et h ee x p r e s s i o no f c r f r 2m r n ai nt h ec u l t u r e dc e l l s w ea j l a l y z e df o rl i n e a rc o r r e l a t i o n 3 英文摘要 一 b e t w e e nc r f r 2a n dt u m o rm a r k e rr e s p e c t i v e l yb y m e d i c a ls t a t i s t i c a ls o f t w a r e s p s s13 o ，向r t l l e r ，w h i c hi n c l u d em g m t 、g f p a 、p 5 3 、m m p - 9a n dt h e p a m o l o g i c a lg r a d eo fg l i o m a ，a n a l y z e dt h e r e l a t i o nb e t w e e nt h ee x p r e s s l o no f c r f r 2a n dg l i o m a r e s u l t ： c r f r 2 p o s i t i v es a m p l e s c a nb es e e ni nt h et u m o rc e l l s ， i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n gp a r t sl o c a t e di nt h ec e l l s m 嘶b r a n ea r e aa n d p r e s e n t e dac l e a ry e l l o wo rb r o w n m a n yo fw h i c hh a dl a 唱e rs i z e ，r o u n da n d l a r g en u c l e io rf i s s i o na n dal a r g e rk a 叫o p l a s m i cr a t i o ，a n d s o m es t a l n e d s l i g h t l ys t r o n g e rp r e s e n 伧db r o w n ，s o m e s t a i n e dw e a k e rp r e s e n t e d1 i 曲ty e l l o w ， t h ed i s t r i b u t i o n o f s t a i n i n g w a ss c a t t e r e do r f l a k e t h em a jo r i t yo f m e s e n c h 弘n a l t i s s u ec e l l sw e r en e g a t i v e ，a n di ns o m e c a s e sm ee x p r e s s i o no f p o s i t i v ei m m u n o h i s t o c h e m i s t 珂i n v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l sa i l dn e c r o s i sw e r e a l s op o s i t i v e i nd i f f e i - e n tc a s e s ，1 a r g ed i f ! i j e r e n c e si nt h ep e i c e n t a g eo f 。p o s l t l v e c e l l sa b o u tf 如m5 t o9 0 1oc a s e so fp i t l l i t a 巧a d e n o m aa ue x p r e s s e da s p o s i t i v e ，i n c l u d i n g5c a s e so fp r l a d e n o m aw h i c hw a sm o d e r a t e l yp o s l t l v et o 岛m 、ngn n 出i v e 1c a s eo ft s ha d e n o m ae x p r e s s e da ss t r o n gp o s l t l v e ，lc a s eo t s t i o n gp o s i t l v e ，lc a s eo tls ha d e n o m ae x p r e s s e qa ss 玎) i l gp o s l 【l v e ，l o a s cu l a c t ha d e n o m ae x p r