（细胞生物学专业论文）鱼类细胞低温诱导的红外光谱研究.pdf

中文摘要 摘要 寒密熙黧要麴遂壤叟毽魏蘸突方囊，特耀热整竣瀣瀵警皇物凌淤攫鹱低( 戮建戳 上) 酶环凌下无法适或并羧终嚣致死亡躲蕊蒙，与熬点滋下滠疲造戏的凉害糕透剐。 对于寒密静研究璐襁熊中在燕带禳糖在鑫然嚣低溢逆蠛下静垒理反应，懿瑚秘 荛簇鳖邀抒粒磷究援瀵较步。鱼类馋为嶷瀣动物，麓辩又有广慧瞧霸毒溢瞧等誉瓣 滠褒适藏髓的癸剐，是非裙遣塞避褥寒器磷究的瓣髓。本文茸次糖f t - i r | 入生绣 低溢偌密磷瓮中，选择溥淤经受类浚隶秘鲻照鳍懿藏攀c b t 与广灞经的草鱼缭藏袋 c p 乍为秘澈对豢。分剐黔c b t 纲魏避蟹1 0 ，瓣c p 缨戆避行碡低温处联0 + 8 天，强及对黼类细您逡杼一8 0 、一2 0 ，意漩翮娥淫愆讶究，蕊祭缨魏蠹d n a 、 r n a 、鬻舞蒺、蘩萄爨、磷藉等重蘸囊亿缀努懿穗黠禽量变讫，分辑英与溢艘诱簿 的关系，滚入探讨了低溅瓣鱼类缅骢的侮害规理。簿密粒研究霄蹬予喜滠经镪醛怒 嵩菇度接广，并最终搦永逮一璇象熬痨在辊褒。 e 黼褰黪遗低温i 签灌后发蕊：缨麓釜纯缀努麓变截鸯狳浚缝，喜滋憋囊 按细您对予豫溢翁反盛遐遮，处理l 天联簸发瑷r n a 尚d n a 褶对禽爨明黧下降；2 ) 低溪楚鬻l 一3 天，盔努滗潞装赣翻藏褥然有r n a 嫠) 转潦酾蛋白静秘瀑活稳，该避糕 中蠢囊鼹蘸蘩蔫精臻酸诧鼹象；3 ) 藕瀑处褒碡天震氟憨瓣蠡辩惑潜袋n d n a 大郝努 解髂、r l a 转录箨滞，爨鑫蒺开始承勰，提示缩飚撼亡；4 处溅黧7 8 天，缎豁鲻 谱豢器交礴鳓戆彝蛋囱箴、鞠a 藕对禽蹩臻箍下辩，罐示绥麓开始凝薅。 c 】辩鼹过犬溢差懿鹱茨聚：1 ) 溶点以上薜逡瞧甄注( i 0 黠锾鼹豹撰攥生 萎途径为黼亡，深诋澈、礴温辩缨融瓣擞伤方式必物理淫的坏张：2 j _ 红葑鹜谬挝示 滚黎溢- 8 0 4 g 与褰渣对艇麓囊努瓣影鞠粪议，蘩彝溪耱辩舍爨下簿疆嚣，麓萄糖 磷酸证畿嚣，缨藏囊羧爱等。 c 嬲襞| 稔蝰4 廷骥较髓：1 ) 她懋0 - 3 天浅薤辨瓣漤遂幂缨脆蕊i 他缝分含麓衮纯 中文摘要 1 一i i ，一 i ii ii i i i i i i s ! 目e ! ! ! 较为平稳：2 ) 处理4 天盛，绻多 图避显示d n a 大部分解体、r n a 转录捧滞、滠趣履 开始水鳃，表明细胞嗣亡。 c p 缨鼹经j 霪丈瀑整楚避整理： 港点戳下 蕊渥之0 骞爨驻静r n a 与簧彝袋累 积发生，说明谈温度在初期可能诱发了缎胞冷激反艨；2 ) 其缝处理激发窭骏继榘 与c b t 糯类锻。 数上臻累袭嚷喜瀑瞧鱼炎绥爨c b t 在耱追低瀑1 0 4 c 下诱导下发生了疆亡，广澄 性鱼类细胞c e n 在更低的温殿4 。c 下诱导产生了獭亡，躐学生化缒分交动蛇熬冥主 要是在低溢诱蹲的卜3 天，低濂对c b t 在r n a 螽戒，d n a 复制，蛋巍袋台艘麴李霉翱撵建 鹱显强予低温瓣予e p 缎照数攒螽幸譬耀。 本论文将f t - i r 作为研究手段废用于濑度诱母细胞缌分变他的动恣研究警中， 鼹一静新酶搽索，拓宽tf t - i r 在生物学领域疵掰酌途径，辩连续蕊测绥聪缝分魂 漆变化程方法学上进一步完替，势揭示了蒜滠性蛰类细爨在寒寒中重簧生优分子缱 分的变化，以上结果朱见报道。 荧键谲；寒密；傅立旰转换红矫光谱；分子结构：凋亡；淡永自鲳尾鳞纲庭系c b t ： 舔鱼艇胎缨胞系c p 英文摘要 a b s t r a c t i ti sa l li n t e r e s t i n gb i o l o g i c a lt o p i ct ou n d e r s t a n dt h ei m p a c to ft e m p e r a t u r e , a l l i m p o r t a n te n v i r o n m e n t a lf a c t o rf o rb i o l o g y , o nc o n t r o l l i n ge f f e c to fb i o c h e m i c a la c t i v i t y a tt h es t a g eo fc e l l s 。c h i l l i n gi n j u r yi sas p e c i a lb i o l o g i c a lc o n c e p ta n dt h en o m e n c l a t u r e e s p e c i a l l yr e f e r st ot h ep r o c e s st h a tt h ew a r m - a d a p t a b l es p e c i e sc a nn o tg e tu s e dt oa r e l a t i v el o wt e m p e r a t u r ea 1 3 da r ec a u s e dt od e a t h t h em e c h a n i s mr e s e a r c ho fc h i l l i n g i n j u r yi sb e n e f i c i a ln o to n l yt ot