（分析化学专业论文）dna生物传感器用于基因点突变识别及新型传感界面的构建.pdf

硕士学位论文 摘要 核酸碱基的突变与人类许多遗传疾病有关，它在癌症的发生中也起着不可忽 视的作用，基因突变的检测是癌症早期诊断的重要手段。所以探索新的、灵敏度 高的检测单核苷酸突变的方法是相关领域专家共同关注的热点问题。本研究论文 在电化学d n a 传感器用于基因点突变识别以及利用点击化学进行传感界面的构 建两个方面做了一些新方法的研究。具体内容分别如下： 在第2 章中，基于等位基因特异性延伸法，结合酶催化银沉积放大体系，提 出了用于单碱基突变的电化学检测方法。首先，在金电极表面固定与野生型目标 链完全互补的等位特异性捕获探针，在聚合酶的作用下发生延伸反应；而突变型 目标链由于3 端与捕获探针发生错配，延伸反应不能进行。解链处理后，目标链 从电极表面脱落。随后滴加与探针延伸部分相互补的生物素化的检测探针，再引 入链亲和素化的碱性磷酸酶，继而发生酶催化沉积银的反应。通过线性扫描伏安 法定量检测。该方法成功用于p 地中海贫血基因2 8 位密码子单碱基突变的区分， 简单、快速、灵敏度高，线性范围为3 0 1 0 - 1 6 3 0 l o m ，检测下限为1 o 1 0 d 6m 。 在第3 章中，基于连接酶的高保真性和生物催化沉积反应，提出了用于高特 异性识别单碱基突变的压电检测方法。实验中，目标d n a 链先与通过纳米金修饰 在q c m 上的d n a 捕获探针杂交，再与生物素化的d n a 检测探针杂交。加入连 接酶后，再经过高温解链，只有与目标链完全匹配的检测探针保留在电极表面。 生物素化的检测探针继而与链酶亲和素化的辣根过氧化物( s a h r p ) 结合，辣根 过氧化物催化过氧化氢氧化4 氯1 萘酚在电极表面生成不溶性沉淀物，使压电频 率响应显著增大。用该方法同样对d 地中海贫血基因2 8 位密码子的突变情况进行 了检测，线性范围为0 1 1 0 0n m ，检测下限为0 1n m 。 在第4 章中，发展了一种基于铜催化点击化学反应构建的新型传感界面用于 核酸分子的固定方法，同时以铜离子为分析模型，采用亚甲基蓝为电化学指示剂， 进行电化学检测分析。首先在金电极表面固定含有叠氮基团的捕获探针，然后与 标记有亚甲基蓝的炔基发夹形检测探针发生点击化学反应，该方法利用一价铜离 子的催化效应进行电化学定量检测。此外，在这种稳定性较好的传感界面中，固 定于电极表面的核酸分子信标也可作为一种捕获探针与单链d n a 分子互补杂交， 用于特定基因的分析检测。 关键词：电化学检测；压电检测；d n a 传感器；单核苷酸多态性；等位特异性 延伸；核酸连接酶；点击化学；铜离子 i i a b s t r a c t p o i n tm u t a t i o ni ng e n o m i cd n ah a sad i r e c tl i n kw i t hh u m a nd i s c a s e ，g e n e t i c m u t a t i o na n a l y s i sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ne a r l yc l i n i c a ld i a g n o s i so fc a n c e r i ti sa h o tt o p i cf o re x p e r t st od e v e l o pn o v e la n dh i g hs e n s i t i v em e t h o d si nd e t e c t i o no f s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s a i m i n g a tt h e p r o b l e m si n c l u d i n gg e n em u t a t i o n i d e n t i f i c a t i o na n df a b r i c a t i o no f s e n s i n gi n t e r f a c e st h a tu s i n gc l i c kc h e m i s t r y ，s e v e r a l n o v e lm e t h o d sh a v eb e e nd e v e l o p e df o re l e c t r o c h e m i c a l ，p i e z o e l e c t r i cd n a b i o s e n s o r s t h ed e t a i l e dc o n t e n t sa r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ( 1 ) i nc h a p t e r2 ，an o v e le l e c t r o c h e m i c a lm e t h o df o rs n pd e t e c t i o ni sp r o p o s e d b a s e do na l l e l e - s p e c i f i ce x t e n s i