e s s e dw ea _ k l yp o s i t i v e ，a i l d3 c a s e so fg ha d n o m a e x p r e s s e dw e a k l yp o s i t i v et om o d e r a t e l yp o s i t i v e i nt h e3 0c a s e so fg l i o m a ， t h e r ew e r e16c a s e so fa s t r o c y t o m a ，c r f i 匕- p o s i t i v es a n 叩l e sw e r e5c a s e s ， a c c o u n t e do nt h ep r o p o n i o no f31 2 5 i nt h ea s t r o c 舛o m ac a s e s ( 5 l6 ) i n t h e s ec a s e s ，t h ep a t h o l o g i cl e v e lo f 铲a d ei i6c a s e s ，g r a d ei i i i i2 c a s e s ，h a dn o p o s i t i v ee x p r e s s i o no fc i 江r 2 ；t h e r ew e r e6c a s e so fg r a d ei i i ，2 c a s e sw e r e n e g a t i v e ，2w e a k l yp o s i t i v e ，1m o d e r a t e l yp o s m e ，ls 仃o n gp o s l t l v e ，l c a s e e x p r e s s e da sm o d e r a t e l yp o s i t i v ei n2c a s e so fg r a d ei v ，i n c l u d e dr e s p e c t i v e l y ； lo f3m u l t i f o n n eg l i o b l a s t o m at u m o rc a s e sw h o s ep a t h o l o g i c a lg r a d e1 e v e l a r e e x p r e s s e da ss t r o n gp o s i t i v e ，2e x p r e s s e d a sn e 舀i v e ；t h ee x p r e s s i o no f c r f r 2i n2 印e n ( 1 y m o m ac a s e sw a sn e g a t i v e ，a 1 1 dt h ep a t h o l o g i c a ll e v e li i a n di i i1c a s ei n c l u d e dr e s p e c t i v e l y ； 1c a s eo fm e i l u l l o b l a s t o m ah a dn o e x p r e s s i o no f c r f i 也w h o s ep a t h o l o g i c a ll e v e lw a si v ；i m m n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i ss h o w e dt h a tu 8 7g l i o b l a s t o m ac e l l se x p r e s s e dc r f r 2 硒n e g a t i v e ， t h ea m p l m e dp r o d u c t so fi 玎p c rw e r em a d ef o rg de l e c t r o p h o r e s i sw h i c h 英文摘要 s h o w e dn ob a l l d s ，m er e s u l t ss h o w e dt h a tm e r ew a sn oe x p r e s s i o no fc r f r 2 i nu 8 7c e l l sc u l t u r e d t h er e s u l t so fl i n e a rc o r r e l a t i o nb e t w e e nc r f l 也a i l d m g m t ，g f p a ，p 5 3 ，m m pa n dt h ep a t h o l o g i c a lg r a d eo fg l i o m as h o w e dt h e “r s ：o 1 5 7 、o 1 5 0 、o 1 5 7 、o 2 