常见生物相容性实验汇总

1、常见生物相容性实验汇总细胞复苏材料准备：培养基、培养皿、70%酒精、一次性吸管、FBS、15ml&50ml离心管实验步骤：先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入5ml培养基；准备37C的水浴，取出冻存管后立即置于水浴中融化，确保细胞全部浸入液面，快速摇动，1min内使管内的细胞融化，注意不要让水没过管口，液氮会从口子喷出，小心。把培养基融化后的管子用75%酒精擦拭消毒后，放入安全柜内操作。小心打开冻存管，将细胞悬液转移到有培养基的15ml离心管中。1200rpm离心3min,弃上清，加入6ml含10%FBS的完全培养基，转移至新培养瓶（小瓶6ml培养基，大瓶10ml培养基）中，做好标记（

2、细胞类型、传代数、培养基、复苏时间、复苏人），置于CO2培养箱中37C培养，培养24h后视情况换液。复苏后细胞生长状况正常后，进行常规培养，最好在第二次传代后冻存若干管细胞，不可只取不存，在第三次传代后可用于细胞实验。TIPS：解冻细胞必须迅速，防止细胞低温损伤，慢冻速融。细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。细胞传代（TE消化法）实验前准备事项：预热培养用液：把已经配制好的装有培养基、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴锅内预热（可以省去）。用75%酒精擦拭双手，生物安全柜经过紫外线照射超过30min,实验前通风至少开启15分钟让空气循环起来，橱内不要使用火焰灯

3、，它们会影响橱内空气的流动方式。实验前把可能用到的试剂、吸管及离心管等全部拿到厨内，并正确摆放使用的器械，保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。材料准备：TE消化液、FBS、对应培养基、50ml离心管若干、15ml离心管若干、一次性吸管若干、培养皿等实验步骤：观察细胞生长状况后，取出实验所需物品，可在50ml离心管中配制40ml培养基（4mlFBS+36mla-MEM）待用。用一次性吸管从细胞单层吸出培养基，缓慢加入PBS或者不含血清的培养基没过细胞，摇晃洗涤培养皿12次。再吸出PBS或培养基，吸的越干净越好，6cm（10cm）培养皿中加入600山（800卩l）TE（胰蛋白酶），以刚

4、刚没过细胞为宜。（视细胞种类也可不洗涤直接加入TE消化液）稍加摇匀，使TE消化液均匀覆盖皿内所有细胞，置37C条件下温育13分钟。消化程度以用肉眼观察当培养皿晃动时飘起单层细胞为准，可在显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，视细胞不同而调节。消化适度后，加入适量培养基23ml于培养皿中终止消化，沿四个方向吹洗培养皿，确保细胞均从板上消化下来，最后全部转移到15ml离心管中。用吸管将已经消化的细胞轻轻吹打成细胞悬液。精确配平后放入台式离心机内1200rpm离心3分钟。弃上清液，加入适量PBS,重悬后1200rpm离心3分钟。弃上清液，先加入23ml含10%

5、血清的培养基于15ml离心管中，将适量细胞重悬液转移至含有培养基的6cm培养皿中进行培养，做好标记（细胞类型、传代数PxNy、培养基D-L-5、传代时间、传代比例1:5；操作人），置于CO2培养箱中37C培养，清理操作台，处理垃圾，记录笔记。TIPS：消化适度：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，细胞从平板上脱落可以用枪头吹打实现，但必须观察到细胞间已经分离。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细

6、胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37C时，胰酶溶液的作用能力最强，针对不同细胞，建议初次消化时均在显微镜下观察细胞形态以确定消化程度。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，女如D-Hanks液。EDTA可以螯合2价金属离子，故常用TE溶液。终止消化时，可用含有血清培养基或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用，利用培养基稀释也可以达到一定效果。每次传代可以按1:31:10等比例进行，以ATCC数据建议和实际生长状况考虑，请协商好细胞需要立

7、即使用还是长期培养，合理保持培养箱中不同细胞的平板数量。用一次性吸管吹匀细胞时，切勿产生大量气泡，在气泡破裂时产生的剪接力对活细胞有致命威胁。建议吸管在吸取液体前尽量排空气体，缓慢松手以吸取更多液体，继而以合适的力度吹匀细胞。细胞冻存材料准备：TE消化液、FBS、对应培养基、50ml离心管若干、15ml离心管若干、一次性吸管若干、专用冻存塑料管（1ml）等实验步骤：1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS）配好并放置冰箱预冷；2、当10cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200rpm离心，去上清；3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1