h et h e o r e t i c a lf o u n d a t i o no ft h i sb a s i cb i o l o g yp h e n o m e n a ， b u ta l s o 鳓t h ep r a c t i c eo fl o c a l i z a t i o l ld e v e l o p m e n to fw a r m - a d a p t a b l es p e c i e s i nt h i s d e g r e et h e s i s ，c b tc e l lf r o mc o t o s s o m ab r a c h y p o m u mw a ss e l e c t e df o rr e p r e s e n t i n g w a r m a d a p t a b l es p e c i e sa n dc p c e l lf r o m g r a s sc a r pw a ss e l e c t e da sak i n do f e u r y t h e n n i cs p e c i e s ，t h e t w o t y p e s o f c e l l s w e r e c o l d i n d u c e d f o r 0 - 8 d a y s ( c i 强- 1 0 4 c ， c p 一4 c 1a n dt r e a t e dw i t hd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ( - 8 0 c 、2 0 c ，a n d6 0 。c ) b yu s i n g f t - i rt e c h n i q u e ，t h er e l a t i v ec o n t e n t so ft h et r e a t e dc e l l sw e r eo b s e r v e d ，i n c l u d i n gd n a ， r n a ，p r o t e i n ，p h o s p h a t e sa n dg l u c o s e 。i nt h i sw a y , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm o l e c u l a r s t r u c t u r ea n dt e m e r a t u r ec a l lb ew e l le l u c i d a t e d i nt h e1 0 c o i di n d u c t i o ne x p e r i m e n t so fc b tc e l l s ，w ef o u n dt h a t ：1 ) t h e v a r i a t i o no ft h ec o n t e n t so ft h ec e l l sc a nb ed i v i d e di n t od i f f e r e n ts t a g e s 。i n0 id a y ，t h e c o n t e n t sv a r i e dal o ta n da f t e rt h ef i r s td a y , t h en o r m a ls y n t h e s i s 撼r n aa n dd n ai s o b v i o u s l yr e s t r a i n e d ；2 ) i n d u c i n gf o fl - 3d a y s ，f t - i rs p e c t r as t i l ld e m o n s t r a t et h e e x i s t e n c eo fr n at r a n s c r i p t i o na n d p r o t e i nt r a n s l a t i o n ，c o m b i n i n gw i t ht h e p h o s p h a t i z a t i o no fg l u c o s e 。3 ) a f t e r4d a y s f t - i rs p e c t r as h o wt h a tm o s to fd n a d e c o m p o s e d ，t h et r a n s c r i p t i o no fr n aa r es t o p p e da n dt h ep r o t e i n sa r eh y d r o l y z e d ， i n d i c a t i n gt h ea p o p t o s i so ft h ec e l l s 4 ) i n d u c i n gt i l l7 8d a y s ，t h ec o n t e n t so fp r o t e i na n d r n aw a sd e c r e a s e d s t r o n g l y , i m p l y i n gt h ed e c o m p o s i t i o no ft h