o na n de n z y m a t i c i n d u c e ds i l v e rd e p o s i t i o n b r i e f l y , a l l e l e - s p e c i f i cc a p t u r ep r o b ew a sf i r s t l yi m m o b i l i z e do nt h eg o l de l e c t r o d e ；s u c ha p r o b ec a np e r f e c t l ym a t c hw i t hw i l dg e n ea n dc a nb ee x t e n d e d ，w h e r e a sm u t a n tg e n e s w h i c hm i s m a t c hw i t ht h ep r o b ea t3 t e r m i n a lb a s e sc a n n o tb ee x t e n d e d a f t e rt h e f o r m e dd u p l e x e su n f o l d e d ，t h et a r g e ts e q u e n c e sd i s s o c i a t ef r o mt h ee l e c t r o d es u r f a c e b e c a u s et h ee x t e n d e ds e q u e n c ep e r f e c t l ym a t c h e sw i t hb i o t i n m o d i f i e dd e t e c t i o np r o b e ， h y b r i d i z a t i o nt a k e sp l a c e ，a n dt h e ns t r e p t a v i d i n - c o n ju g a t e da l k a l i n ep h o s p h a t a s ec a l l b ec a p t u r e dt ot h ee l e c t r o d es u r f a c ed u et ot h es p e c i f i ci n t e r a c t i o n o fb i o t i na n d s t r e p t a v i d i n t h ee n z y m e - i n d u c e ds i l v e rd e p o s i t i o ni su s e dt oa m p l i f yt h er e s p o n s e t h ee l e c t r o c h e m i c a ls i g n a li so b t a i n e db yu s i n gl i n e a rs w e e pv o l t a m m e t r y t h ep r e s e n t a p p r o a c hh a sb e e nd e m o n s t r a t e dw i t ht h ei d e n t i f i c a t i o no fs i n g l e b a s em u t a t i o ni n 2 8 s i t e ( at og ) f o ri - t h a l a s s e m i ag e n ea n dt h ew i l dt y p et a r g e tc a nb ed e t e r m i n e di nt h e r a n g ef r o mw i t h3 0 x 1 0 - 1 6 3 0 x 1 0 一mw i t hal o wd e t e c t i o nl i m i to f1 0 x 1 0 - 1 6m ( 2 ) i nc h a p t e r3 ，an o v e lb i o s e n s i n gt e c h n i q u ef o rh i g h l ys p e c i f i ci d e n t i f i c a t i o no f g e n ew i t hs i n g l eb a s em u t a t i o ni sp r o p o s e db a s e do nt h ei m p l e m e n t a t i o no ft h ed n a l i g a s er e a c t i o na n dt h eb i o c a t a l y z e dd e p o s i t i o no fa ni n s o l u b l ep r o d u c tt r a n s d u c e db y q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( q c m ) m e a s u r e m e n t s i nt h i sm e t h o d ，t h ed n at a r g e t h y b r i d i z e sw i t hac a p t u r ed n ap r o b e ，w h i