美国FDA关于合成多肽的指导原则.pdf

讲 座 美国FDA关于合成多肽的指导原则 黄晓龙 (国家药品监督管理局药品审评中心,北京100050) 关键词 药物合成;多肽;指导原则 中图分类号 R927 文献标识码 C 文章编号 1003 - 3734(2001)08 - 0626 - 03 自从20世纪70年代早期,随着多肽的固相合 成及HPLC纯化、 分析技术的发展,多肽作为一个 潜在的新药,越来越引起人们的兴趣。近年来核磁 共振光谱(NMR)、 质谱(MS)及合成方法等方面的 发展,使得研究者创制与天然多肽在药理作用上有 所改变的新化合物成为可能。这些结构修饰后的多 肽可以增加与受体的亲和力、 增加对受体的选择性、 变为拮抗剂、 增加对酶降解的抵抗力或改进药代动 力学特性。由于以上改进,很多多肽衍生物有可能 成为有疗效的药物。 本指导原则仅适用于化学合成的多肽,着力于 解决这些化合物所涉及的独特问题。因为合成多肽 的制剂与 “制剂的生产与控制指导原则” 中所涵盖的 问题大体一致,所以在此对多肽的制剂不予讨论。 作为免疫原使用的多抗原多肽(MAPs)应遵照其他 的指导原则。对于此类产品,研制者可与生物制品 审评及研究中心(CBER)联系。 根据美国药品、 食品及化妆品的有关法令,有关 原料药的合成方法、 鉴别、 质量及纯度的控制方法等 资料均应报送。而诸如效价、 免疫原性或抗原活性 等生物特性资料也必须报送。这些资料涉及到新药 的临床申请(IND)、 新药申请(NDA)、 简化新药申请 (ANDA)、 产品许可申请( PLA)、 药品管理文件 (DMF)、 生物制品管理文件(BMF)。 对于原料药在化学、 生产及控制方面的一般信 息,可参考 “原料药生产申请的指导原则” 。本原则 仅适用于液相或固相合成的多肽。报送资料的范围 及深度取决于申请的种类。 1 概述与定性 1. 1 概述 合成多肽的概述应包括以下内容:化学 结构式、 氨基酸序列、 等电点 (pI 值)、 溶解性、 相对 分子质量及成盐形式(如醋酸盐或三氟醋酸盐)。任 何修饰,如酯化或酰胺化,都应说明。 1.2 定性/结构确证 合成多肽的定性至少应包 括:氨基酸分析、 质谱及序列分析。纯肽的氨基酸分 析可提供该多肽的组成是否正确。基于多种技术的 质谱,如快原子轰击、 电喷雾、 场解吸、 激光解吸,经 常用于提供相对分子质量及序列信息。这些数据可 以为多肽的结构和有无合成杂质提供证据。 Edman降解能用于测定多肽的序列。如果N 端被保护,则在Edman降解前,应用适当的方法将 N端去掉。如果C端的改变,如酰胺化,是由合成 树脂的修饰引起的,则在多肽定性时,对此可不要 求。如果多肽含有20个以上的氨基酸残基,就应提 供肽图。各片段应分离出来并用质谱或序列分析进 行定性研究。 当在合成中使用了非天然氨基酸(即通常所接 受的20个天然氨基酸以外的氨基酸)时,则应提供 这些氨基酸(用于氨基酸分析)及其衍生物(用于序 列分析)的色谱行为,以证明这些氨基酸存在于合成 多肽中。 如果多肽中存在二硫键,应与适当的还原剂,如 二硫苏糖醇反应,所生成的游离巯基可用适当试剂 (如Ellmans试剂)来检测。如果多肽中存在2个或 更多的二硫键,还应确定这些二硫键的正确连接点。 多肽的化学结构可用氢核磁共振及碳核磁共振 谱进一步证实。其他用于该原料药的定性方法均应 详细说明(例如圆二色谱及荧光光谱)。 对于送交CBER的体外诊断试剂盒,应证明多 肽的侧链上已无保护基,或确证该保护基的存在。 更重要的是还应证明多个抗原决定簇的存在。 2 合成 2. 1 起始原料 2. 1. 1 氨基酸及其衍生物 如氨基酸及其衍生物 是外购的,则应提供卖主的姓名及地址。该卖主应 能证明其产品质量的一致性,并提供产品质量的测 试结果,包括比旋度、 熔点、 化学及光学纯度、TLC 或HPLC色谱行为。如果卖主提供了上述质检报 626 Chinese Journal of New Drugs 2001 ,Vol. 10 No. 8中国新药杂志2001年第10卷第8期 告,则买主只需做一鉴别试验即可,否则买主应做整 套测试。 如果氨基酸及其衍生物不常见,或是采用新方 法合成的,则应详细说明其合成与结构确证的过程。 