8、200rpm离心，去上清；4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，冻存管必须将盖子盖紧，防止液氮侵入，并做好标记（细胞类型、培养代数、培养基、冻存时间、冻存人、编号）。按下列顺序梯度降温：室温-4C（1020min）f冰箱冷冻室-20C（0.51.5h）低温冰箱-80C（过夜）液氮罐-196C（长期）（冰上转移）。5、整理，做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录（细胞信息、具体冻存位置、管数等）。TIPS：欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80-90%致密度。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞

9、活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。DMSO稀释时会放出大量热能，为了防止局部DMSO浓度过高，请滴加培e.f.g.养基并且不时摇晃，当然，最佳的是配制好冻存培养基，加入离心管中对细胞沉淀小心吹打制悬。梯度降温转移细胞时注意放置冰盒上

10、，避免敏感温度变化。不宜将冻存细胞放置在0C-60C这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内,是“危险温区”。注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。专用冻存塑料管，带有螺旋的平底塑料盖，并且可以耐受低温，注意冻存时拧紧。细胞计数材料准备：細胞計數器、Eppendorf管等实验步骤：制备细胞悬液，可稀释数倍以使每小格的细胞数可数。取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。将悬液摇匀，用移液器吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，不要使计数区两边平台沾上悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度

11、的升高，可用吸水纸吸去沟槽中流出的多余悬液。静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将细胞计数板放置于显微镜的载物台上，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。细胞计数时，计数区是由4个16格小方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（A、B、C、D）的细胞数，数完计4个大方格读数的平均数。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如细胞位于大方格的粗线上计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。测数完毕，取下盖玻片，喷酒精将细胞计数

12、板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干、滤纸吸干或用吹风机吹干，放入盒内保存细胞计数板-计数公式：计算公式：细胞数/ml=16小格内细胞总数x104x稀#倍数1mmAFBG细网格线.006mm粗网格线0P014mmffTRSD幼鼠骨髓间充质干细胞提取准备好已灭菌的手术器械和需要用到的离心管、培养皿等器材，于紫外照射30min灭菌。2.先将培养基配好，并在培养皿中加入PBS和10%FBSMedium。将出生7-8天的SD幼鼠处死，喷酒精后放入超净台的培养皿中。左手拿镊子将SD幼鼠后腿脚掌夹起，右手持剪刀沿着SD幼鼠后腿将皮剪开，且将皮剪至股骨部分，要将皮剪开点，以免沾

13、到毛发。找到股骨与身体相连的关节处剪断，取出后腿，并将脚掌与胫骨相连位置的皮剪掉，去除脚掌,余下部分放置于装有PBS的培养皿中。重新取新一套镊子与剪刀，用镊子将腿夹起，在胫骨与股骨关节相连处用剪刀剪断，得到分离的胫骨与股骨。左手用镊子将胫骨节气，右手持剪刀对骨头进行剔肉，尽量将骨头上的肉剔干净后，剪断胫骨两端的关节，使胫骨两端相通后放入装有10%FBSMedium的培养皿中，股骨处理与胫骨相同。用lml注射器插入到骨髓腔中，并不断用medium进行吹打，直至腔体发白为止，再用lml枪头吹打培养皿中的细胞，以免细胞成团。用细胞滤网对培养皿中的细胞悬液进行过滤，去除液体中的组织和肉末，将滤液放入l

14、0cm培养皿中培养过夜。第二天，去除上清液，PBS清洗两次（要沿壁加PBS,以免将贴壁不牢固的细胞吹起），再加入10%FBSMedium培养。（由于刚提取的细胞中含有多种杂质，刚提取的细胞经过过夜培养后，细胞上清液浑浊属于正常现象，在提取后的两天内，细胞要每天换液，且换液时候加PBS和10%FBSMedium时候必须缓慢沿壁加入，以免将细胞吹起。）2天换液一次，等到细胞长满之后，对细胞进行传代，传至第三代即可进行冻存和做实验用。CCK-8实验目的：考察合金改性前后对对细胞毒性的变化细胞：小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1,大鼠骨髓间充质干细胞RBMSC实验原理：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被