c ht e t h e r e do n t ot h eq c m u t i l i z i n gg o l d n a n o p a r t i c l e sm o d i f i c a t i o na n dt h e nw i t hab i o t i n y l a t e da l l e l e s p e c i f i cd e t e c t i o nd n a a f t e rt h e r m a lt r e a t m e n ta ta l le l e v a t e dt e m p e r a t u r e ，t h ef o r m e dd u p l e xm e l t sa p a r tt h a t m e r e l ya l l o w st h ed e t e c t i o np r o b ep e r f e c t l ym a t c h e dw i t ht h et a r g e tt or e m a i n0 nt h e e l e c t r o d es u r f a c e t h e p r e s e n c eo ft h eb i o t i n y l a t e da l l e l e m a t c h e dp r o b ei st h e n d e t e c t e db yt h eq c mv i at h eb i n d i n gt os t r e p t a v i d i n p e r o x i d eh o r s e r a d i s h ( s a h r p ) 1 i l 硕 ：学位论文 w h i c hc a t a l y z e st h eo x i d a t i v ep r e c i p i t a t i o no f4 - c h l o r o 1 - n a p h t h o lb yh 2 0 2o nt h e e l e c t r o d ea n dp r o v i d e sa na m p l i f i e df r e q u e n c yr e s p o n s e t h ep r o p o s e da p p r o a c hh a s b e e ns u c c e s s f u l l yi m p l e m e n t e df o rt h ei d e n t i f i c a t i o no fs i n g l eb a s em u t a t i o ni n 一2 8s i t e o ft h ei - t h a l a s s e m i ag e n e t h et a r g e tg e n ec a nb ed e t e r m i n e di nt h er a n g ef r o m0 1n m t o1 0 0n mw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 1n m ( 3 ) i nc h a p t e r4 ，w eh a v ed e v e l o p e dan o v e ls e n s i n g i n t e r f a c e f o r t h e i m m o b i l i z a t i o no fn u c l e i ca c i dm o l e c u l e sb a s e do nt h e c o p p e r - c a t a l y z e d c l i c k c h e m i s t r y m e a n w h i l e ，ae l e c t r o c h e m i c a lm e t h o df o ri n d i r e c t l yd e t e c t i n gm e t a li o n s w a sp r o p o s e dv i at a k i n gc o p p e ri o na sam o d e la n a l y t e ，c h o o s i n gm e t h y l e n eb l u ea s e l e c t r o c h e m i c a li n d i c a t o r f i r s t l y ，t h ea z i d oc a p t u r ep r o b ew a si m m o b i l i z e do nt h eg o l d e l e c t r o d es u r f a c e ，t h e nt h em e t h y l e n eb l u el a b e l e da l k y n y lh a i r p i np r o b ew a sa d d e dt o i n i t i a t ec l i c kr e a c t i o n t h i sm e t h o du t i l i z e st h e c a t a l y t i ca c t i v i t yo fc u ( i ) f o r e l e c