（细胞生物学专业论文）鱼类融合抗菌肽重组表达载体构建及蛋白表达研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 内源性的抗菌肽是天然免疫的重要组成部分，抗菌肽以其广谱的杀菌作用、高 效的抗菌活性、靶菌株难以产生抗药性以及天然、安全等优点，有潜力开发成为具 有一种优质、高效、无公害、无残留的新型天然抗生素，应用于海洋水产动物病害 防治。 论文第一部分设计并合成了三种海洋鱼类抗菌肽m o r o n e c i d i n - h e p c i d i n - p l e u r o c i d i n 融合基因的全序列，在设计过程中考虑了外源基因在原核、真核表达系 统中表达所需的一系列因素。成功构建了融合抗菌肽基因的表达载体，包括酵母真 核表达载体和原核表达载体，分别在酵母表达体系中和原核表达体系进行表达，以 期获得高活性、低成本的水产动物抗菌制剂。 论文第二部分对河豚的t l r l 胞外区进行了原核表达研究，同时采用改良的重 叠延伸p c r 方法，成功获得鱼类抗菌肽h e p c i d i n 与t l r l 的胞外区相融合的重组分 子，并构建了重组表达载体，实现在原核表达系统中的表达。研究工作为利用模式 识别受体高效识别病原相关分子模式的特点进行构建能够泛特异性识别并富集于病 原菌的高效抗菌肽，打下了基础。 关键词：鱼类抗菌肽t l r l 基因合成原核表达真核表达 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t e n d o g e n o u sa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sa r eo n eo ft h em o s ti m p o r t a n te f f e c t o r si nt h e i n n a t ei m m u n i t y a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sh a v eab r o a d - s p e c t r u ma n t i m i c r o b i a la c t i v i t y a n dt h eb a c t e r i aa r eh a r d l yr e s i s t a n tt ot h e m s oi tp r o v i d e san o v e ln a t i v ea n t i b i o t i ci n p r e v e n t i o na n dc u r eo f t h ef i s hd i s e a s e s i nt h ef i r s tp a r to ft h er e s e a r c h , i nc o m b i n a t i o no ft h ec o i i t m o nc h a r a c t e rb e t w e e nt h e e u k a r y o t i ca n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m ，w ed e s i g h e da n ds y n t h e s i z e dt h ef u s i o n g e n e ，c a s c a d ec o n n e c t i o no ft h r e em a r i n ea n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ，w h i c h i sc o i n e da s m o r o n e c i d i n h e p c i d i n - p l e u r o c i d i n a f t e rs u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dt h ee u k a r y o t i ca n d p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r sc o n t a i n i n gt h ef u s i o na n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ，w ee x p r e s s e d t h ef u s i o np r o t e i ni nt h ee u k a r y o t