其结构应用核磁共振、 红外、 质谱及比旋度来定性, 并用TLC和/或HPLC检测其纯度。 2. 1. 2 多肽合成树脂 如果多肽的合成是采用固 相合成法,则应对树脂进行简单介绍并说明选择的 理由。具体内容应包括: 对树脂的化学描述(例 如是羟甲基聚苯乙烯共聚物或聚酰胺)。 所做的 任何常规功能化处理(如苯乙酰胺或二苯甲胺衍生 物)。 摩尔取代系数。 树脂在不同溶剂中的 膨胀系数。 特定条件下(例如将多肽从树脂上水 解)的不稳定性。 2. 1. 3 化学试剂与溶剂 与原料药指导原则的定 义一致。 2. 2 合成流程图 2.2. 1 液相合成 应提供片段缩合的流程图。给 出每步反应所用的溶剂、 催化剂与试剂,并随图简述 合成的策略。 2. 2. 2 固相合成 固相合成的流程图应包括最初 的缩合、 常规的合成循环,包括去掉N端保护基、 洗 涤、 中和(如使用了特丁氧酰基 (t 2 Boc) 氨基酸)、 洗 涤、 缩合和洗涤、 从树脂上最后切除该多肽。常规的 合成循环以外的合成步骤应详述。 2. 3 合成的详细说明 2. 3. 1 液相合成 因为在多肽的合成中会用到不 同的缩合方法与脱保护技术,所以应详细说明合成 中的每一步操作。进程控制点(见后 “进程控制” 处) 应特别说明。申报者可参照原料药指导原则。 当片段的缩合是合成策略的一部分时,各片段 的分离及纯化就很重要,应提供其纯化过程。当通 过重结晶从液相合成溶液中分离出来最终的全保护 多肽时,应提供该重结晶的详细过程。母液的处置 也应说明。 2. 3. 2 固相合成 如使用了商业来源的合成仪,申 报者应提供其型号、 生产者的企业名称与地址。常 规设计或改造后的合成仪应予详细说明并加以确 证。对于最初的缩合,应提供连接的第1个氨基酸 与树脂的用量。对每一个合成循环应提供如下的资 料: 用于脱保护、 洗涤、 中和的溶液的体积与组 成。 全保护氨基酸衍生物与缩合剂的用量。 洗涤、 脱保护、 中和、 缩合与保护所需的时间。 反 复缩合各氨基酸所需的环境也应标明。进程控制点 (见后 “进程控制” 处)应特别说明。关于脱保护与从 树脂上切除多肽,申报者应提供所用裂解反应的详 细资料。例如,氟化氢常用来裂解t2Boc多肽,而三 氟醋酸用来裂解Fmoc多肽。另外,在裂解/脱保护 中使用的清除剂的用量也应列出。应详细说明从树 脂中分离多肽的过程。 2. 3. 3 多肽的修饰 合成有活性的原料药经常需 要对多肽链进行结构修饰。例如氧化、 还原、N2乙 酰化、 酰胺化、 肉豆蔻酰化及环合。应提供这些修饰 的详细过程。特别是当氧化形成二硫键连接时,更 应如此。 2. 4 多肽的纯化 2. 4. 1 纯化策略 应研究合适的纯化方法以将所 需的多肽从杂质中分离出来。这些杂质可包括: 非对映异构的(外消旋)多肽。 缺失(不完全)肽。 断裂肽。 反应副产物。 去酰胺多肽。 氨基酸侧链的不完全脱保护所形成的副产物。 氧化肽。 二硫键交换的产物。 低聚物和/或 聚合物。 合成中所用的毒性试剂和溶剂。 选择纯化路线时应综合考虑多肽与杂质的大 小、 极性和离子性。 2. 4. 2 纯化过程的描述 应详细说明粗品多肽的 纯化过程。当使用层析法时,应说明所采用的条件, 如上样量、 流动相、 柱填料种类及粒度、 柱子直径、 梯 度程序、 检测波长、 流速和柱温。应明确收集组分的 选择标准,并说明其他组分的处理方式。为反映纯 化的效果,应提供经一次纯化后的样品的代表性色 谱图。如果多肽是以盐的形式分离出来,应明确在 最后一步纯化时所用的反离子。 2. 4. 3 干燥 为保持终产品的结构与活性,需对其 进行干燥处理。大多数多肽是采用冻干法,但如果 多肽不受影响,也可采用室温或高温干燥。应说明 具体的条件(温度、 压力、 升温速度及每一操作所需 的时间)。如果在冻干前将大量的原料药溶液分装 到单独的容器(如玻璃管形瓶)中,应明确容器及盖 的大小与质量标准。 3 进程控制 3.1 反应终点 液相合成:反应终点可用TLC 法监测。 固相合成:偶合反应的终点可用茚三酮 试验来监测。 二硫键连接:二硫化连接的终点可 用Ellman试验和HPLC法监测。也可用其他合适 的方法。 3. 2 中间体标准与检测 用于缩合反应的片段需 要分离出来。一旦分离出来,就应对其进行检定。 