ec e l l s 趣掇# t r e a t m e n to fc b tc e l l sb yl o w ( b e l o wf r e e z i n gp o i n oa n dh i # t e m p e r a t u r e w ef o u n dt h a t ：1 ) t h ed a m a g eo ft h ei n t i m i d a t e dc o l d ( 瓣) a b o v ef r e e z i n gp o i n tt ot h e c e l l sh a p p e n sm a i n l yd u et oa p o p t o s i sa n dt h a to fu l t r ah i g h l o wt e m p e r a t u r ei st h e i l l 英文摘要 p h y s i c a ld e a t h ；2 ) a ss h o w ni nf t - t rs p e c t r a ，t h ei n f l u e n c e so f u l t r al o wt e m p e r a t u r e 一8 0 a n dh i g ht e m p e r a t u r e6 0 a r eq u i t es i m i l a r , w h i c he x h i b i t sa st h ed e n a t u r a l i z a t i o n o fp r o t e i n s ，t h ec a p a b i l i t yl o s eo fu t i l i z i n gt h ee n e r g ya n dt h eb r e a k i n go ft h ec e l l m e m b r a n e i nt h e4 c o l di n d u c t i o ne x p e r i m a n t so fc pc e l l s ，w ef o u n dt h a t ：1 ) i n0 - 3d a y s ， t h ev a r i a t i o no ft h ec e l lc o n t e n t si ss t a b l ec a l c u l a t e db yf f - i rr e s u l t s ；2 ) a f t e r4d a y s ， f t - i rs p e c t r as h o wt h a tm o s to fd n aa r ed e c o m p o s e d ，t h et r a n s c r i p t i o no fr n aa r e s t o p p e da n d t h ep r o t e i n sa r eh y d m l y z e d ，i n d i c a t i n gt h ea p o p t o s i so ft h ec e l l s i nt h et r e a t m e n to fc pc e l l sb yl o w ( b e l o wf r e e z i n gp o i n t ) a n dh i 靖t e m p e r a t u r e ，w e f o u n dt h a t ：1 ) a t o b e l o wt h ef r e e z i n gp o i n t 。a l lo b v i o u sa c c u m u l a t i o no fr n aa n d p r o t e i n sa r eo b s e r v e d ，s u g g e s t i n gt h a tt h ec o l ds t i m u l a t i o nr e a c t i o no ft h ec e l l si si n d u c e d a tt h ef i r s ts t a g eu n d e rs u c ht e m p e r a t u r e ；2 ) t h eo t h e rr e s u l t sa r es i m i l a rt oc b tc e l l s 。 t h ea b o v er e s u l t ss h o wt h a t ，a p o p t o s i so c c u r st ow a r m a d a p t a b l ef i s hc b tc e l l s u n d e ri n t i m i d a t e dt e m p e r a t u r e1 0 a n dt oe u r y t h e r m i cf i s hc pc e l l su n d e rar e l a t i v e l y l o w e rt e m p e r a t u r e4 t h ec e l lc o n t e n t sv a r i a t i o no ft h et w ot y p e so fc e l l sa r ed i f f e r e n t m a i n l yi nt h ep e r i o do f1 - 3d a y sc o l di n d u c t i o n t h er e s t r a i n e di m p a c to fc b tc e i l st o r n as y n t h e s i s ，d n at r a n s ( a i p t i o na n dp r o t e i ns y n t h e s i sa tl o wt e m p e r a t u r ei sm u c h s t r o n g e rt h a nc pc e i l s 。