15、活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。保存条件：4C干燥避光保存，有效期一年（推荐）。-20C干燥避光保存，有效期二年。直接在材料上种细胞的CCK8实验方案准备一个小烧杯，将材料放置于烧杯中，材料正面向上，尽量避免碰到尖锐物,用75%的乙醇灭菌10min，将材料转移至24孔板中，用PBS清洗两次，尽量减少清洗时间，再用培养基清洗一遍，加入

16、800卩1培养基使材料浸没在培养基中（若材料为钛合金，可把75%灭菌后的材料放置于超净台，再用紫外照射一段时间后，将材料放置于24孔板中，用PBS清洗后，再用培养基进行清洗。）取70%-80%对数生长期细胞，胰酶消化后，用PBS洗涤，用含10%胎牛血清a-MEM培养液配成单个细胞悬液，计数，在材料上种细胞，密度为3*104/孔（可根据材料调整细胞密度），使细胞悬液均匀的铺满整个材料表面（先加入800l培养基（含血清），观察是否浸没了样品，若不够再加一些。若有气泡，戳破。再以转圈的方式加入200l细胞重悬液至材料表面，轻微震荡），5%CO2培养箱中培养使细胞贴壁。每个材料4个复孔（若材料为钛合金

17、，则可将细胞悬液配成配制浓度为2X104个/mL的细胞悬液，分别注入已置入材料的无菌24孔板，每孔500口L。48孔板，每孔300p!。）由于镁合金与CCK8会产生假阳性结果，所以在检测吸光度的时候，需要将细胞消化后再与CCK8进行孵育：待细胞贴壁后，吸去培养基，加入新鲜培养基继续分别培养1,3,7天（每天需更换新鲜培养基），弃培养基，PBS洗2次（PBS需吸干），清洗后，将材料转移至别的空白孔中，每孔加入200卩1胰酶消化1-2min后，在显微镜下观察control组的细胞是否消化下来，如没有消化下来,用枪吹打至细胞完全消化后，每孔加入500卩110%胎牛血清a-MEM培养液终止消化，120

18、0rpm离心5min,弃上清，加入400卩l10%CCK8的不含血清的培养基（10%CCK8溶液须提前配置好），避光培养4h，终止培养,于酶标仪450nm波长测定其吸光度（其他材料：待细胞贴壁后，吸去培养基，加入新鲜培养基继续分别培养1,3,7天，弃培养基，PBS洗2次（PBS需吸干），清洗后，将材料转移至别的空白孔中，每孔加入400pl10%CCK8的不含血清的培养基（10%CCK8溶液须提前配置好），避光培养4h，终止培养,于酶标仪450nm和650nm波长测定其吸光度。）实验对照组：种3*104/孔细胞于24孔板中，加入培养基分别孵育1,3,7天后，弃培养基，PBS洗2-3次（PBS需吸

19、干），每孔加入与实验组相同体积的10%CCK8溶液，避光培养4h，测定450nm的吸光度。（若为镁合金的control组，则应将control组中的细胞消化下来，再与CCK8进行孵育。空白对照：在空白孔中加入与实验组相同体积的10%CCK8溶液，避光培养4h，测定450nm的吸光度即为空白对照。备注：一个方块材料为1cm2，一块材料消耗1ml培养基在材料上培养细胞时，需每天进行换液，防止镁合金腐蚀对细胞造成影响。当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。特别重要的是，在加入CCK8之前，必须把材料转移至其

20、他空白孔中,以免贴壁在材料外的细胞造成的实验误差。材料浸提液CCK8的实验方案1、对材料先进行封胶处理，封胶时底面只弄一次，尽量平整、薄。封胶完毕后，在干燥箱中存放3天，多余的胶用手术刀切掉，尽量使底部保持平整。在用于浸泡之前，用2000#砂纸对WE43再次进行打磨，以去除表面的氧化膜。2、准备一个小烧杯，在烧杯中灭菌，材料正面向上，尽量避免碰到尖锐物。将材料于75%的乙醇中灭菌10min,再用PBS清洗3次，转移至24孔板中，加入培养基后在桌面来回动10-20s。3、材料与a-MEM+双抗培养基在5%CO2，37C条件下孵育3天（lml/cm2）。4、提取上层液在4C中保存，使用前用0.22