726 Chinese Journal of New Drugs 2001 ,Vol. 10 No. 8中国新药杂志2001年第10卷第8期 应对每一片段进行足够的结构分析测试。这些分析 可包括氨基酸分析、 序列分析、 质谱、 比旋度、 熔点 等。对每一合成循环,应用TLC和/或HPLC监测 每个片段的正确与否及纯度。 3. 3 柱层析 应详细说明纯化后柱再生能力的确证 过程。应设立决定该柱使用期限及使用效能的标准。 3. 4 溶剂与试剂的去除 对于在多肽的合成及纯 化过程中使用的溶剂与试剂,其除去过程的确证也 应说明。 4 标准品 应设立与原料药的合成方法一致的初始标 准品,并简述其制备方法。如果其合成方法有改变 和/或增加了额外的纯化步骤,应提供相应的详细资 料。诸如氨基酸序列分析等的标准品的定性研究资 料可不必包含在 “批放行标准”(lot release specifica2 tions)中。 应提供质检报告的复印件。应包括以 下测试:外观性状、 比旋度、 氨基酸分析、 多肽含量、 反离子的含量、 水分、 多肽纯度、 有机溶剂残留量、 质 谱分析、 多肽序列、 氟化物残留量(如使用氟化氢从 树脂上裂解多肽)。肽图和生物活性分析也应提供。 在适当的时候,应用体内或体外的试验检查标准 品的生物和/或免疫活性。对于拮抗剂,可用合适的 抑制试验和对照品测试其生物效价。 应描述固 体合成多肽的外观性状,并详述其溶解性及pI值。 应测试其比旋度。如使用旋光仪,则应说明溶液 的浓度与光程长度。 氨基酸分析应提供氨基酸 的组成与数量。该结果应与理论值一致,如有出入 应加以解释。 多肽中的反离子,如三氟醋酸或醋 酸根的数量可用HPLC法测定。 在对多肽进行 定量时,若以干燥品计,则必须测定水分的含量,可 用卡氏法测定。详细信息可参考 “干燥的生物制品 中的水分残留量测定指导原则” 。 包括反相、 离 子交换和疏水性相互作用在内的HPLC技术可用 于检测多肽的纯度。毛细管区域电泳(CZE)也可用 于此目的。在非解离条件下的排阻色谱和聚丙烯酰 胺凝胶电泳(PAGE)可用于聚合物和低聚物的定性 分析。 多肽的合成中所用的有机溶剂与试剂,应 对其残留量进行定性与定量分析。如从树脂上裂解 多肽时使用氟化氢者,还应检查氟化物的残留。? 可用包括Edman降解或质谱在内的合适方法来测 定氨基酸的序列。如多肽主链经修饰后不宜用Ed2 man降解来测序,则可使用其他方法。? 多肽的所 有相关结构都应加以确定。这些相关结构包括相对 分子质量、 双硫键、 多肽环合以及多肽的主链、 侧链 与末端基团的任何改变。? 应确证多肽合成中所用 的任何非天然氨基酸的结构。质谱即为待选方法之 一。? 如果合成中使用了D2构型的氨基酸,那么应 用合适的方法来证明多肽中该氨基酸的原始构型是 否保持不变。? 如果多肽含有20个以上的氨基酸 残基,则应提供包括每一个多肽片段的结构特性在 内的肽图。? 如使用了工作标准品,则应对其进行 简单的定性研究。 5 标准与分析方法 应提供常规的质量标准与测试。如前所述,标 准品与 “批放行标准” 可免去某些用于初始标准品的 测试项目,但剩余的测试应能保证多肽的性质、 纯 度、 强度和/或效价以及批与批间的质量一致性。详 见原料药指导原则。 应设立试剂与有机溶剂的残留量标准。详见原 料药指导原则。 分析系统的验证应能证明该系统确能分离所需 的多肽与合成(如不完全肽)、 纯化(柱浸出物、 溶 剂)、 降解(如双硫键交换或氧化)或聚合所产生的副 产物。多肽的纯度及杂质限度将取决于产品本身及 其用途,应视具体情况而定,不能一概而论。 6 包装 根据原料药指导原则,如果包装附有涂层(如硅 烷化 ) , 则应说明其涂布过程。对于体外诊断试剂, 如果多肽是直接连接在内包装上,则应提供该连接 的数量及连接后与抗体的反应活性。 7 稳定性 “人用药品及生物制品稳定性指导原则” 为原料 药的稳定性研究提供了普遍性的指导,其中的一些 概念适用于合成多肽。一般来说,合成多肽的冻干 粉末在遮光、 干燥、- 20 下保存是相对稳定的。当 多肽在溶液中或高湿下保存时,其降解或聚合的速 度比干燥条件下大为增加。例如,蛋氨酸、 色氨酸和 半胱氨酸会氧化,天冬酰胺和谷氨酰胺会去酰胺化, 多肽的