c h i l l i n gi n j u r yi sd i f f e r e n tw i t hc o l di n j u r y ( t e m p e r a t u r eb e l o w f r e e z i n gp o i n t ) ，a ss h o w ni nf t - i rs p e c t r a ，t h ei n f l u e n c e so fu l t r al o wt e m p e r a t u r e 墙o a n dh i g ht e m p e r a t u r e6 0 a r eq u i t es i m i l a r , w h i c he x h i b i t sa st h ed e n a t u r a l i z a t i o n o fp m t e i n s ，t h ec a p a b i l i t yl o s eo fu t i l i z i n gt h ee n e r g ya n dt h eb r e a k i n go ft h ec e l t m e m b r a n e i nt h i sd e g r e et h e s i s ，f r - i rt e c h n i q u ew a sf i r s t l ye m p l o y e di nt h er e s e a r c ho fc e l l c h i l l i n gi n j u r ym e c h a n i s ma n dp r o v e d t ob e v e r ys u c c e s s f u l ，w h i c he x t e n d st h e a p p l i c a t i o no ff t - i rs p e c t r ai nb i o l o g i c a lr e s e a r c ha n do p t i m i z e st h em e t h o d o l o g yf o r c o n t i n u o u s l ym o n i t o r i n gt h ec o n t e n t so fc e l l s a i lt h er e s u l t sh e r ea r en o tr e p o r t e d p r e v i o u s l y , a n dv a l u a b l ei nd i s c o v e rt h eu n i q u er e a c t i o no fm o l e c u l a rc o n t e n to fc e l l s t h r o u g ht h ep r o c e s so fc h i l l i n gi n j u r y k e y w o r d s ：c h i l l i n gi n j u r y ；f t - i rs p e c t r u m ；m o l e c u l a rs t r u c t u r e ；a p o p t o s i s ；c o l o s s o m a b r a c h y p o m u m ；c b t c e l l ； i v 第一章细胞的寒害问题及其研究方法 第一章细胞的寒害机理研究进展 1 1 细胞的寒害问题及其研究方法 一寒害研究的背景与意义 寒害( c h i l l i n gi n j u r y ) 定义较早在植物学中被提出【1 - 3 ，是重要的逆境生理的 研究方向，特指热带或者温带生物在温度较低( 冰点以上) 的环境下无法适应并最终 导致死亡的现象，与冰点以下温度造成的冻害相g 别 4 9 1 。 对于寒害的机理，l y o n s 认为低温主要是影响了细胞膜成分的稳定【4 9 】， m o h a m e d 使用x 衍射技术对土豆在5 。c 下储藏时细胞膜膜脂相位的变化研究也指出 低温对细胞膜有直接的伤害【5 1 】；t o t t e m p u d i 等在对玉米幼苗的研究中发现低温导致 了线粒体功能异常，致使h 2 0 2 累积 s o bs e o n gh l 等使用透射电镜对8 。c t 黄瓜幼 苗的切片观察发现低温对细胞壁、核酸、内质网、线粒体、质体、核糖体都有明显 的影响【5 2 】；近年来，以阿拉伯芥( 一种抗寒植物) 为模式生物，对于低温诱导的 基因表达做了大量工作 5 4 】。但上述研究都是基于植物细胞，对动物细胞的寒害机 理研究尚未见文献报道。 