4 8 、o 3 6 3 ，r e s p e c t i v e l y ：a n dt h e “p ：o 4 0 8 、 o 4 3 0 、o 4 0 8 、o 18 5 、0 0 4 9 i nt h er e s u l to fl i n e a rc o l l r e l a t i o nb e t w e e nc r f i 边 a n dt u m o r g r a d e ，“r s ”w a so 3 6 3 ，o o 3 6 3 l ，a n dt h e “p ”w a so 0 4 9 ，p = o 0 4 9 a = o 0 5 b u tt h eo t h e r4 “p w e r ea l lm o r et h a no 0 5 c o n c i u s i o n ：t h ea b o v et y p e so fn e u r a lt u m o r si n v e s t i g a t e ds h o w e dt h a t a l lt h et y p e so f p i t u i t a 拶a d e n o m as u c ha sp r o l a c t i n o m a s ，t s ha d e n o m a ，g h a d e n o m aa n da c t ha ( 1 e n o m aw e r ei np o s i t i v ee x p r e s s i o no fc r f i 也i n d e f e r e n td e g r e e i nh u m a n9 1 i o b l a s t o m ac e l ll i n eu 8 7c r f r 2i se x p r e s s e da s n a g t i v e p a r to fa s t r o c y t o m aa n dm u l t i f o m e9 1 i o b l a s t o m at l j m o r sh a dt h e p o s i t i v ee x p r e s s i o no fc r f r 2 i nd e f e r e n td e g r e ew h i l en e g a t i v ee x p r e s s i o ni n s m a l lb r a n c hg l i o b l a s t o m aa n dm e d u l l o b l a s t o m aa n de p e n d 3 恤o m a s t a t i s t i c a l r e s u l ts u 2 9 e s tt h a tt h el i n e a rc o r r e l a t i o nr e l a t i o nb e t w e e nc r f l 也a 1 1 dm g m t 、 g f a p 、p 5 3 、a i l dm m p 一9r e s p e c t i v e l yh a dn os t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ；h o w e v e r ， t h el i n e a rc o 门陀l a t i o nr e l a t i o nb e t w e e nc i 心i 也a n dt u _ m o rg r a d ei sp o s i t i v e ，i n t h ew o r d s ，t h ee x p r e s s i o no fc r f r 2i ng l i o m ai n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n go f t h ep a t h o l o g i c a lg r a d eo fg l i o m a ，a n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no f c r f r 2i ng l i o m a sh a ds t a t i s t i c a la 1 1 dc l i n i c a ls i 聃i f i c a i l c e k e y w o r d s ： c i 珂i 也；g l i o m a ；p i t u i t a 碍a d e n o m a ；u 8 7 c e l l 1 i n e ； e x p r e s s l o n 5 研究论文 c r f r 2 在中枢神经系统肿瘤中表达的研究 埠兰 日吐舌 肽类物质是具有生物活性的蛋白质片段，作为神经递质、调质和激素 类物质，参与人体的生理及病理活动，广泛分布于人体多个组织器官或系 统内。