i ca n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m st oo b t a i nan e w a n t i m i c r o b i a lb i o p r o d u c t i nt h es e c o n dp a r to ft h er e s e a r c h ，w ee x p r e s s e dt h ee x t r a c e l l u l a rp a r to ft l r l p r o t e i ni np r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m m e a n w h i l e ，u t i l i z i n gt h em o d i f i e dm e t h o d so f o v e r - l a p p i n ge x t e n s i o np c r , w ec o n s t r u c t e dt h ef u s i o ng e n eh a r b o r i n g t h eh e p c i d i ng e n e a n de x t r a c e l l u l a rp a r to ft l r lg e n e a f t e rr e s t r u c t u r i n gt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw h i c h w a si n s e r t e dw i mt h ef u s i o ng e n e ，w ee x p r e s s e dt h ef u s i o np r o t e i ni nt h ep r o k a r y o t i c e x p r e s s i o ns y s t e m t h i sr e s e a r c hp r e s e n t sa n o v e lm e t h o dt og a i ne f f i c i e n ta n dt a r g e t i n g e f f e c ta n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s k e y w o r d s ：f i s h ；a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ；t o l l 1 i k er e c e p t o r - 1 ( t l r l ) ：s y n t h e s i so fg e n e ； e u k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n i i i 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得堑鎏盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 靴敝储鹕哺中辩醐。7 “月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘鲎有权保留并向国家有关部门或机构送交本 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 旅科云 签字日期：1 “肌7 日 导师签名： 惦猡 7 日 浙江大学硕士学位论文 致谢 生活即使波澜不惊，也在一天天中前行。无论酸甜苦辣，这三年必定是生命中 不可磨灭的一份深刻记忆。也将在今后的人生中，不断鞭策我成长与前行 感谢项黎新副教授和邵健忠教授在这三年间对我的悉心教导和无私教诲。论文 的选题、研究方案的设计、实验的实施、结果的分析以及论文的撰写无不倾注了两 位导师大量的心血。两位老师严谨求是的工作态度、勇攀高峰的科研精神、忘我科 研的献身热情、注重学生全方面发展的教师风范，留给我最深的映像，我将铭记终 生! 在论文完成之际，向项老师和邵老师致以最诚挚的谢意和最衷心的祝愿! 感谢实验室各位兄弟姐妹对我的帮助和鼓励! 首先感谢董伟仁师兄，是你最开 始把我带入实验的流程，对我悉心指导，帮助我走过实验的一个个难关，参与我实 验的整个过程，每当我面临实验的挫折时给予我信心和指导，师兄踏实的处事态度 和遇事积极乐观的精神是我该好好学 - - j 的地方感谢温轶师姐、彭博师姐、刘慧慧 师姐、巩永凤师姐对我的关心和帮助。