21、pm的滤头过滤除菌（加过双抗可不灭菌），离心去上清液（液体有挥发就补齐），4C保存，材料回收。5、细胞用a-MEM培养基+10%FBS+100U/ml双抗培养。6、取70%-80%对数生长期细胞，胰酶消化后，用PBS洗涤，用含10%胎牛血清-MEM培养液配成单个细胞悬液，计数，在96孔板上种细胞，密度为5*103/孔，5%CO2培养箱中培养24h使细胞贴壁。24h后吸去培养基，每孔加入材料提取液90pl+10plFBS（10%）。进一步稀释成50%，25%，10%的提取溶液，以加入90卩l培养基和10plFBS位对照组，每一样品设5个复孔。37C培养1,3,7天，弃提取液，PBS洗2-3次，每

22、孔加入100卩l不含血清的10%CCK8培养4h,终止培养，于酶标仪450nm波长测定其吸光度。空白对照:在空白孔中加入与实验组相同体积的10%CCK8溶液，避光培养4h，测定450nm的吸光度即为空白对照。按细胞增值度法计算细胞相对增值率（Relativegrowthrate，RGR），并按表1的要求，将RGR值转化成六级，评定材料毒性。RGR（%）=（材料组吸光度-空白组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）X100%表1分级标准和评定结果0级1级2级3级4级5级RGR(%)210075-9950-7425-491-240评定结合格合格结合细胞不合不合格不合格果形态综合格评价注意事项：由

23、于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂（例如一些抗氧化剂）会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。细胞CCK8实验结果参照下图:1B014080IncubationTime(day)Fig.15.InvitrocellviabilityofMC3T3-E1pre-oteoblastscu

24、lturedintheextractionmediumoftheuntreatedandNd-implantedWE43for1and3days.100Extract70%ExtractRW50%Extract010%Extractaba&cWE43b&dNd-implantedWE43如图所示，相同浓度浸提液与细胞共培养1天和3天后，100%WE43浸提液对细胞的毒性比较大，细胞存活率分别为60%和40%左右，而钕元素等离子注入WE43100%浸提液与细胞共培养1天和3天后，细胞存活率分别为90%和100%左右，且在低浓度情况下钕元素等离子注入WE43能够促进细胞增殖，表明经过改性后的WE4

25、3具有良好的生物相容性。Improvementofcorrosionresistanceandbiocompatibilityofrare-earthWE43magnesiumalloybyneodymiumself-ionimplantation,CorrosionScience94(2015)142-55.细胞骨架和DAPI染色（细胞粘附测试）定义：细胞骨架是由蛋白质丝搭建起的骨架网络结构,主要包括微管，微丝，中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化、物质运输、能量转换、信息传递、基因表达等都起到重要作用。实验目的：比较材料表面改性前后早期细胞直接粘附的状态细胞：小鼠胚

26、胎成骨细胞MC3T3-E1原理：利用抗原-抗体反应原理，就是以一抗作为探针，它与目的蛋白作用并连接，再用带有荧光（或同位素）标记的二抗与一抗作用，最后显色，发光位置就有目的蛋白。罗丹明荧光物质标记的鬼笔环肽可特异的与真核细胞的F-actin结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布。DAPI为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。实验方案：准备一个小烧杯，将材料浸没在装有乙醇的小烧杯中灭菌10-15min。将材料放置24孔板中用PBS震荡洗两次，培养基洗一次。材料放置孔板中部。细

27、胞以5*104/孔接种，使细胞悬液均匀的铺满整个材料表面，孵育5h。（先加入800卩1培养基（含血清），观察是否浸没了样品，若不够再加一些。若有气泡，戳破。再加入200卩l细胞重悬液至材料表面，轻微震荡。）（若材料为钛合金，则可将细胞悬液配成配制浓度为2X104个/mL的细胞悬液，分别注入已置入材料的无菌24孔板。）细胞孵育5h后，弃去培养液，用PBS震荡清洗两次（24h时间点：加入新鲜培养基继续培养24h后，弃上清，用PBS振荡清洗两次），3.7%甲醛（PBS中）在室温下固定5min，吸出固定液，PBS清洗2次。加入0.1%（体积比）TritonX-100（PBS中）破膜5-8min，弃去T