促肾上腺皮质激素释放因子( c i 心) 为4 1 个氨基酸的激素类神经 肽，主要分布在人类下丘脑【1 ，在中枢神经系统的其它部位也有广泛分布。 c r f 主要作用于垂体，通过与其受体结合，主要调控应激状态下的垂体 肾上腺轴的功能，调节促肾上腺皮质激素( a c t h ) 的分泌。近年来国外 少量研究报道发现，c i 心可抑制一些神经肿瘤细胞凋亡 2 】，促进胚胎神 经胶质瘤细胞增殖并对神经元具有保护作用 3 】。促肾上腺皮质激素释放 因子受体有2 种：c r f r l 和c r f r 2 。其中c r f i 匕主要分布在外周组织中， 尤其是在心肌细胞、消化道、肺脏、卵巢和骨骼肌中但是在中枢神经系 统也有广泛表达，主要表达在下丘脑的室旁核、侧间隔、海马、杏仁核和 视网膜、垂体和大脑皮层等 4 】。c i 讧受体亦被发现存在于某些种类的人 类肿瘤中。近年来国内外有人利用多种实验方法对中枢神经系统肿瘤中 c r f r ( 主要是c r f r l ) 的表达情况进行了研究，也取得一些进展，但对 c i 江r 2 在这方面研究目前国内外文献资料尚未见有明确报道。免疫组化 及i m p c r 在生物学研究方面是两种非常基础和成熟的技术，本实验采用 免疫组化二步法对几种中枢神经系统肿瘤临床活组织标本中c r f r 2 表达 进行定性研究，应用免疫组化二步法及i m p c r 技术对培养的人类胶质母 细胞瘤细胞株u 8 7 细胞中c i u i 匕受体的表达进行定性及半定量研究。本 研究通过对中枢神经系统肿瘤中c r f r 2 的表达的定性研究，将为进一步 研究c i 讧及c i 心r 2 与中枢神经系统肿瘤的关系提供理论参考。 材料与方法 1 实验材料 1 1 标本来源 随机选取河北医科大学第二医院2 0 0 9 年1 2 月 2 0 1 0 年4 月间手术 研究论文 切除的神经上皮性肿瘤标本3 0 例，男1 6 例，女1 4 例；年龄4 7 0 岁， 平均4 6 2 岁；垂体腺瘤标本1 0 例，男5 例，女5 例，年龄2 2 5 2 岁，平 均4 0 岁。所有标本均经4 多聚甲醛固定，石蜡包埋，4um 连续切片， 常规h e 染色，以显微镜观察为准，并经过病理学证实。其中多形性胶质 母细胞瘤3 例，病理级别均为级；星形胶质细胞瘤1 6 例，其中病理级 别为i 级l 例，i i 级的5 例，i i i i i 级的3 例，i 级的5 例，级的2 例； 少枝胶质细胞瘤8 例，病理级别为i i 级的4 例，i i - i i i 级的3 例，i i i 级的 1 例；室管膜瘤2 例，其中病理级别为i i 级、i i i 级的各1 例；髓母细胞瘤 1 例。1 0 例垂体腺瘤组织，其中5 例为泌乳素腺瘤，3 例生长激素腺瘤， l 例促甲状腺激素腺瘤和1 例促肾上腺激素腺瘤。取1 例己证实为c i i 也 染色阳性的垂体腺瘤标本为阳性对照。 1 2 细胞株来源 人类多形性胶质母细胞瘤株u 8 7 购白天津医科大学神经外科实验室 1 3 肿瘤标记物免疫组化 1 ) m g m t 免疫组化切片( 河北医科大学第二医院病理科) 2 ) g f a p 免疫组化切片( 河北医科大学第二医院病理科) 3 1p 5 3 免疫组化切片( 河北医科大学第二医院病理科) 4 1m m p 9 免疫组化切片( 河北医科大学第二医院病理科) 5 ) 肿瘤病理分级( 河北医科大学第二医院病理科) 1 4 主要试剂 1 ) a b l 2 9 6 4 兔抗人c r f r 2 多克隆抗体( 美国a b c 锄) 2 、) g k 5 0 0 7 0 5 二步法抗兔鼠通用型免疫组化检测试剂盒( 上海基因科 技) 3 1z l i 9 0 3 2 浓缩型d a b 试剂盒( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 4 ) 粘片剂多聚赖氨酸( p o l y l y s i n e ) ( 北京中杉金桥生物技术有限公 司) 5 ) k g a l2 0 2t r i z o l 总i a 提取试剂盒( 南京凯基生物科技发展有限 公司) 6 ) d m e m 培养基( g i b c o 公司) 7 ) t i a ns c r i p tc d n a 第一链合成试剂盒( 北京天根生化科技有限公 司) 研究论文 8 ) t a q d n a 聚合绿色体系( 北京天根生化科技有限公司) 9 ) c l 强r 2 引物序列由北京赛百盛基因技术有限公司合成，内参照b a c t i n 序列由上海生工生物技术服务有限公司合成 1 5 主要仪器 1 ) l e i c ar m 2 1 3 5 切片机( 德国) 2 ) l