感谢师姐武小媛、郦佳慧、黄艳丹、孟真、 胡瑜兰；感谢师兄方玮、陈烨、林爱福、金红建；感谢金阳、张瑞鹏、张晓蕾、潘 若浪、申佳、王浩、王渠龙、潘萍萍、张卉、熊燃、顾一峰、张晓瑜、卢亿齐、潘 新民、于岱永，感谢你们。要感谢的人实在很多，在这里，再次深深地感谢实验室 这个大家庭里所有的兄弟姐妹，这段岁月我将铭记于心，祝愿大家以后工作顺利、 生活愉快。很幸运，遇到这所有的人；很愧疚，常要辜负很多人的关心。 感谢我最亲爱的父母，这么长时间以来对我，尽一切努力来为我。你们无私的 爱给了我更多勇气和力量，一直以为自己都做得很不够，很多话未曾说出1 ：2 ，借这 个机会，向亲爱的爸爸妈妈道声感谢。我会努力来回报你们的爱。 感谢所有关心我的朋友，何其幸运，得到众多朋友的关心，也是这一路支撑我 到现在的精神支柱 浙江大学硕士学位论文 第一部分文献综述 抗菌肽的研究进展 l 抗菌肽的概述 抗菌肽是生物有机体用来抵制外来入侵病原体，具有抗菌作用的一类小分子 蛋白质。天然的抗菌肽可能代表了真核生物在进化上对抗细菌、原虫、真菌和病 毒首次成功地产生了化学防御【l 】。抗菌肽在多细胞生物中提供了一个有效防御 外界感染的协调反应，是连接先天性免疫和获得性免疫的一个重要桥梁，同时也 是许多生物先天性非特异性防御系统的重要组分 2 。 抗菌肽由天然基因编码，一般由少于1 0 0 个氨基酸残基组成的多肽。各种抗 菌肽都有其特定的广谱抗菌谱，一些抗菌肽能对抗多种微生物，包括革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌，真菌，寄生虫，被膜病毒，甚至是肿瘤细胞。自1 9 8 0 年瑞 典科学家b o m a n 等首先从惜古比天蚕( h y a l o p h e r a ) 蛹的血淋巴中分离出的第一 个昆虫抗菌肽c e c r o p i n 开始 3 】，人们陆续从微生物、植物、动物体内鉴定出上 千种抗菌肽。由于抗菌肽独特的性质，近年来已成为分子生物学、免疫学研究的 热点。抗菌肽的分离纯化、氨基酸序列的分析、蛋白质结构和功能的关系、作用 机理也有很多报道。部分抗菌肽序列收录在意大利t r i e s t e 大学的抗菌肽数据库 中( h t t p ：w w w b b c m u n i v t r i e s t e i t t o s s i a n t i m i c h t m l ) 。 2 抗菌肽的来源和分类 几乎全部较高等真核生物都能产生抗菌肽的一一包括植物、无脊椎动物、脊 椎动物、真菌、太古生物 4 】。抗菌肽在各物种中的种类，这里不再一一赘述。 由于抗菌肽来源的广泛性和作用的多样性，其分类变得相对困难。现行的分 类方法中，有依据抗菌肽分子中某些氨基酸的含有而进行分类，有依据抗茵肽的 二级结构来进行分类的。 基于对最基础结构基序的相似分析，将真核生物的抗菌肽主要可以分为两 类：阳离子抗菌肽和非阳离子抗菌肽阳离子抗菌肽，作为抗菌肽的主要类群， 包括了d e f e n s i n s 和c a t h e l i c i d i n 两大类。而非阳离子抗菌肽种类较少，其活性也 相对较弱。非阳离子抗菌肽主要由三个亚家族组成：牛和人类的感染渗出物中的 浙江大学硕士学位论文 神经肽衍生分子【5 】；人类血液和尿中发现的d e r m c i d i n ，其富含酸性氨基酸的分 子 6 ，7 】；脊椎动物氧结合蛋白的肽衍生物 8 ，9 】。 此外，细菌也能产生抗菌肽，用于提高微观环境中自身的生存能力和竞争能 力。细菌中的抗菌肽最常见的是b a c t e r i o c i n s ，这是一类由革兰氏阳性细菌产生的 大小为1 9 5 8 k d a 的多肽。其目标是同生态位的其他临近相关有机体，在很多人 源病原体中也存在这一现象 1 0 】最为常见的b a c t e r i o c i n s 是由乳酸菌分泌的 l a n t i b i o t i c s 。很多b a c t e r i o c i n s 经过翻译后修饰，使得肽内含有稀有氨基酸残基 【1 1 】；如l a n t i b i o t i e s 内含有的稀有氨基酸是羊毛硫氨酸。b a c t e r i o c i n s 能编码到质 粒上 1 2 ，1 3 ，易于基因的传播。这个特性能可用于人类疾病治疗或应用于食品 安全 1 4 】。 3 抗菌肽的特性 3 1 抗菌肽的理化特性 天然抗菌肽一般分子量较小，通常由少于1 0 0 个氨基酸残基组成，水溶性 好。迄今为止发现的抗菌肽大部分是碱性的，表现出较强的阳离子特征，也有小 部分是酸性抗菌肽。大部分抗菌肽具有热稳定性，1 0 0 c 下加热1 0 1 5 m i n 仍能保 持活性。