28、ritonX-100上清液，PBS洗3次。在暗室中，取5卩16.6pM罗丹明标记的鬼笔环肽用PBS稀释至200卩1（终浓度为165nM，加入鬼笔环肽（覆盖即可，用完可以回收利用），室温避光孵育40min,吸出染液，用PBS清洗洗3次。6.加入DAPI溶液室温下染色3-5min,弃去染液，用PBS洗3次，加入PBS,荧光显微镜观察，并拍照记录。省染料的做法：取封口膜一块，滴加染料在封口膜上，倒扣材料，使细胞直接接触染料染色，注意过程中染料不能干。正置荧光显微镜观察法：取干净载玻片，将材料放在载玻片上（事先泡在PBS中，取出时用吸水纸轻轻拭干，有细胞的表面朝上放置）。打开显微镜，荧光，电脑。先在显

29、微镜以（X100。即（10倍物镜。观察整体情况。荧光：1通道：DAPI，2通道：FITC,3通道：罗丹明观察：1.细胞骨架形态是否发生变化肌动微丝是否出现增粗细胞间连接是否增多细胞形态：多角形变成梭形，伪足明显增多注意：DAPI和鬼笔环肽具有剧毒性，在使用的时候应尽量小心，一定要带手套操作，避免将染料弄到皮肤上。细胞骨架和DAPI荧光染色图片结果如下图：Zn-PIIIAg-PIII*4SOjua亀.*%摯琴.iA*仏.1*e厂b,SOiaZn/Ag630AnnexinV-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测，PI红色荧光(流式Ex=488，Em630)通过FL2或FL3检测，建议使

30、用FL3。荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿去除光谱重叠和设定十字门的位置。结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为FITCLOGFLUOR(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)。rai.AnnexinV-FITC和碘

31、化丙顼染色后的沐式削胞仅卷測效呆屈正常的活细胞不被A肋芒inV-FITC和膜犹丙呢染色圏中左下部井h罚亡早朋的細胞仅趙AnnatinV-FTTC色.他化丙噬势色呈阴性(图呼右下部分h坏死细胞和時亡晚期的细胞可低同时feAiinrxinV-FITC和碘化丙喘錨色(昭中右上部井h罔中左上却分出现的是许可范围内的栓测溟芒，荧光显微照相操作方法：滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡;应同时设置阴性对照。a.将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组;b.用冰冷PBS洗涤细胞两次;在500yL的B

32、indingBuffer中加入2yLAnnexinV-FITC,5yLPI，混匀；将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；避光、室温反应5min。将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片(FITC和Rhodamine)观察AnnexinV-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色结果判断：结合AnnexinV-FITC的凋亡细胞的质膜将显示绿色光圈；膜结构不完整的坏死细胞和晚期凋亡细胞在整个核区被PI染成红色而质膜为AnnexinV-FITC阳性呈现为绿色光圈。Anrwxin仏FH匸和讀比禹瞅肥觸色妊黑国.隅巾鳏色黃怎*3Annesin仏FJPC酗色阴性伺軋红色

33、茨光为琪比丙味黑苗阳世卿fL仪删色英光期色的为閒亡第胞，盛縫色却红鱼荧itSSt的是坏视细胞未議蔬光热色的为JE常第庖=HUVECScells实验protocolTranswell1实验用品：小室：coster的24孔板的transwell的8pm。上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2%BSA。基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和W型胶原，Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。使用前于4C冰箱冰水混合物中融化过夜下层培养液：下层常用含5%10%FBS的培

34、养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。包被基底膜：用50mg/LMatrigel1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4C风干。水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37C，30min。制备细胞悬液2.1制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿1224h，进一步去除血清的影响。2.2消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗12遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至110X105，最好不要超过5

35、X105。接种细胞3.1取细胞悬液100200pl加入Transwell小室，24孔板小室一般200pl。3.224孔板下室一般加入500pl含FBS或趋化因子的培养基。（这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。）培养细胞常规培养1248h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。5细胞染色用棉签擦去基质胶和上室内的细胞染色：推荐采用0.1%结晶紫染色。(这种方法有如下优势：(1).