t r o c h e m i c a l q u a n t i t a t i v e d e t e c t i o n i n a d d i t i o n ，t h eh a i r p i nm o l e c u l a rb e a c o n i m m o b i l i z e do nt h eg o l de l e c t r o d es u r f a c ec a na l s oa c ta sac a p t u r ep r o b et oh y b r i d i z e w i t hs i n g l e s t r a n dd n a ，a n di tc a nb eu s e df o rt h es p e c i f i cg e n ea n a l y s i s k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ；p i e z o e l e c t r i cd e t e c t i o n ；d n as e n s o r ；s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) ；a l l e l e s p e c i f i ce x t e n s i o n ；d n a l i g a s e ；c l i c kc h e m i s t r y ；c o p p e ri o n s w 硕仁学位论文 第1 章绪言 生物传感器技术是在生命科学和信息科学之间发展起来的一门交叉学科。生 物传感器由于具有较高的选择性和灵敏度，得到广大分析工作者的关注，已发展 成为现代生物技术的重要领域之一。它利用生物化学和化学反应原理，将生化反 应信号转换为电信号或光信号，通过对信号进行放大和模数转换，测量出被测物 质及其浓度。根据所用敏感材料的不同，生物传感器可以分为酶传感器，免疫传 感器，核酸传感器，细胞传感器等。d n a 生物传感器是基于核酸分子杂交和 w a t s o n c r i c k 碱基配对原理而发展起来的一种用于核酸序列识别检测的新技术。与 其他检测方法如凝胶电泳检测相比，它的出现大大缩短了目标物的检测时间，而 且无污染、操作简单化，既可定性，又可定量，为d n a 序列检测和单碱基突变的 识别提供了新型高效的检测手段，并在基因检测诊断【1 。5 1 、环境监测【6 1 们、药物机 理分析【1 1 1 3 】及d n a 损伤研究【1 4 舶】等方面发挥了重要作用。“点击化学 是诺贝尔 化学奖获得者s h a r p l e s s 教授【1 。7 】所提出的一套以含杂原子链接单元c x _ c 为基础 的组合化学新方法，用少量简单可靠和高选择性的化学转变来获得更广泛的分子 多样性，开创了快速、高效、几乎定量地合成新化合物的实用方法。因其反应基 团具有良好的稳定性，反应条件温和，反应产物单一等优点，可将此方法引入到 生物传感技术中，用于构建传感界面的自组装膜【l8 】等方面，从而使得生物传感器 获得更为广泛的应用价值。 1 1s n p 识别的d n a 生物传感器 1 1 1 单核苷酸多态性的概念及检测意义 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) ，主要是指在基因组 水平上由单个核苷酸的变异所引起的d n a 序列多态性。这种变异可由单个碱基的 转换( t r a n s i t i o n ) 或颠换( t r a n s v e r s i o n ) 所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。 s n p 是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的9 0 以上【1 9 , 2 0 j 。在 人类基因组中，大约每1 0 0 0 个碱基就有一个碱基可能发生突变。如果这种突变发 生在遗传基因的编码区，就有可能会引起它所编码的蛋白质结构或功能的改变， 从而引起基因疾病的发生 2 1 , 2 2 1 。人类的许多疾病，像p 地中海贫血以及许多肿瘤， 都是由于基因的d n a 序列上发生了单碱基突变所致【2 3 , 2 4 】。单碱基突变可以作为遗 传标志物，用于对部分疾病的早期医学诊断【2 5 1 。因此，对与遗传疾病高度相关的 单碱基突变的识别检测，在分子生物学、遗传学、疾病的发病机理研究及早期诊 d n a 生物传感器用于基冈点突变识别及新型传感界面的构建 断与治疗等方面都具有非常重要的意义。 1 1 2d n a 生物传感器的原理及分类 d n a 生物传感器是以d n a 为敏感元件，将d n a 与d n a 、r n a 、药物、化合物、 自由基等相互作用的生物学信号转变成可检测的光、电、声波等信号的物理装置。 d n a 生物传感器的基本组成包括一个d n a 分子识别器和一个换能器。d n a 分子识 别器一般是利用被固定的单链d n a 作为探针，其碱基序列与被测d n a 片段的碱基 序列互补，通过杂交反应，与被测d n a 结合双链d n a 。