很多抗菌肽具有较大的离子强度耐受性，在较高或较低的p h 值下均具 有较强的抗性。此外，还有部分抗菌肽能抵抗蛋白酶的作用。 3 2 抗菌肽的结构特性 通常抗菌肽的一级结构具有如下特征：由3 0 多个氨基酸残基组成的肽链， 其n 端富含阳离子型氨基酸，c 端常富含非极性氨基酸。这一结构特征使抗菌 肽具有表面活性剂活性。另外，一些天然的抗菌肽c 端往往酰胺化，可能与抗 菌肽的广谱抗菌活性有关有实验表明，c 端的去酰胺化会导致抗菌活性降低。 抗菌肽能在一定条件下形成o 【螺旋和d 折叠。抗菌肽的0 【螺旋具备两亲性，是 抗菌肽对膜作用的重要基础。 3 3 抗菌肽的生物学特性 3 3 1 抗菌作用 抗菌肽最重要的一个功能是抗菌作用，它能有效杀灭革兰氏阳性菌、革兰氏 阴性菌以及真菌，具有高效的抑菌和杀菌功能其特点主要在于：抗菌谱的广谱 性，各种抗菌肽有其较为独特的抗菌谱，这可能与各种抗茵肽的成分和空间结构 2 浙江大学硕士学位论文 相关，广谱性表现在同一种抗菌肽对多种细菌或真菌有效；高效，在抗菌肽的作 用浓度下，它能快速杀灭细菌，大多数抗菌肽都能在5 m i n 内引起细胞的死亡； 作用针对性好，可以选择地作用于原核细胞、肿瘤细胞，而对正常细胞没有毒害 效应，这为抗菌肽的放心使用提供了可能；细菌无法产生耐药性，传统抗生素的 使用后导致细菌产生耐药性，对抗生素的继续使用提出了挑战，人们只能不断发 现和使用新的抗生素，这加速了细菌的进化，而抗菌肽则不会有这种麻烦。 3 3 2 抗病毒活性 抗菌肽对乙型肝炎病毒、感冒病毒、疱疹病毒等具有抑制作用。天蚕素和蜂 毒素可以在亚毒性浓度下抑制艾滋病毒h i v - 1 基因表达，减少h i v - 1 的增殖【1 5 】。 3 3 3 抗肿瘤活性 由于肿瘤细胞生长旺盛，生长速度很快，导致细胞骨架系统不成熟，没有正 常细胞发达的细胞骨架系统，使得抗茵肽容易插入细胞膜，形成离子通道，最终 导致肿瘤细胞死亡。c h e n 1 6 等研了天蚕素b 、b 1 、b 3 的抗肿瘤作用机制。 实验通过将三种抗菌肽作用到体外培养的肿瘤细胞，发现三者都可使细胞膜溶 解，微管崩解，导致细胞皱缩，甚至死亡。证实抗菌肽不仅可以通过使细胞膜发 生穿孔，还可以破坏微管的正常功能。虽然抗菌肽对肿瘤细胞和正常人体细胞的 细胞骨架均有一定损伤，但正常细胞的骨架系统完整，修复快，不会造成不可逆 损伤。肿瘤细胞则由于骨架系统不完整，经抗菌肽作用后，得不到及时修复，最 终导致死亡。抗菌肽的这种特点与传统的放化疗药物的强烈副作用相比，具有极 大的优势，有望在接下来进入临床。美国马盖宁制药公司现已开发出m a g a i n i n i i 、m a g a i n i n i i i 两种人工合成抗菌肽，进入临床i i i 期研究，用于治疗肿瘤。 3 3 4 抗寄生虫活性 抗菌肽可有效杀灭一些能引起人类及动物寄生虫病的寄生虫，如疟疾、莱什 曼病等。目前发现，合成的天蚕素蜂毒素杂合能作用于莱什曼原鞭毛虫的细胞 膜，破坏膜电势，提高细胞膜的通透性。昆虫抗茵肽对疟原虫发育的不同时期有 不同的作用，主要对疟原虫的卵囊期和子孢子期造成明显损伤 1 7 】。 3 3 5 其他活性 抗菌肽能刺激纤维母细胞、淋巴细胞和血管内皮细胞的增殖，加快创面愈合 【1 8 】。还具有抗溶血活性、胚胎毒性、精子作用、神经毒性等生物学功能。抗菌 浙江大学硕士学位论文 肽还与免疫反应的调节相关，提高免疫活性。能干扰其他宿主免疫分子如 l y s o z y m e ，以协同方式促进细胞溶解。多种抗菌肽对t 细胞、单核细胞、中性粒 细胞等一些特定细胞具有趋化性，会影响巨噬细胞的发育。h b d 3 ( h u m a nd d e f e n s i n ) 和h b d 4 活化肥大细胞，增强皮肤血管渗透性。抗菌肽c a t h e l i c i d i n 介导抗炎症反应，这种功能依赖于功能性t l r 4 的存在。猪的p r 3 9 还具有促创 伤愈合、自细胞趋化以及促血管生成等功能。抗菌肽还能帮助牙龈上皮重建。 4 抗菌肽的作用机制 到目前为止，对于所有抗菌肽的作用机制并没有一个完整全面的机制用于解 释一切问题。关于这方面，很多学者提出了各自的看法，主要存在细胞膜损伤机 理和胞内损伤机理两大理论。抗菌肽的主要是作用在细菌的细胞膜上，通过破坏 膜的完整性产生通道，造成细胞内容物外泄而死亡，这一说法更具有说服力。有 多种模型用于说明d e f e n s i n s 和阳离子线性肽的通道形成或破坏细菌的细胞膜的 过程 1 9 2 0 。然而随着研究的深入，科学家发现并不是所有抗菌肽都是通过作 用于细胞膜来发挥其抑茵作用的。