l y o n sj m 等在1 9 7 0 年从番茄、黄瓜、甘薯等对低温敏感植物根部提取出了线 粒体，发现其呼吸率的下降同温度从2 5 度下降到9 1 2 度呈现线形相关，而当温度 下降至1 5 度时线形系数出现了背离。从低温抗性的植物花椰菜、马铃薯、甜菜等 植物根部提取的线粒体呼吸率在2 5 度到1 5 度整个下降区间都呈现线形相关。指出 低温敏摩眭植物的线粒体呼吸率在o 1 0 度区间受抑制的程度远高于从1 0 度以上得 出的线形系数的估算制，这一结果也同线粒体细胞膜中磷脂随温度的变化规律吻合 1 】。寒害不同于冻害，二者同属于低温的伤害，但是冻害侧重于从绝对低温在短时 舔索细胞静寒密黼题救箕磷巍舅法 溺癌鬻生秘瓣皇遵绥椽秘囊蠖凌畿豹羧坏搬，寒害辩怒德重予喜溢羧镑耱京羝瀑耀 麓中无法长鹈鸯存。寒害瓣磷究羼变较猿簿短，1 9 4 9 苹r o d e 拄s ，藏辩麓戮滚害戆熬 变感势经遴抒螂除数硬窥【4 一趣。联分冻褥剃寒害的努隈，一救鲍理论怒凉害在适避 低予正常雯锈隧蹩浚霞黎澈艨，鸯短薅翘斑捩蘧黯生物遮藏赣蘩秘辫，该澈褒一般 在o c 竣- v ；镬寒= 骞更多楚个稿费麓进较褥赛遮定义，凌奔穰鸯辫分耱耱霉鑫辫 爨，熬至竞垒正卷生存的激慈蓬匿爽，部分j 该溢髓邋& 镶物糖 鹄溉了纛法持续 囊谨戆特援+ 鞋雩窝一羧袋长，著蘸在褒凝蔓喾浚塞霸舞然嚣法正鬻簿激，运静蒋鼹 翁低溢褒害可以定义受鬻密，该溢塞一羧繇在转班生。 生物的寒密随题一盛怒焦物学中关注的个重要谦鼹。誊澄瞧辑漆侉为生陡在 绦馨拳装中豁韵黪，在一个较努瑟器翡稳激蓦f 嫒( 一簸潍搀蠢5 ) 下羲秃法缝续 生存，嚣嚣戮季誉为生翔寒骞褥究孛鲢个突崮龚登，拯憩浚速蠢鼗箍剐窘寒窖麓 礴正成因秘靛嫩机制，不懊怒冀浪性鱼类晶暴接广的一个龋耋要环节，要是对寒辫 逡生魏领域中广泛存在麓瓣象靛澡入戮襞。s e n n al a 藩在2 0 0 2 年避行蘧马叠释 鼹麴骧存礤党巾发瑷，褒遐煎熬骚齄懿滚移鬻要越过敝羹煞簿碍，爨踺爨有整熬 泺稃具有伤密的淋点以下晌冻害；二是在冰点以上海瀑过程中躲寒密。在降湿裂0 浚瓣过疆中，姨遽爨涅豹瑟淤毒滔搴蔑予缀愎建温。蕊程簿瀵歪l 液鹣避整中，嚣 论逶率浃浸，郝逡戏题骆豢添率豹臻显下黪。露鬟予0 凌1 枣露与援予菠1 势镑， 觅论降温速率翔何，存活攀瓣：羚都不显蓑。快速降温嚣张o 度与i s 虞酃保持1 小时 熬嚣潼搴要暌鬟蠢子缓疆辫滋f 键。不玫麴髓，滋凌俸为一令耋要煞垒貔鼹凌霾予， 籀俺寒调控生糖戈其是缨黢瑟谨翡器秘耄瀵垒他事 孛，整终为雯魏擎中戆基零翘 题被关注f 7 】，驻往懿研究茹燕中在高溢瀚生镌的影响方藤，如热激戳睡，在低瀵， 黪鼷是胁遥鼹漩邂生蘩瓣澎锻辫突避嚣鼯i 纛避鞍多，邃黧程低瀣下对童豁蕊滋，麓 鞠波送弱璃控蟹缀多瀚疆鬣褥探索。 在目前第i 避行盼研究中，辩于动秘瓣寒鬻述是一个来统一盼趱法，一艘隆瑰下 潍受c h i l l i n g 溯u r y ，系统髅鹾透还没瓷澎藏，冷落簿( c o l d - i n d u c e d ) 、玲馋餐 ( c o l d i n j u r y ) 、终滠麓羝剿激( h y p o t h e r m i cs t r e s s ) 方蕊熬磷究郡与寒蒋磺究趣美， 扶以往静磺究审可以总结感戳下一些蕊点； 2 第一章细胞的寒害问题及其研究方法 1 、低温能够降低细胞的新陈代谢速率，抑制大部分转录和翻译的过程，对 细胞周期产生阻遏作用； 2 、低温作用时间的长短和强度对生物体的影响不同，短时间温和低温的处 理可以帮助生物抵御不良环境的影响，但长时间和较低的温度对生物， 特别是离体培养的细胞将产生伤害； 在低温作用中，某些生物体会有一些特殊基因的表达增强，并可以产生 一类独特的冷激蛋白，发挥在低温环境中的独特作用； 在相当多种类的细胞中，低温可以诱导凋亡的产生； 二寒害的机理 1 、细胞寒害的主要路径凋亡 在以往的研究中，针对低温对生物的影响，特别是在低温诱导细胞出现的伤害 中，我们注意到低温往往导致细胞出现细胞质浓缩，边缘化，细胞皱缩，并导致标 志性的d n a 片段断裂现象，有很多的证据说明，在相当部分的低温诱导细胞伤害 中，凋亡是一条主要的路径。 凋亡，或称为细胞程序性死亡，表现为形态学和代谢的典型变化：细胞发生凋 亡性收缩，并且出现最重要和最具特征性的改变，c a 2 + m 孑+ 依赖性的核酸内切酶的激 活导致染色质d n a 在核小体连接部位端裂，细胞d n a 断裂为1 8 0 2 0 0 b p 为最小单位 的规则的单体或者寡聚体片段，染色质发生凝缩 8 1 0 】。这整个过程是主动的，依赖 于将死的细胞所合成的r n a 和蛋白质。要深刻理解和探究低温诱发细胞凋亡的问 题，必须关注几个重要的问题，包括低温诱导在凋亡通路中的地位，低温诱导对凋 亡中关键调控因予的影响等。 a 鞠t 通路 凋亡过程的发生有多种细胞信号通路的解释，如细胞内c e + 离子的局部浓度调 整变化【1 1 ，及氧化情况的变化【1 2 】，需要一系列半胱氨酸蛋白酶类( 属于c a s p a s e 家族) 的激活，c a s p a s e 的激活借助于级联信号的触发，最终导致磷脂酰丝氨酸外 翻至细胞表面，染色质凝缩和d n a 片段降解 1 3 。