36、不需要固定细胞，直接染色即可。(2).配制简单方便。(3).染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm测其0D值，间接反映细胞数。)显微镜照相和细胞计数：取若干个视野计数细胞个数一般采用5-10个，随机选取，统计计数。另：值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwel1侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费。此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin，FN,BD有售)，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着

37、在膜上，也可用胶原(collagen)或明胶(gelatin)。细胞划痕实验铺板前用记号笔在孔底部画4-5条平行线(方便拍照时区域定位)；铺满六孔板细胞，贴壁；用10ul枪头和直尺于垂直平行线方向进行划痕，4-5条，PBS洗一遍；3换含不同药物浓度的无/有血清培养液继续培养；4.不同时间取不同位置观察划痕距离并显微镜拍照。免疫荧光一、实验准备1、片子处理将新片子用1%的HCl泡片子1h,再用75%的乙醇溶液泡0.5h以上，用纱布擦干净即可备用2、试剂配备透化液0.2%TritonX-100/PBS封闭液5%BSA/PBST(可以加0.2%TritonX-100)抗体稀释液2%BSA/PBST(

38、可以加0.2%TritonX-100)DAPI染液0.2-lyg/yl一抗稀释1:100-1:500（依据抗体说明书）1:100-1:500二抗稀释（避光）注：DAPI先用超纯水配成5mg/ml的储存液，保存在-20C，此乃原始储存液。将此原始储存液1:50稀释成100yg/ml的储存液，染色时根据情况的不同1:100-1:500稀释成工作液，此工作液现用现配。根据经验，遗传所四楼正置显微镜1:500稀释即可；所里共聚焦显微镜稀释比例需为1:100。二、实验步骤1、培养基不弃，加27yl/ml的甲醛室温固定10min2、PBS洗3次，5min/次，洗时轻轻摇晃3、用透化液室温透化10min4、

39、PBS洗3次，5min/次5、用封闭液37C封闭1h6、PBS洗3次，5min/次7、加入一抗室温孵育40min，如果双标，这两种一抗可以一起加8、PBST洗3次，5min/次9、加入二抗室温孵育30min,此后的过程都需要避光10、PBST洗3次，5min/次11、稀释DAPI染液（储存液浓度lOOpg/pl）,加入DAPI染液室温避光染色2-10min12、PBST洗3次，5min/次13、抗淬灭剂封片，必要时可用指甲油将边缘封住，用正置显微镜或用共聚焦显微镜观察即可。注：1、细胞数不用太多（约50%），细胞数过多会造成透化、抗体孵育等不充分2、如果细胞贴壁不牢，可以适当延长固定时间（10

40、-30min）3、如果双标，一抗一定选择不同源性的，并且要相应的选择好二抗。一般来说，FITC的二抗特异性好，背景低；罗丹明的二抗背景较高4、DAPI染色需要摸索，染得过亮或过弱都不好小管形成实验1、4C过夜溶解基质胶（基质胶只有在4C的时候才是液态），培养基，枪头盒，96孔板和灭菌EP管需提前放置冰箱预冷。2、实验时取出预冷的枪头以无血清的高糖DMEM培养液1:3（培养基：胶）稀释基质胶，此步骤要迅速（混匀时千万注意不要吹起气泡）3、以150-200ul/cm2生长面积的比例（盖住底面高出2-3mm即可，一般取100ul）加入稀释好的基质胶至96孔板中（加胶时千万不要吹起气泡，气泡是戳不掉的

41、，直接影响成胶）。将96孔板放置在培养箱中1h让胶凝固。4、将细胞以专用培养基+10%专用血清的培养液稀释以2*104/well/100ul的浓度加入96孔板（可根据实验需要进行稀释：1、可以先加浸提液50ul，再加入50ul细胞悬液，防止细胞被液体冲乱；2、也可直接先用浸提液和细胞悬液在ep管中混匀，再加入100ul于96孔板基质胶中），前后微微反动孔板使细胞均匀铺展，注意避免液体倾出；5、将孔板放入37C培养箱中孵育4,8,10,12,16h后于显微镜下观察成管现象，寻找环状的细胞管。观察：小管与小管之间的连接数小管的长度及小管的管径大小注意：每个样品做两个孔即可。成环与细胞的密度有关，细