不同类别的抗菌肽由于结构组成不同，其作用 机理可能并不一样，不能用统一的模型来解释。 4 1 膜结合型抗菌肽抗菌机制【1 】： 要在细菌膜上形成通道而杀灭细菌需要三个主要步骤：抗菌肽结合到细菌的 膜上，进入膜，形成通道。通道的形成会导致细胞内容物的泄漏，使细菌致死。 抗菌肽必须穿越富含脂多糖的革兰氏阴性菌的负电荷的膜表面或富含酸性多糖 的革兰氏阳性菌的负电荷的膜表面【2 1 】。很多情况下，目标微生物的代谢活性起 着关键性作用【2 2 。 抗菌肽作用于细胞膜的机制主要有以下几种假说：“地毯”模式 2 3 ，2 4 ，“桶 板 模式 2 5 ，2 6 ，穿孔模式 2 7 】，去污型膜溶解机制 2 8 ，2 9 常见的“地毯”模型是在实验的基础上提出的，该模型认为阳离子抗菌肽和 细胞膜上带负电荷磷脂的头部结合，平行排列在细胞壁表面形成类似“毡子”的 结构。阳离子抗菌肽的疏水部分并不插入细胞膜，但在疏水作用和分子张力作用 下改变细胞膜的流动性和厚度，从而在细胞膜上出现瞬时孔洞，导致细胞质外渗 或抗菌肽渗透到细胞质中，严重时同样会引起细胞膜崩解，导致细胞死亡最近 的研究发现，有些膜结合抗菌肽并不是通过在膜上形成孔洞而导致细菌死亡，这 4 浙江大学硕士学位论文 些抗菌肽是直接进入到细胞内部，然后通过抑制靶细胞d n a 、r n a 、蛋白质的 合成而导致细胞死亡 在“桶板”模式中【2 6 ，3 0 3 3 ，抗菌肽定向跨膜插入细胞膜，聚集形成一个 离子通道。 在穿孔模j 2 7 ，3 4 ，抗菌肽的按照平行于脂膜的方向靠近磷脂双分子的头 部。这时，螺旋的亲水端暴露于亲水磷脂头部和外层水相，而螺旋的疏水面埋藏 到膜的疏水中心，使得折叠过程的自由能最小化。聚集的肽到达一定程度，局部 浓度增加膜表面的曲率，形成一个环形孔洞。 去污型膜溶解机制 2 7 ，2 9 】认为，抗菌肽肽铺在膜的磷脂表面，下一个步骤 是肽聚集导致局部形成足够浓度，肽的双亲性使得它们能像去污剂一样瓦解脂 膜，成为小碎片 还有其他的模式，如s i n k i n gr a f t 模式【3 5 】，分子电穿孔【3 6 】，虽然这些模式 没有在这个领域引起足够的重视，但是在解释一些抗菌肽的抗菌机制时非常有 用。在分子电穿孔模式中，抗茵肽导致一个穿膜的电势差异，电穿孔形成通道 4 2 非膜结合型抗菌肽抗菌机制 抗菌肽一旦穿过质膜，进入细胞，便可通过多种方式作用于细胞中的组分。 它可能与d n a 相结合而阻碍d n a 复制、抑制r n a 合成、影响蛋白质翻译， 最终导致膜蛋白合成受到抑制；通过干抑制肽聚糖的生物合成，破坏细胞壁的再 生，影响细胞正常生理活动，最终导致胞内损伤直至细胞死亡 有些抗菌肽通过复杂的机制抑制靶细胞壁组分的合成，导致细菌不能维持正 常形态，生长受阻，如s a r c o t o x i n s i i ，能够抑制细菌细胞壁的形成，但对于已形 成的细胞壁不起作用 3 7 。 有些抗菌肽通过抑制细胞呼吸，达到杀菌目的，如：t h a n a t i n 浓度上升时 仍然检测不到细胞内l ( + 的泄漏，这表明t h a n a t i n 没有在细胞膜上形成孔道。并 且在处理过程中可检测到细胞的呼吸作用变弱，直至完全停止 3 8 】。由此认为 t h a a a t i n 是通过抑制细胞呼吸作用来杀菌的。也有学者发现抗菌肽t a c h y p l e s i n 的作用机制与抑制线粒体相关的e a s p a s e 7 和e a s p a s e 6 蛋白有关【3 9 】。 还有一些是通过抑制细胞外膜蛋白的合成，导致细胞死亡，如：a t t a c i n 5 抗菌肽的应用前景 浙江大学硕士学位论文 较之于传统抗菌药物，抗菌肽具有很多优点：作用专一，产生迅速、广谱抗 菌、病原菌不易产生耐药性、提高免疫反应。可以预见，抗茵肽及其基因工程产 品在医药卫生、食品工业、畜牧业及农业等方面将发挥极为重要的作用。 5 1 药用前景 抗菌肽独有的抗菌机制，以及对肿瘤细胞、原核细胞、病毒等的选择性杀伤， 而对真核细胞无影响，因此可具有广阔的药用前景。而随着研究的深入，对于作 用机制等有更多的了解之后，设计一批高效的药物，能给医药卫生和疾病治疗带 来巨大的现实意义 4 0 】。 5 2 食品工业应用前景 抗菌肽对多种革兰氏阳性及阴性细菌均有较强的杀灭作用，能快速抑制微生 物的生长，无毒副作用，是一种极具发展前景的新型食品防腐剂。 5 3 农业工程应用前景 利用抗菌肽培育具有抗病菌的作物，可降低农药使用，减少环境污染。在长 期的进化过程中，抗菌肽能稳定维系机体内微生物共生体系。将各种动物特有的、 内源性的抗菌肽作为饲料添加剂，可使动物有效抵抗外源性的病原菌入侵，且不 容易产生抗药性。