凋亡过程中，细胞膜结构保持了 完整，d n a 先断裂为片段，有别于细胞坏死过程中膜首先破裂崩解的情况。 幕一零雅藏豹幕替褥嚣及箕研究方法 壤湿鼹搬倪诱导镶亡鹩，要戮窕这一阚题，必缀对鳃骢蠲亡始髅号通路枣个 深入逢餐熬了瓣， 冀瑟搽究低漫这一匿黧胃麓懿蠡入点。 多秘璎化因素都可以诱发缨腿蛇塌亡，包括了生长霞予的去除，糖皮鹱澈索鲶 理，￥射线照射和巢些受钵豹活化，低溅围样也是一个诱发凋亡数熬簧困豢。 按照鹬亡翁诱发强豢，诱导主要鼓努为舞整辩辩诱导籁缀魏内部嚣条逶径， 必须说明这黼条途径不熊概括所有的辋亡机制。其中辨部诱导又可以称作受体分馨 通路，蕊内部诱导又称为线粒体介导通路。通豢意义上细鼹内部刺激的因素主婺蠢 不霹迸熬基戮簇凌，魏内貔2 + 熬舅霉舞怒，或毒是窝浓度的戴塞交蕊破嚣等。数上 这些因素即袋了礴亡前体摄自b c l - 2 家族成员( 如b a d 甜b a x ) ，该畿蛋皂螫台到跤 粒体膜上，使线粒体膜通逑性加大，释放出细胞色豢c ，最终诱导c a s p a s e 活纯， 引发璃亡 1 4 ，l 趣。 辫1 - 1 受催舟等的澜亡信号通路葶f 舀c e l la n dm o l e c u l a r b i o l o g y , 3 埔g e r a l d 鞠嘴，j o h nw i l e y & s o n s ，i n c 2 0 0 2 ) 缩麓辩韶诱罄( 如鬣1 - 1 所示) ：当t n f 与t n f 受体结合( t n f r l ) ，激潜的 燮俸与两种不阍的细胞质蹙体蛋白结合( t r a d d 和f a d d ) ，并且和胱冬酶8 前体 4 第一章细胞的寒害问题及其研究方法 蛋白共同在细胞膜内表面形成一个多蛋白复合物。t n f 受体的细胞质结构域， f a d d ，t r a d d 通过被称为死亡结构域的同源区域相互作用。胱冬酶8 前体和f a d d 相互作用的同源区域称为死亡执行结构域。一旦形成这一复合体，二个酶前体分子 相互切割对方形成一个活化的胱冬酶8 分子( 由4 个肽链组成) 。胱冬酶8 作为一个 启动复合物切割下游的执行胱冬酶类来进行凋亡作用。需要指出的是，t n f 和 t n f r l 的相互作用也可以激活另外一条信号通路，该通路的主要作用是增强细胞存 活能力，而不是自我解体 1 6 1 。 内部诱导途径( 如图1 - 2 所示) ：各种细胞内胁迫因素都可以导致b c l 2 蛋白家 族前体蛋白因子，比如b a d 或者b a x 插入到线粒体的外膜中。由于这类蛋白的插 入，导致了细胞色素c 从线粒体内膜中释放出来，一旦进入到细胞质中，细胞色素 c 就和细胞质蛋白a p a f - 1 和胱冬酶9 前体结合成为一个多原复合物。胱冬酶9 前体 在a p a f - 1 的协助下通过构象的改变激活了水解能力，再通过切割胱冬执行酶类，来 进行凋亡应答 1 6 1 。 第一章绷胞的撵镥问题投其研究方法 霾l 。0 线鞍镩分簿豹孺亡蔼号邋疆( 引交c e l la n dm o l e c u l a rb i o l o g y , 3 ” g e r a l dk a r p ，j o h nw i l e y & s o n s ，i n c 2 0 0 2 ) 上述辩菸途径著 独立，霉塔逶道c a s p a s e 进行涟遥。霉实上b c i - 2 家族中抟 b i d 蛋囱必须经过c a s p a s e 8 豹棼嘲激潦囊才其鸯使绞载体释敖螭蕊色素c 翁髓力。 与此相对的嫩，线粒体释放细胞色索c 以及其他因予也可以不通过b c l 家族蛋白的 乍舞。滋确骶条途径的关鞭经蠢独立漤爨是穗黠的。 豫了跌置两条逶臻终，还存在j n k 濑酶通鼹，跌疑鹰缀飚毒豢譬潦巴壤骢释放 含丝氨酸鬣囱酶和其他裂解成分颗粒的蟪径 1 7 1 。 从注有驰礤究擐道袋糟，爨避述懿渲号遥路显然帮浆隧确，髓大多是篓子体态 邵境，逶过细缒之阕，或嚣壤麓困予与绷趋受体结台泉弓l 发，却没霄撼体井墙葬缫 胞在受到外部刺激后如荣触发凋亡商一个明确的解释。屈然已经报邋了上百个基因 与援亡的日l 笈、执行、诵羟糨关，宠整熬撼亡撬溪帮秘洙揭示。在斑掩嚣蒙诵亡分 母途径中，i 螽予俸步 珞养镶稳所整环臻熬攀一犍，是磷产生部分维魏袭嚣会产生f a s 糯悻( 躐者耩旅游离体) 与接触细胞的f a s 受体相互俸厢，这种现象还投有明确的 搬导。因此，通过线粒钵介蹲的售号邋鼹在这一实验然系下熨鸯说磁力。当然，程 蠢然环甓孛，惫粪整露麓调控系统菠褥2 条途经爵煞褥嚣雩存在。 b 礴亡瀵程的毙个煎黎褥控殴子 参与凋亡的缨鼹波嚣予众多，毽捂了壤麓器、懿类、蛋爨、基潮糯离子浓发游 笛，受戮广泛关注豁主餮农t 线粒体j a c o b s o n 等谯1 9 9 3 年发现出于缺失线粒体d n a 造成的细胞凋亡可以 被b c l - 2 蒙羧蛋叁鼹麴裁f l 麓。线羧体作必诱导礴亡懿茨键隽点，掰缀照色索e 瀚 释效是巍线羧髂膜通透援改变压。 c a s p a s e在各种参与凋亡韵生物漓性物质中，下游信号储递以及凋亡执行分 予，c a s p a s e ( c y s t e i n e a s p a r l a t e p r o t e a s e ) * 髋冬酶焱羧鬣爨努子起饕熬簧侔臻。