换能器的功能是将d n a 杂 交信息转换为可测定信号，且对固定化的单链d n a 和双链d n a 具有选择性响应。 d n a 生物传感器不仅能测定d n a 的浓度，还能识别部分碱基的排列顺序。根据换 能器种类不同，可以将d n a 生物传感器大致分为电化学d n a 传感器【2 6 瑚1 、压电 d n a 传感器【2 9 1 、光学d n a 传感器【3 0 , 3 1 1 等。 ( 1 ) 电化学d n a 传感器 电化学d n a 生物传感器一般由一个固定d n a 片段( 探针) 的电极和用于检测 的电活性杂交指示剂构成【3 2 1 。通常是将s s d n a ( 探针分子) 修饰到电极表面构成 d n a 修饰电极，由于s s d n a 与其互补靶序列杂交具有高度的序列选择性，使得这 种s s d n a 修饰电极呈现极强的分子识别功能。在适当的温度、p h 、离子强度下， 电极表面的d n a 探针分子能与靶序列选择性地杂交，形成双链d n a ( d s d n a ) ， 从而导致电极表面性质的改变，这种杂交前后的性质差异，也可以通过具有电活 性的杂交指示剂来识别，从而达到分析检测的目的。d n a 的电化学检测大致可以 分为直接检测和间接检测两种。直接检测的依据在于d n a 与某些电极表面可能发 生直接的电子转移，而且d n a 的一些组分包括碱基和核糖在一定电势窗口下具有 电化学活性。间接检测是通过一些氧化还原媒介来实现电子传递，借助于这些与 d n a 选择性结合的有电化学活性的指示剂来实现杂交检测。具体的检测方式又包 括伏安法、计时电位法和电化学阻抗法等。由于电化学检测方法具有快速、灵敏、 低成本、低能耗以及易于实现微型化、自动化等优点，因此构造电化学d n a 生物 传感器越来越受到研究者们的青睐，具有很好的发展前景。 ( 2 ) 压电d n a 传感器 当各向异性的晶体受到机械作用力后，在相应的方向上就会产生不同的电荷， 进而产生电场，此现象称为压电效应。能产生压电效应的晶体就叫压电晶体。水 晶( a 石英) 就是一种具有压电特性的晶体，其振荡频率的改变量与其表面沉积 物的质量增加粼_ s a u e r b r e y t 3 3 】公式： a f = 2 。2 6 x 1 0 “if mf a 其中，凡：石英晶体的基频( m h z ) ；彳f ：石英晶体的频率改变量( h z ) ；彳肘：沉 硕l 学位论文 积在石英晶体表面的物质质量( g ) ；a ：石英晶体表面的工作面积( c m 2 ) 。石英晶体 振荡频率的改变量( 4 f ) 与其表面沉积物质量( 么m ) 线性相关。公式中的“ 表示随沉积物质量上升，晶体振荡频率下降。 压电传感器是较早被尝试用于d n a 分子杂交检测的，是一种能将目的基因的 微增量转变为可检测的电信号( 频率信号) 的装置。早在1 9 8 8 年，f a w c e t t 等【3 4 j 就报 导了压电d n a 生物传感器的初步研究结果。根据石英晶体的压电特性，先将单链 d n a 探针固定于压电晶体表面，当溶液中的互补目的d n a 链与之杂交后，会引起 晶体表面质量改变0 m ，从而导致晶振频率发生改变0 聊，可以通过测定频率的 改变量实现对目的d n a 链的定量检测【3 5 1 。该技术对金电极表面质量负载的变化非 常敏感，能灵敏的检测微观生化反应中寡核苷酸的微量变化，并将其转化为可以 定量检测的频率信号【3 6 , 3 7 】。压电d n a 传感器构造简单，成本低，易于与其他方法 联用，可提供实时控制信号，也可用于动力学研究。 ( 3 ) 光学d n a 传感器 光学d n a 生物传感器主要有光纤、光波导、表面等离子体共振( s p r ) 和其他 发光型d n a 生物传感器。光纤d n a 传感器【3 8 , 3 9 的工作原理是将杂交分子中的探针 标记物经生化反应产生的特征光学信号，通过光纤探头传递至光检测器，经光电 转换进而实现目标d n a 的测定。这种传感器选择性强，易于排除杂交过程中非特 异性吸附的干扰，测定准确，其不足之处在于选择的发光反应信号较弱，需要加 入嵌合试剂来提高灵敏度。光波导d n a 传感器【4 0 】是将目标物通过单链d n a 分子探 针固定于光波导载玻片通道内，照射光波导边缘，利用c c d 相机记录在溶液中距 波导载波片表面1 0 0 3 0 0m 形成的隐失波场中产生的散射光，以此来实现对目标 物的检测。这种传感器由于对技术要求很高，现仍然处于实验室的研究阶段，而 且相对于光纤来说，它的实用价值较小。s p r 型d n a 传感器【4 3 】应用表面等离子 体共振技术，先将单链d n a 分子固定在金属膜表面，加入与其互补的目标d n a ， 杂交反应使金属膜与溶液界面的折射率上升，导致共振角度发生改变，固定入射 光角度，就能根据共振角的改变程度对目标d n a 进行定量测定。这种传感器无需 标记，检测快速，可反复使用，但灵敏度较低，非特异吸附较大。其他发光型d n a 传感器根据发光机理不同，包括化学发光【4 4 , 4 5 】、拉曼光谱式【4 6 i d n a 传感器等。这 类传感器有较高的灵敏度，但稳定性和重现性有待提高。