利用基因工程技术将抗菌肽基因转入植物和动物，抗菌肽的转 基因动植物将明显增强抗病原微生物的能力，这在作物培育和动物养殖中具有重 要的现实意义。 虽然抗菌肽具有广阔的前景，但是抗菌肽的应用还存在以下问题： 首先是抗菌肽的来源问题：抗菌肽天然来源有限、成本高、提取效率低；化 学合成方法成本高、无法保证生物活性；基因工程方法虽然可能获得大量、廉价 的抗菌肽，但在实际操作中发现可能会导致对宿主的伤害，抗菌肽分子量较小分 离纯化复杂，易被蛋白酶水解，基因表达产量不高，无法保证重组产物的生物学 活性。这是抗菌肽研究和应用中的一个瓶颈 抗菌肽的研究到临床应用还有很多问题需要解决，如抗菌肽的抗原性、致癌 性、进人体内后能否如体外实验一样有效，目前抗菌肽的临床试验仍局限于局部 治疗，对于抗菌肽的基础与临床应用研究有待进一步深入。 相信随着对抗菌肽理论和应用上的深人研究，抗菌肽必将作为一类新型药物 对人类健康产生深远的影响。 6 浙江大学硕士学位论文 8 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 参考文献 z a s l o f rm ：a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e so fm u l t i c e l l u l a ro r g a n i s m s n a t u r e2 0 0 2 4 1 5 ( 6 8 7 0 ) ：3 8 9 3 9 5 s a n gy b l e c h af ：a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sa n db a c t e r i o c i n s ：a l t e r n a t i v e st o t r a d i t i o n a la n t i b i o t i c s a n i mh e a l t hr e sr e v2 0 0 8 9 ( 2 ) ：2 2 7 2 3 5 b o m a nh g ：a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ：k e yc o m p o n e n t sn e e d e di ni m m u n i t y c p 刀l9 91 6 5 ( 2 ) ：2 0 5 2 0 7 v i z i o l ij s a l z e tm ：a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sf r o ma n i m a l s ：f o c u so n i n v e r t e b r a t e s t r e n d sp h a r m a c o ls c i2 0 0 2 2 3 ( 11 ) ：4 9 4 4 9 6 s a l z e tm t a s i e m s k ia ：i n v o l v e m e n to fp r o - e n k e p h a l i n d e r i v e dp e p t i d e si n i m m u n i t y d e vc o m pi m m u n o l2 0 0 1 ，2 5 ( 3 ) ：1 7 7 1 8 5 s c h i t t e kb ，h i p f e lr ，s a u e rb ，b a l d e rj ，k a l b a c h e rh ，s t e v a n o v i cs ，s c h i r l em ， s c h r o e d e rk ，b l i nn ，m e i e rfe ta l ：d e r m c i d i n ：an o v e lh u m a na n t i b i o t i c p e p f i d e s e c r e t e db ys w e a tg l a n d s n a ti m m u n o l2 0 0 1 ，2 ( 12 ) ：l13 3 一l13 7 l a iy p p e n gy f ，z u oy l ij ，h u a n gj ，w a n gl f w hz r ：f u n c t i o n a la n d s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i z a t i o n o fr e c o m b i n a n td e r m c