虢冬 酶有一个起骥纯律霜豹c y s ，著在簸熬靶檬a s p 处落裁鬣自质 1 3 1 。 b c 飘- 2 豢旒蛋自b c b 2 家族有许彩成员，一部分超到了结合线粒体膜厝促使 奠通透 生致燹的终廷，霹妫部分爨可戳邋过窝c a s p a s e 辖互捧蠲起越随运鹚亡熊 第一章细胞的寒害问题及其研究方法 作用【1 4 ，1 5 。 r o s 在这寒害一过程中，低温作为唯一改变的外界刺激条件，究竟是如何作 用于凋亡的信号通路的，还不是很明确，有一种可能的解释是，温度作为细胞内各 种酶类的调节因子，可能触发在正常温度下不表达的酶类活性，呼吸链的正常传递 与温度密切相关，而呼吸链的载体正是在凋亡中占据中心地位的线粒体，通过对酶 类和呼吸链的影响，低温信号可能直接传导给了线粒体，使其释放细胞色素c 等物 质，这其中的中转信号很有可能是活性氧自由基 1 9 1 。 钙离子胞内钙离子浓度的失衡是引起细胞凋亡的一个重要原因f 1 1 1 。 铁离子低温可以引起氧化磷酸化的降低，并累积n a d h ，由于0 2 和底物仍 然存在，呼吸作用( 电子传递链) 却减弱，因而氧自由基( r o s ) 在细胞中过度累 积。但是r a u e n 等在肝实质细胞和肝内皮细胞低温诱导后复温的实验中，并没有发 现0 2 7 h 2 0 2 显著升高，而是细胞内的铁离子浓度发生了关键性的变化，因此在自由 基介导的冷害中，体内离子浓度的内稳态很重要，细胞内可螯合铁离子浓度的快速 升高很是造成自由基累积的重要原因，而非o s h 2 0 2 浓度的变化，在该类细胞的实 验中，使用铁离子螯合剂可以有效抑制凋亡作用。并且，温和且短时间的低温诱导 甚至可以降低细胞内r o s 的累积 2 0 。 表l - 1 凋亡与坏死的主要差异 细胞皱缩 细胞肿胀 细胞器、细胞膜完整 细胞器破坏 周边细胞迅速响应，无炎症反应细胞裂解释放内容物 生化特征：d n a 断裂片段 具有炎症反应 凋亡作为一种在生物界广泛存在的现象，在低温诱导的寒害中出现，究竟有何 生物学意义被研究者关注。凋亡过程中，细胞中各种生物特征分子的利用和代谢是 有一定的规律的。所有细胞都有通过凋亡引发死亡的通路，并要求凋亡细胞合成某 些r n a 和蛋白质，但这条通路只被特定刺激所激活，在寒害研究中，这一特定刺 激就是低温信号。由于在真核细胞的发育过程中，无用的细胞可以在胚胎发生、变 态和组织更替时被清除，这个过程就称为细胞程序性死亡。细胞凋亡是一个受到严 7 第一章细胞的寒害问题及其研究方法 i i i i i i i 密调按匏生余现象，恧这一瑗象是套茭生物学意义鹣，鬻温褴鱼类鲴腕在低温条斧 f 凝亡，纛不是壹接坏髭( 髑亡与坏琵的圭要蒺异凳表1 - 1 ) ，可能暗示餐喜濑牲 鱼类程低瀑逆壤中的一秘生物学蠡我像护爱应，遭避帮分缨鼹的耀亡来达翻彗嚣雩懿 毅陈代谢、糖经传递等方嚣懿稳定，始莱在短对期复涅到逶宣渥震剡以存活下去， 藤不是整体的突然瓢亡。缨鼹润亡帮缨戆程序悛死亡这稻令概念在稷多场合是霹戬 互换锼用，但如果严捺区分，甥臌程黟性瑟亡楚锋对生物整体戆生发、分讫、发育 中对姆定纲胞的调掇性毁灭，两缨愍弱亡则更多裘袋款蹩细黪垂势姨正常状态遴入 自发死亡的过程。在寒害这一愈题中，如暴从整体礤究，使用绍黪程孝一睦巍亡更台 遗，藤作为磺究乎台魄细胞本身来说，凋亡定义的馒鼹熨贴切。 2 、细胞寒密的其他途径 虽然有越来越多的证据说明寒害遵循着凋亡的些典型规律和路径，但作为一 种自然界独特韵生物学现象，寒害是否等同于低温诱发凋亡，目前看来还膏很多其 袍的因素需要被认识和研究。 缁脆杰常酌生存增殖必须满鬣两个条件，结构和功能的完整性，两者又彼此关 联，任何一方被破坏，势必弓l 起舅方的异常，从而最终导致细胞的死亡。结构的 竞整，爸攒了遗传物质d n a 的芷常，各缬胞嚣的完备，细胞膜的完熬：功能的完 整，雹括了细魏转录r n a ，翻译、修饰、正常定位并折叠蛋自质，呼吸链畅通无阻， 薪藩代谢功能芷常，对物质和信怠的输入输出调控有序。在低温诱导的寒害中，细 藏呈瑰出各个罄螽酶交纯，英中部分与凋亡现象密弼关联，秘也有很多独立事件和 逶路翡存在。 a 低潞旃动物鬣瞻影响的多个角甓和骚面 豫了将凋亡作为寒密的条理解途径之外，由于温度作为环境因素中非常重要 韵一个调节因子，它对细胞产生的寒害影响还有更直接的作用。温度作为生物学的 个基本环境因子，有着非常显著影响生物生理状态的作用，每种生物都有自己的 最适生存温度，同对也有一个温度的范蕊可以耐受。温度对细胞周期的影响很大， 在正常生理温度中进行增殖生长的细胞被蠢于个胁迫低温时，原本规律的细胞周 麓会被干撬甚至终止。已有研究发现，当很多种哺乳动物细胞外部环境从3 7 度降温 8 第一章细胞的寒害问题及其研究方法 到1 6 2 0 度( 温和的低濑) ，细胞就无法完成g 2 期m 期的跃迁。同时，g 1 期和s 期并没有在这一温度下阻断，藏在进行的有敛分裂媳可以继续。同时还发现，如果 将缀施短暂( 1 h ) 霪于菱器g 烈懿低涅璎臻孛( 莲一1 0 凄 ，将萼| 起窝g l 期s 麓转纯豹 抑制，并出现很高的有丝分裂( 最高8 0 ) 同步化 2 1 】。 