由于光学d n a 传感器一 般都需要昂贵的光学检测仪器和光源设备，对使用者的操作技能要求也相对较高， 因此一定程度上限制了该方法的普及与发展。 1 1 3d n a 探针的固定方法 在d n a 生物传感器中，常用的固定基质有金属、玻璃、石墨以及在这些基底 上修饰上的纳米粒子、纳米线阵列、导电聚合物薄膜等。将d n a 探针有效地固定 d n a 生物传感器用于基因点突变识别及新型传感界面的构建 在基底上，是d n a 生物传感器性能优劣的前提和关键环节。常用的固定方法主要 有吸附法、自组装膜法、共价键合法以及生物素一亲和素反应法。 吸附法是通过非共价键作用将d n a 直接或恒电位吸附固定在电极表面，可以 通过物理吸附【4 7 1 、静电吸附【4 8 1 、化学吸附1 4 9 1 、电化学富集【5 0 1 以及l a n g m u i r b l o d e g e t t ( l b ) 膜技术1 5 l j 来实现。这种固定方法操作简单，条件温和，速度快， 成本低，无需对固定的d n a 进行修饰，且电极表面易于更新。但不足之处在于这 种表面结合作用力较弱，所以杂交过程中探针可能脱附。 自组装膜法是基于分子的白组装作用，能够在基底表面组装成一层高度有序 的单分子膜的方法。由于核酸分子容易进行化学修饰，在通常情况下是在核酸分 子的一端修饰上合适的功能基团，通过这些基团将d n a 探针固定在基底上。比如 在金基底上，常用的固定方法是在核酸分子的5 端修饰上带巯基( s h ) 的化合物， 这种化合物的巯基在金基底表面形成化学键( a u s ) ，在基底上形成一层自组装膜。 由于该方法简单，探针与电极间结合力强，得到的膜性能稳定，表面结构高度有 序，并保持了探针结构的灵活性，重现性也较好，因此已成为在金电极表面固定 探针的常用方法。但中子反射研究表明【5 2 1 ，由于碱基与金之间有吸附位点，单链 d n a 会躺在金表面上，影响杂交效率。因此，常常需要再组装一层巯基层，如巯 基己醇等。它可以取代探针碱基与金之间的相互作用，封闭电极表面的空白位点， 有效的降低假阳性信号【5 3 , 5 4 】；而且，它带负电的羟基基团对同样带负电的d n a 磷 酸骨架具有排斥作用，使探针大部分通过末端连接到电极表面，并以一定角度直 立在电极表面，从而提高了杂交效率。 共价键合法是通过化学试剂将核酸分子以共价键形式固定在电极表面的一种 固定方法。通常分两步进行。第一步是对电极表面进行活化，如电沉积一层纳米 金膜，或是在表面自组装一单分子层，从而引入活性键合基团( 如羟基、氨基等) ， 以便与d n a 探针结合；第二步是通过双官能试剂或偶联活化剂实现与d n a 探针 的联结。常用活化试剂有氨丙基三乙氧基硅烷( a p t e s ) 、环氧丙基三甲基硅烷 ( g o p s ) 等。常用双功能试剂有戊二醛( g a ) 、对硝基苯氯甲酸酯( n p c ) 、二溴乙 烯等。共价键合法得到的修饰层稳定，核酸分子结构变化具有灵活性，有利于进 行分子杂交。但由于电极表面活性位点有限，表面合成又是异相反应，因而固定 的d n a 探针量不高，响应信号较小。 生物素一亲和素反应法是利用两者之间的亲和作用来固定探针的一种方法。 生物素( 又称为辅酶r 或维生素h ) 是具有一硫酚( t h i o p h e n e ) 结构环的化学物质，是 生物体内广泛存在的各种羧基化酶的辅酶，一端的羧基可以与抗体、酶、d n a 、 蛋白质等通过共价键相连。亲和素又称抗生物素蛋白，它由四个分别能与生物素 结合的亚基组成。亲和素与生物素之间有极强的亲和力，亲和常数是抗原抗体反 应的1 0 1 0 6 倍，是生物大分子与生物小分子非共价结合中最强的一种【55 1 ，且具有 硕十学位论文 高度特异性和稳定性。生物素活化后，可以很容易地用于生物大分子如抗体、核 酸等的标记，接着可以通过固定化的亲和素将生物大分子固定在基底表面。通常 这种方法简便，条件温和，高效，特异性好，且不会干扰固定后的生物分子的活 性。链霉亲和素( s t r e p t a v i d i n ) 的特性非常类似于亲和素，由于其等电点接近中性， 且不带任何糖基，与亲和素相比，非特异性吸附更小，因此往往取代亲和素用于 生物素亲和素系统中。 1 1 4s n p 识别的电化学及压电检测方法 1 1 4 1 电化学检测方法 ( 1 ) 使用电化学活性杂交指示剂的无标记检测 电活性杂交指示剂能通过不同的方式与单链d n a 和双链d n a 发生相互作用。 根据结合方式和结合能力的差异，通过测定其氧化还原峰电流和峰电位可以识别 和测定d n a 分子。指示剂与d n a 的结合方式主要有静电力结合、亲水力疏水力结 合、插入到堆积的碱基中或以特殊的化学结构嵌入到双螺旋的沟槽中。在选择插 入式信号指示剂时，通常要求指示剂与双链的结合能力要远远大于与单链的结合 能力，这样才能获得高的检测灵敏度。此外，还要求它在电极表面上非特异性吸 附小。目前，常用的杂交指示剂包括葸环类的抗生素( 如道诺霉素、阿霉素等) 5 6 , 5 7 】、 染料( 如亚甲基蓝、麦尔多拉蓝、溴化乙啶等) 1 5 8 - 6 0 、金属配合物( 如c o ( b p y ) 3 3 + ， h o e c h s t3 3 2 5 8 ，r u ( b p y ) 3 3 + 等) 1 6 1 - 6 3 1 及二茂铁衍生物等。