t 电脉冲生物组织摊烤片机( 浙江金华) 3 ) 康乐电热恒温水温箱( 上海) 4 ) m c o 1 5 a cc 0 2 温箱( s a n y o ) 5 ) 0 l p u s 倒置显微镜( 日本o l 、m p u si x 7 0 ) 6 ) a n k et d l 4 0 b 离心机 7 ) l a b oa u t oc l a v em l s 3 0 2 0 压力锅( 日本s a n y o ) 8 ) m i l u ) a k 超纯水纯化系统 9 ) b m hs i g m a1 1 5 k 离心机( 德国) 1 0 ) s i m f 1 2 4 制冰机( 日本s a n y o ) 11 、) e k 6 0 0 ha n d 天秤 1 2 ) p x 2 t h e m a l c y c l e r ( 美国t h e m o 公司) 1 3 ) g i s 系统读胶仪( 上海天能科技有限公司) 1 4 ) d w 7 型转移电泳仪( 上海六一仪器厂) 1 5 ) 超净工作台( 苏州净化设备有限公司) 2 实验方法 2 1 组织玻片的制备 2 1 1 载玻片的处理：将清洁载玻片浸泡浓硫酸过夜，自来水浸泡2 个小时，再用蒸馏水反复冲洗3 遍，置于烤箱烘干。干后涂以防脱片剂多 聚赖氨酸，自然晾干后装盒备用。 2 1 2 制片：将包埋好的组织蜡块制成4 斗m 切片贴于涂有多聚赖氨酸 的玻片上，置于5 8 6 0 烤箱中烘烤2 3 小时，固定后备用。 2 2 免疫组化染色 1 ) 切片脱蜡至水化：常规将石蜡切片在二甲苯溶液i 、i i 、i i i 中浸泡 脱蜡各1 5 分钟；之后与1 0 0 酒精i 、i i 中各浸泡1 0 分钟，9 5 酒精1 0 分钟，自来水冲洗，水化。 2 ) 清除内源性过氧化物酶活性：切片浸没于3 的过氧化氢溶液中，室 研究论文 温下于湿盒内避光孵育1 5 分钟，清除内源性过氧化物酶活性。p b s 冲洗3 次，每次3 分钟。 3 、) 抗原修复：( 用枸橼酸盐缓冲液高压热修复法) 将组织切片置于耐高 温切片架上，放入o 0 1 枸橼酸盐缓冲液中，置于高压锅内电磁炉 煮沸，沸腾后维持2 分钟。自然冷却至室温，p b s 冲洗3 次，每次 3 分钟。 4 ) 切片滴加一抗( 1 ：8 0 稀释的兔抗人c i 心i 也多克隆抗体) ，湿盒中孵 育并置4 冰箱中过夜。阴性对照用p b s 液代替一抗。 5 ) p b s 冲洗3 次，每次3 分钟。 6 ) 弃去p b s 液，切片上滴加g k 5 0 0 7 0 5 二步法抗兔鼠通用型免疫组化 检测试剂，3 7 孵育3 0 分钟。p b s 冲洗3 次，每次3 分钟。 7 ) 弃去p b s 液，将d a b 底物工作液滴加于切片上( 在1 1 1 1 l 双蒸水( p h 约7 o ) 中依次滴加浓缩缓冲液、d a b 溶液、浓缩过氧化氢溶液各 一滴充分混匀，制成d a b 底物混合工作液) ，镜下观察显色结果， 待阳性部分出现特异性显色而背景无着色时，自来水冲洗，终止显 色。 8 ) 将切片浸入苏木精溶液中1 0 3 0 秒，复染细胞核。酒精分化。 9 ) 梯度酒精脱水，控干；在切片上滴加中性树胶，覆盖盖玻片，封片。 2 3 设立对照 2 3 1 阳性对照：取己知c i 讧i 毪染色阳性的垂体腺瘤标本为阳性对照。 2 3 2 阴性对照：以p b s 缓冲液代替兔抗人c i 谭r 2 多克隆抗体稀释 液作为阴性对照。 2 4 结果判定 由两名病理科医生采用盲法阅片的方式进行。每张切片选取5 个高倍 视野( 4 0 0 倍) ，每个视野随机计数5 0 0 个细胞，求其平均阳性率。并 结合整张切片的阳性细胞的染色强度，以c r f i 毪定位于细胞膜上、染色 明显者为阳性。具体判断标准如下：( 1 ) 阳性细胞率小于5 时计为o 分， 5 2 5 为1 分，2 6 5 0 为2 分，5 1 7 5 为3 分，大于7 5 为4 分。 ( 2 ) 染色强度计分：无色计为o 分，淡黄色计为1 分，棕黄色计为2 分， 棕褐色计为3 分。阳性细胞率得分与染色强度得分相加，o 分计为阴性“”， 2 分计为弱阳性“+ ”，3 4 分计为中度阳性“+ + ，5 7 分计为强阳性 研究论文 “+ + + ”。 2 5 细胞培养 2 5 1 细胞复苏 ( 1 ) 取出冻存管。 ( 2 ) 迅速放入3 6 3 7 水浴，不时摇动，使其急速融化，3 0 6 0 s 内 完成。 ( 3 ) 冻存管用7 0 酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入 离心管中，再滴加1 0 m l 培养液。此操作过程在超净工作台( 超净台) 内 完成。 ( 4 ) 低速离心( 5 0 0 1 0 0 0 r m i n ) 5 m i n ，去上清后再用培养液洗一次。 ( 5 ) 用培养液适当稀释后，轻轻反复吹打细胞悬液，分装入培养瓶，3 7 于c 0 2 温箱培养，次日更换一次培养液后，继续培养。 2 5 2 细胞传代培养 ( 1 ) 弃去培养瓶内旧培养液，生理盐水轻轻冲洗培养瓶底面，尽量清除 细胞代谢产物。 ( 2 ) 向瓶内加入适量的等比例的胰蛋白酶和e d t a 混合消化液。以能覆 盖培养瓶底为宜，室温下静置2 0 3 0 秒。 ( 3 ) 弃去消化液，置3 7 孵箱下进行消化，2 3 分钟，在倒置显微镜下 观察，当发现足突消失，胞体变小变圆时，立即中止消化。 ( 4 ) 向瓶内加入h a n k s 液少量，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉， 然后再加培养液d m e m 。 ( 5 ) 使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打贴壁细胞， 使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 ( 6 ) 用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，加入适量的培养液， 置c 0 2 培养箱中进行培养。 ( 7 ) 一般2 3 d 后更换一次培养液。待细胞铺满培养瓶底面，即可使用； 也可继续传代。 2 5 3 细胞爬片 ( 1 ) 爬片前准备：爬片前，将备用盖玻片泡酸，自来水浸泡，双蒸水冲 洗后高压灭菌，并贮存于无菌状态下。备好6 孔培养板。 ( 2 ) 当细胞生长铺满瓶底的9 5 左右进行传代时，消化贴壁细胞，计数， 研究论文 制备成细胞密度约为l l o 木6 的细胞悬液。此操作步骤同细胞传代培养 步骤( 2 ) ( 5 ) o ( 3 ) 镊取清洁无菌的盖玻片置于6 孔板各孔中，用无菌吸管吸取一滴细 胞悬液分别接种于6 孔板中的盖玻片上，置于培养箱中培养。2 3 小时后， 倒置显微镜下观察，细胞贴壁或细胞足突舒展，弃去上清或继续添加适量 d m e m 培养基。继续培养2 4 小时，使细胞在盖玻片上进行贴壁生长。 ( 4 ) 当细胞进入对数生长期后取出细胞爬片，p b s 清洗2 遍，用4 多 聚甲醛固定1 5 3 0 m i n ，自然晾干待用。 2 6 细胞免疫组化 ( 1 ) 将细胞爬片用中性树胶把无细胞面和载玻片固定 ( 2 ) 每张玻片置于3 的过氧化氢溶液，室温下于湿盒内避光孵育1 5 分 钟，清除内源性过氧化物酶活性。p b s 冲洗3 次，每次3 分钟 ( 3 ) 滴加一抗( 1 ：8 0 稀释的兔抗人c r f i 也多克隆抗体) ，湿盒中孵育并 置4 冰箱中过夜。阴性对照用p b s 液代替一抗。 余步骤同组织切片免疫组化，阳性染色判定标准与组织切片相同。 2 7 细胞i m p c r 2 7 1 引物设计 根据g e n e b a n k 提供的c r f i 也的基因序列，编号为n m0 0 1 8 8 3 ，1 6 9 3 b p ，利用从g e n e b a i l k 中寻找的c i 玎r 2 基因的m r n a 序列，参照引物设 计原则，利用p r i m e r 3 o 设计。c r f r 2 引物序列：上游5 a a c t a c c t g g g c c a c t g c g t a 3 ，下游5 7 a g g t t c c a g t g a a t c a c a l 汀c 3 ，扩增片段长度为l2 0 b p 。内参照为 b a c t i n ，引物序列为：上游5 a c g a g g c c c a g a g c a a g a g a 3 ，下 游5 a g g t g t g g t g c c a g a t t t t c 3 ，扩增片段长度也为1 2 0 b p 。 2 7 2 z o l 法抽提细胞总r n a 1 ) 当培养细胞铺满瓶底8 0 时，弃去培养液，取5 1 0 m l 冷p b s 液洗 涤细胞2 次，控干。 2 ) 每1 0c i i l 2 生长的培养细胞中加入1 m l 嘶z o l ，室温下水平静置3 5 分 钟，使裂解液均匀分布于细胞表面，加样器反复吹打，细胞完全脱 落。 3 ) 将裂解液转移至1 5 1 l 离心管中，并用1m l 移液枪头反复吹打，室 研究论文 温下静置3 5 分钟。使得核酸蛋白复合物完全分离。 4 1 加入氯仿2 0 0 u l ( 每使用l m l 嘶z o l 加入o 2 l m l 的氯仿) ，盖紧盖， 上下震荡1 5 秒钟，致无分层现象，室温静置3 分钟。 5 ) 1 2 0 0 0 9