有趣的是，徽多寒害细胞的生理变化类似于热激变化，这类实验主要是基于哺 瑰动物细爨提是的，在这类实验中，3 7 是令基准湿度。篷据1 ) 蛋是覆数变毪 和解聚现象增加；2 ) 细胞周期变慢，尤其是处于g 1 期的细胞敏感；3 ) 对转泶和 翻译过程的抑匍，使总蛋自的合成量明显下降；4 ) 对细胞骨架的破坏作用；5 ) 细 胞避透性增加，扶嚣舞崴了胞瞧n a + 、瓣离子浓度升蹇( 同时迩转瓣善k + 离子浓度 的下降) 。低温同时也可以改变磷脂双分子膜的结构，比如表面相做的变化，反映出 耱潞酸成分的变动f 7 】。 低温划激的强度不慝，可| 冀触发缎瞧不爨戆应激反应，霹娃激活撼亡，迄哥戳 导致坏死。由低温诱导的细胞应激反应的证据包括了复温后产生了h s p s 蛋白 【2 2 - 2 4 ，p 3 8m a e 激酶静磷酸纯【2 珏b 磊体鬣自瓤细胞核向细胞旗易位【2 6 】。低温 对细胞凋亡的诱发作用同时决定于2 个因素，滠度达到的最低点和低温持续鲍时阕。 g r e g o r y 等谯1 9 9 4 年发现b u r k i t t 淋巴瘤细胞在1 下暴露3 0 分钟就开始凋亡，而在 2 5 c 下这个过程需饔毒小辩才髓这餮阉祥麴效莱。翠精蠲亡酶效应不但取决于低温的 条件，同时也取决于细胞系的种类，细胞内钙翅子的水平，以及细腿骨架的稳定性。 细胞的坏死发生在非常剧烈的低温处理中，主要通过冰晶的形成等机制直接破坏细 骢骥巍缨鼹器。 到目前为止发现的低温处理后表达的基因主要如表所示，在温和低激 乍月条件 ( 针对哺乳动物) 下( 2 5 - 3 3 c ) ，只有很有限的基因表达被诱导；而在低于5 0 的 聂潼条臀楚理下，涂了撼亡特异缝蛋叁鏊霆，箕德基蕊静表遮都浚蠢茇现上调。翔 同热激发应一样，很多被诱导的基因( 包括一部分h s p s 蛋白基因) 在低温处理过程 中并没有增强表达，而是在复温这个确认过程中，才表达出诱导的效应2 8 1 。 俸先壤葵细鼹熬调节因子，簿糕瀑发对绥缒懿俸掰套瑟瑟挂，阕祥是在熬带髓 类当中，降低温度可以调节斑马鱼胚胎细胞系的细胞周期，将斑马照胚胎细胞系的 培养温度从3 0 。c 降低到1 5 c 培养2 5 3 0 天后，细胞周期调节因子c d c 4 8 的合成湿 第一章细胞的寒害问题及其研究方法 著增加，通过後c 。寒端璐氨酸磷酸纯，扶瑟使缎鼹在恢复正常培养温度螽瑙蓬熊力 翅强 2 9 】。蠢圈为熬带鱼娄熬自鲳缁脆当漫壤下降裂i o 。c 这一貉彝 氍湿结养5 天居， 复瀑至3 2 。c 放置1 2 ，、孵居爨理了舞鼗的璃亡凝象p o 。这蓠缝实验懿现象可戳看 出，憨逡低滠斡体蹙鼓阉，瀑度降低酌耀度，对于复温爱缀戆可麓有截然稳反酌俸 弱。在糖经狙黪部手术中，炎傻手术对缨鼹懿撰害尽胃裁减小，遗常会采雳适当降 低涅度( 2 9 3 2 ) ，该温度霹以鸯效黪止缨胞赘躅亡，偿舞鬃在撩俸：遭程中，缝子 3 04 c 以下躬时闽过长，则绥熙塌亡魄e 搴丈辐度上舞，说明瑟使是非常温黪靛 豪温 诱导，如果黩阑累积足够，困样可以壹接引发缨缒撼亡的产生。 冷诱导基因表达改变的途径缓多，主要毒以下方蠢： 1 、对于转录葶b 翻译的普遍掺制终鼹； 2 、搀制了特定r n a 的降鳃，主要用于合戏冷激蛋白蠢a t p b s w 3 1 ： 3 、增强了邋过冷激蛋自c i r p 会导麴特殊r n a 的转最【3 3 b 4 、增强了前体m r n a 的切割作用【3 2 】： 5 、增强了另一种冷激蛋白5 端作为走导序列的翻译髂鼹f 3 4 1 对于低滠处理后皤复常温后基因表达改变的机制假设枣3 糟： 1 ) 低温处理可能引发了细胞的应激反应( 比如蛋白质变性或嚣m a p 激貔磷酸 化) ，丽且彻底干扰了转录和翻译的过程，因此低湿应激蛋白的产生也被摭劁，壹到 复温后才能表达，这机制可以解释在人纤维细胞和h e l a 缨腿在4 冷激复涅蜃 才表达由h s f 一1 介导诱发的h s p 7 0 和h s p 9 0 蛋白，这些实验中低温诱导了h s f - 1 三聚体的形成，而同h r e 结合以及h s p 表达则是在复温以后进行；这一极剑同槎 可以解释人支气管内皮细胞由寒冷诱发i l - 8 的表达，这类细胞在暴露子1 v 时p 3 8 m a p 激酶的酪氨酸磷酸化但却没有表现出1 7 3 8 依赖性的i l 8 m r n a 表达调离和缮 白的分泌，赢到复温歪3 7 。c 才出现f 2 4 ，2 5 1 ； 2 ) 细胞的复温也有可能是产生了自由基或者其他有毒害作用的代谢产物，从丽 引发了应激反应，h s f 一1 的只有在复温后活化符合这假设1 2 4 】； 3 ) 假设被用来解释一类特殊的h s p 蛋自，a p g 1 和h s p l 0 5 的诱导过程。在 鼠肉瘤细胞中，a p g 一1 和h s l 0 5 的诱导产生并不是发生在通常的热激反应中( 从 3 7 度提升至4 2 度) ，而需要细胞先在3 2 度中孵育后再加热到3 9 度。温度的调节从 第一章细胞的寒害问题及熊研究方法 3 2 至4 2 度帮觚3 2 至3 9 度都可以增强h s f - 1 和a p g 一1 寝动予嚣域静h s e s 缀台， 但是，鼠