b a r t o n 等1 6 4 1 以d n a 长程电 荷传递效率【6 5 】为信号，发展了一种电化学检测方法，可以识别碱基错配。他们用 巯基修饰的双链d n a 自组装成生物识别界面，当双链完全匹配时，电活性嵌入试 剂如道诺霉素将产生高分辨的电化学信号，然而当d n a 双链中存在单碱基错配时 电化学响应显著降低。j i n 等【6 6 】通过将一端巯基化的信标探针自组装在金电极表 面，用亚甲基蓝作为杂交指示剂实现了目标序列的检测，并能区分完全互补序列 和单碱基突变序列。 ( 2 ) 标记带有电化学活性的物质 首先将具有电化学活性的物质标记在核酸探针上，通过其与电极表面的目标 d n a 选择性地进行杂交反应，在电极表面形成带有电活性官能团的杂交分子，测 定其电信号就可以识别和测定目标d n a 。二茂铁和亚甲基蓝是常用的电活性标记 物。f a n 等【6 7 】首次将信标探针引入到电化学传感体系，设计了一端修饰巯基、另一 端标记有一个二茂铁分子的发夹结构的探针，构建了一种信号减小型电化学d n a 传感器。先将其自组装到金电极表面，在未发生杂交反应时，探针处于茎环构型， 末端连接的二茂铁分子靠近电极表面；当溶液中含有靶序列时，由于杂交反应的 发生使茎环结构打开，形成双链，其刚性结构使末端连接的二茂铁分子远离电极 表面。这种距离的改变导致电子传递效率发生变化，通过检测二茂铁分子氧化还 d n a 生物传感器用于基因点突变识别及新型传感界面的构建 原电流的变化可以方便而快速地指示杂交反应的发生。这种方法简单、直接，无 需外加指示试剂。但由于这种信号减小型的信号产生会受到一定的限制，为获得 正向增大的电流信号，g r i n s t a f f 等【6 3 】同样基于这种探针的构象变化用巯基化的捕获 探针和二茂铁标记的信标探针通过聚乙二醇连接，发展了一种信号增大型电化学 d n a 传感器。k u m a m o t o 等【6 9 】报道了一种葸醌标记的核酸探针用于单碱基突变的分 析。我们小组的吴再生等【_ 7 0 】结合连接酶与反向分子信标联用，用5 端标有磷酰基， 3 端标记二茂铁的核酸作为检测探针用于d n a 杂交检测和点突变识别。 ( 3 ) 标记氧化还原酶 该方法通常是将酶直接标记在单链d n a 上，或利用生物素亲和素之间亲和作 用，先将生物素连接在单链d n a 上，再与亲和素化或链酶亲和素化的酶结合。连 接有酶的d n a 链与电极表面的互补链发生杂交反应后，由于酶较强的催化功能， 可以通过测定反应生成物的变化量间接测定目标d n a 。由于该方法能够将杂交反 应转换成大量可检测的信号，因此是当前检测方法中较为灵敏的一种。辣根过氧 化物酶( h r p ) 7 1 】、碱性磷酸酯酶( a l p ) 7 2 】以及葡萄糖氧化酶( g o x ) 7 3 】由于具有较 好的稳定性，价格便宜，且具有较高的转化率，是目前常使用的标记酶。h w a n g 7 4 1 等人发展了一种利用碱性磷酸酯酶催化对氨基磷酸苯酯水解为对氨基苯酚，再将 银离子还原为银单质沉积在电极表面的生物金属化反应，采用阳极溶出伏安法可 以测出电极表面还原的银的量，实现了对目标d n a 的高灵敏度检测，检测限达1 0 z m 。本研究小组结合这种生物金属化反应，并基于连接酶的特异性连接反应机理， 构建了一种灵敏度高、特异性好的电化学方法用于s n p 的识别检测【7 5 】。 ( 4 ) 标记纳米粒子 纳米粒子一般是指颗粒尺寸在l 1 0 0n i n 范围内的超微粒子。当物质的尺寸 减小到纳米范围时就会表现出量子效应、表面效应、宏观量子隧道效应等特性。 近年来，包括金纳米粒子、碳纳米管、量子点以及其他一些功能化纳米粒子常用 于d n a 传感器的探针标记。其中，金纳米粒子应用最为广泛，其制备简便而且可 控，长期分散性好、稳定性好，并具有良好的生物相容性。不但能用于探针标记 实现信号的传导和放大【7 锚0 1 ，还能用于s n p 分型【8 1 , 8 2 】，在一些综述类文献【8 3 】中都 有详细介绍。 1 1 4 2 压电检测方法 为提高压电检测的响应性能，除构造理想的界面、改善探针固定方法外，选 用合适的方法进行信号的放大是关键的一步。采用夹心结构，在核酸检测探针上 进行酶、纳米粒子等的标记，是较为常见的一种。w i l l n e r 等【8 4 j 将脂质体共价标记 在核酸探针上或通过生物素亲和素反应，将亲和素化的脂质体连接到核酸探针 上，进行了信号放大。该组还发展了基于聚合酶反应的s n p 检测方法【8 5 , 8 6 j 。我们 硕士学位论文 小组也发展了一些基于连接酶的特异性连接反应再结合酶或纳米粒子标记信号放 大的s n p 压电检测方法 8 7 , 8 8 】。标记磁性纳米粒子通常是为了便于目标物的分离， 在压电检测中也被用来实现信号放大【8 9 1 。 1 2 “点击化学 反应 1 2 1 “点击化学的基本概念 2 0 0 1 年，美国s c r i p p s 研究所的s h a r p l e s s 教授及其同事，提出了“点击化学 这个化学反应概念【1 7 】。