42、胞少则无法成环，细胞太多会大片生长，也无法成环，可以做个预实验探索下细胞的密度。血管形成实验需要高浓度的基质胶，基质胶浓度太低胶原蛋白等含量不够很难成管。系时候成管所需时间较长。在显微镜下观察，胶时三维的，所以细胞长在上面不可能完全聚焦清楚，拍照时应选较为清晰呈现小管的图片即可。在拍照的时候最好找同一个视野进行拍照，最好为中部。因为边缘效应，孔边上的细胞更易成环。血液相容性一、溶血率实验实验目的：检测含铜钛合金对血液中红细胞的破溶血作用实验步骤：实验材料：抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6A1-4V合金、稀土含铜钛合金，纯钛、纯铜、钛铜合金、阴性对照组（PBS）,阳性对照组（超纯

43、水）取新鲜抗凝血8mL，加PBS10mL稀释（4:5）抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6Al-4V合金、稀土含铜钛合金，纯钛、纯铜、钛铜合金与适量无菌PBS混合，按照材料表面积与浸提液体积比为1.25cm2/10mL的标准，每组各3管（24孔板加厚：5.28cm2，24孔板：3.96cm2，小：2.20cm2，单位面积的液体体积相同即可）阴性对照组3管，每管加同批号PBS10mL。阳性对照组3管，每管超纯水10mL全部试管浸入37C水浴槽中30min，每管加稀释血0.2mL,轻轻混匀后置于37C水浴槽中继续保温60min取各试管内液体3000rpm离心5min，吸取上清150uL

44、放入96孔板,于分光光度计545nm波长处测定吸光度取3次实验的平均值计算溶血率（Hemolysisrate，HR）:HR=（样品吸光度-阴性对照吸光度）/（阳性对照吸光度-阴性对照吸光度）X100%按ISO规定溶血率三5%,则材料符合医用植入材料的溶血实验要求；溶血率5%,则表示实验材料有溶血作用。Ilbk2Valuerofopiccaldensinaibdhaemclysispercwit-ngsfwdifkreniironbnwdfoamsOpliLalderiibityHacrn户i讥足PtisdcKecorn曲叶甌1.00hvegjLivgcrflErcI汕岛Fe0.0487土0.0

45、03673.467土ft.557Fe-CKTsO.U3413土D.JU3333-72XJ0310D.OWJ土0.DO2671.090=1=0.41(SinteredmetallicfoamsforbiodegradablebonereplacementMaterials,JPorousMater(2014)21:131-40;DOI10.1007/s10934-013-9757-4二、粘附在材料表面的红细胞的SEM实验实验目的：检测血液中红细胞在不同合金表面的粘附状态实验步骤：1、实验材料：抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6A1-4V合金、稀土含铜钛合金，纯钛、纯铜、钛铜合金、2

46、、取新鲜抗凝血8mL,加PBS10mL稀释（4:5）3、抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6Al-4V合金、稀土含铜钛合金,纯钛、纯铜、钛铜合金与适量稀释血液混合后，37C培养箱中孵育30min。4、弃血液，PBS洗两次，每个样品加入800uL的2.5%的戊二醛进行固定（室温60min）,然后用PBS缓冲液轻轻冲洗2遍，每次5min。5、使用30%，50%，60%,70%,90%,100%的酒精逐步脱水，每次5min6、HCP-2临界点干燥仪干燥2小时7、样品上铜台，Pelco.Sc-7自动镀金仪镀金8、SEM镜下观察红细胞形态。Asurface-erodingpoly(1,3-t

47、rimethylenecarbonate)coatingforfullybiodegradablemagnesium-basedstentapplications:Towardbetterbiofunction,biodegradationandbiocompatibility,ActaBiomaterialia9(2013)8678-689说明：正常红细胞为圆形面包圈形状，当红细胞形状变成不规则时，说明材料对红细胞有溶血作用，血液相容性不理想。血小板粘附实验材料数量：每种材料2个样品，1个时间点，每个时间点2个平行样。PRP（富血小板血浆）waspreparedbycentrifugingw

48、holebloodfor10minat1000rpm.（血小板在上层清液）PRPwasdrippedontothesample（300uL/孔）platesandincubatedat37Cforlh。（材料先放入24孔板,PBSwasusedtoremovenon-adherentplatelets（2）每孔加入300uL的2.5%的戊二醛进行固定（室温60min）,然后用PBS缓冲液轻轻冲洗2遍，每次5min。使用30%,50%,60%,70%,90%,100%的酒精逐步脱水，每次5minHCP-2临界点干燥仪干燥2小时样品上铜台，Pelco.Sc-7自动镀金仪镀金SEM镜下观察细胞形态。

49、Asurface-erodingpoly（l,3-trimethylenecarbonate）coatingforfullybiodegradablemagnesium-basedstentapplications:Towardbetterbiofunction,biodegradationandbiocompatibility,ActaBiomaterialia9(2013)8678-689说明：血小板是由红骨髓中巨核细胞破碎后形成的一种无色、体积小、形态不规则的小体，初生时体积较大，衰老时则较小，平均寿命为3-5天。血小板具有粘附于异物表面的功能，可发生粘附、变形、聚集、释放等反应，相同实

50、验条件下，若材料表面上的血小板粘附数量少，聚集少，变形少（血小板不长出多余伪足），则表面其血液相容性好。粘附在异物表面的血小板主要分为五类形状：圆形，树突状，散布树枝状，铺展和充分铺展。蛋白粘附实验目的：看材料蛋白粘附情况。实验背景：细胞在生物材料表面的粘附是通过生物识别过程来实现的。当生物材料与血液、组织液以及含有血清的培养基接触时，材料的表面会迅速地吸附一层蛋白质分子，然后才是细胞到达材料的表面，即细胞通过整合素与生物材料相黏附。材料表面性质通过影响粘连蛋白的黏附来影响细胞。实验原理：BCA（Bicinchoninicacid）法是目前应用比较广泛的蛋白质浓度测定方法。基于双缩脲反应，即在

51、碱性环境下蛋白质将Cu2+还原成Cu+，产生一种紫蓝色复合物，在562nm处有高的吸光值，该反应产物的量与蛋白质浓度成正比。材料数量：每种材料,1个时间点，每个时间点2个平行样。实验步骤：消毒材料分组：Ti，Ti-5Cu,TC4,TC4-5Cu,Cu,稀土钛（6种材料，3个平行样）。材料编号，将不同型号材料分别植入24孔板和48孔板，每孔加1000uL（24孔板）和600ul（48孔板）培养液（a-MEM）（无细胞），将各培养板置于37C,5%CO2培养箱中培养4h。4h后取出24孔板和48孔板，吸弃培养液，生理盐水冲洗3遍,将材料转移至新的24孔板和四十八孔板内（材料和板孔相差不大可不换新的

52、板），在新的培养板内每孔加入0.2%tritonx-100裂解液500ul（24孔板）和300ul（48孔板）过夜，4度。取裂解液25ul于96孔板,再加入200ul的BCA（A液:B液=50:1），37C孵育30min后，96孔板于酶标仪下检测吸光值OD。（562nm）根据拟合好的标准曲线所得公式计算蛋白总量，式中X为OD值,Y为蛋白质浓度，单位为（ug/ml）。EZZ3JDBMIIHF-JDBMz.o-21.Q-D.5-1d1DdFig.3DegradaLJOiiraieotJUBMandHF-JDBMforIdacidJUdimmersiontestinDMEM+K)%FBSutider

53、cellcultureconditioncalculatedbymasslossmethod(*FHCI(pHB6)10%SOS忙咯过Kt醸錢TEMED1ft%GoifeOLSMTris-Md(pHB创10%SDS10%过BE酸黏TEMED1?%GelHsO30%Acrylamide1.SMTri-HCI虫卫)10%SOS苗第过磕醸蛀TEMED15MiH?O30%crylandig1；MPisHCIeHfi.E)10%过it皤卷TEMED耳0(M.6M.3.0血.0121.1.o./段1$1.71.30.050.05也血1.61.10.0500503830611吕22.d.aC67511_M4,2.2Qo.c-4.03.32.60.1fl.1Cl.d043.34.0站0101(100496A-17.3