这类反应易于操作，目标物产率高，很少甚至没有副产物 生成，在许多条件下都具有良好的反应效果，而且不会受相连在一起的其他官能 团影响。“点击这个称号意味着用这些方法把分子片段拼接起来就像将搭扣两 部分“喀哒扣起来一样简单。无论搭扣自身接着什么，只要搭扣的两部分碰在 一起，它们就能相互结合起来。而且搭扣的两部分结构决定了它们只能和对方相 互结合起来。 点击反应必须是模块化、应用范围宽、高产率和立体选择性的，通常还具有 较高的热力学驱动力。水是点击反应中常用的溶剂，其原因是：( 1 ) 有机分子在水 中不能充分溶解时反而会有更高的自由能，使反应过程在水溶剂中比在有机溶剂 中有更高的表观速率常数，常能得到较高的产率和单一的产物；( 2 ) 在有些反应中， 反应物间的反应速度比与水的反应更快，如s c h o t t e n b a u m a n n 反应用酰卤在水中生 成酰氨；( 3 ) 水是一个极好的热吸收器，对放热反应过程是有利的。此外，水可以 消除质子性官能团对反应的干扰( 在生物活性有机分子中含有很多羟基和氨基官 能团) ，因此不需要进行基团保护，并且对环境友好。 大部分点击反应许多年前就已经发现了，但在分析化学中它们尚未被充分地 利用。这包括以下的几类反应【9 0 】： ( 1 ) 张力环亲电试剂的亲核开环反应。环氧化物，吖丙啶，吖丙啶筠离子，环 硫鲶离子等三元环的开环反应，都是易于实现和多用途的反应。这一类反应还包 括0 【，b 不饱和羰基化合物的迈克尔加成反应。 ( 2 ) 羰基化合物温和的缩合反应。这类可靠而广泛应用的反应包括：醛或酮 与l ，3 二醇反应生成l ，3 环氧戊环；醛与肼或胲反应生成腙和肟；q 和p 羰基醛， 酮和酯生成杂环化合物。 ( 3 ) 环加成反应。通常其反应基团是相对非极性的，这些融合反应涵盖广泛的 反应，如d i e l s a l d e r 反应。最有用的是l ，3 偶极环加成反应，其中以叠氮化物和炔 的反应最为突出。 1 2 2 叠氮化物炔环加成反应 点击化学的目标和思想，在非催化( 图1 1a ) 及铜催化( 图1 1b ) 的叠氮化 d n a 生物传感器用于基冈点突变识别及新型传感界面的构建 物一炔环加成反应中体现得最充分。在2 0 世纪6 0 年代至8 0 年代h u i s g e n 【9 1 】的研究中 这类反应得以透彻理解并确立为一类重要的新反应。2 0 0 1 年，丹麦的m e l d a l 研究 组【9 2 1 与美国的s h a r p l e s s 研究组【9 3 1 分别独立发现了铜催化反应。这一反应需要采用 端基炔烃。用缩写a a c ( a z i d e a l k y n ee y e l o a d d i t i o n ) 代表非催化的过程，用c u a a c 代表铜催化的过程。通过铜的催化作用，炔基与叠氮的反应速度可以提高1 0 6 倍， 常温反应生成单一的反式三氮唑分子。c u ( 1 ) 的来源有：( 1 ) 直接使用碘化亚铜； ( 2 ) 抗坏血酸钠还原c u s 0 4 得到；( 3 ) 铜粉或铜丝还原c u s 0 4 得到；( 4 ) t c e p 还 原c u s 0 4 得到。 a 小心一心一旷万 一一留告g 眇魄一 霆k w ，咚nn 、n 一一帮 毋 磐孵 图1 1 非催化( a ) ；铜催化( b ) ；环张力促进( c ) 的叠氮化物炔环加成反应 鉴于c u 催化的点击反应有一定的细胞毒性，a g a r d 等【9 4 】报道了依靠环张力促进 的、不需要催化剂的、叠氮基与炔基的“点击”反应。环辛炔是能够稳定存在的 最小的环炔，具有很大的张力能，在环张力的促进下与叠氮基能快速地发生点击 反应生成三氮唑化合物( 图1 1c ) 。由于反应依靠环张力促进，不需要加金属离子 作催化剂，因此对细胞生理功能影响很小，几乎没有毒性。但是环辛炔与叠氮基 团反应的速度较慢。 由于叠氮和炔烃这两个基团的特殊性质，此类反应非常有用。叠氮化物和炔 烃的化学势能都很高( 热力学不稳定) ，它们融合成三唑环时放出大于1 8 8 千焦摩的 热量。另一方面，这一反应的速率很慢，对于非活化( 不是非常缺电子，也没有 k v站 硕上学位论文 张力) 炔烃，一般需要长时间加热。叠氮化物和炔烃对亲核试剂、亲电试剂和一 般的溶剂均表现出惰性，目前，叠氮化物是唯一有此性质的l ，3 偶极试剂。此外， 它们分子量小，不能形成强氢键，极性相对弱，对连接在其上的其他结构的性质 没有显著的影响。并且，它们都可以很容易地引入到有机化合物中。更重要的是， 叠氮化物和炔烃几乎完全不与生物分子发生反应，具有很好的生物相容性，可将 其引入到生物连接反应中去。 1 2 3 点击化学在传感器中的应用 鉴于点击化学高效、专一的反应特性，反应功能团简单、稳定等优点，该反 应已在新药物合成【9 5 1 、多功能材料合成1 9 6 】及细胞成像【9 7 j 等方面得到了较为广泛的 应用。而将点击化学应用于传感器检测方法的报道较少。主要的方法是基于点击 化学连接后形成的三氮唑五元环和邻近基团共同作用，能够特异性络合某些金属 离子或者阴离子，从而进行光学检测。s u n 粥】等通过点击化学反应合成了一种含有 两个芘基团的四环芳烃化合物，它能够结合镉离子和锌离子，改变两个芘基团之 间的距离，通