i d i n l l ah u m a n a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e b i o c h e mb i o p h y sr e sc o m m u n2 0 0 5 ，3 2 8 ( 1 ) ：2 4 3 - 2 5 0 n a k a j i m ayo g i h a r akt a y l o rd ，y a m a k a w am ：a n t i b a c t e r i a lh e m o g l o b i n f r a g m e n t sf r o mt h em i d g u to ft h es o f tt i c k0 r n i t h o d o r o sm o u b a t a ( a c a r i ： a r g a s i d a e ) j m e de n t o m o l2 0 0 3 ，4 0 ( 1 ) ：7 8 - 81 m u n o zm ，v a n d e n b u l c k ef g u e g u e nyb a c h e r ee ：e x p r e s s i o no fp e n a e i d i n a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e si ne a r l yl a r v a ls t a g e so ft h es h r i m pp e n a e u s v a n n a m e i d e vc o m pi m m u n o l2 0 0 3 ，2 7 ( 4 ) ：2 8 3 2 8 9 s h e l b u r n ec e a nf yd h o l p evr a m a m o o r t h ya ，l o p a t i nd e ，l a n t zm s ： t h es p e c t r u mo fa n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo ft h eb a c t e r i o c i ns u b t i l o s i na j a n t i m i c r o bc h e m o t h e r2 0 0 7 5 9 ( 2 ) ：2 9 7 - 3 0 0 o s c a r i zj c p i s a b a r r oa g ： c i a s s i f i c a t i o na n dm o d eo fa c t i o no f m e m b r a n e - a c t i v eb a c t e r i o c i n sp r o d u c e db yg r a m - p o s i t i v eb a c t e r i a n t m i c r o b i o l2 0 0 1 ，4 ( 1 ) ：1 3 1 9 p a d i l l ac ，l o b o so ，b r e v i sp ，a b a c ap ，h u b e r te ：p l a s m i d - m e d i a t e d b a c t e r i o c i np r o d u c t i o nb ys h i g e l l af l e x n e r ii s o l a t e df r o md y s e n t e r i c d i a r r h o e aa n dt h e i rt r a n s f o r m a t i o ni n t oe s c h e r i c h i ac o i l l e t ta p p l m i c r o b i o z2 0 0 6 4 2 ( 3 ) ：3 0 0 - 3 0 3 h e n gn c ，r a g l a n dn l ，s w ep m ，b a i r dh j ，1 1 1 百i sm a ，t a g gj r ，j a c kr w ： d y s g a l a c t i c i n ： a n o v e lp l a s m i d - e n c o d e d a n t i m i c r o b i a l p r o t e i n ( b a c t e r i o c i n ) p r o d u c e db ys t r e p t o c o c c u sd y s g a l a c t i a es u b s p e q u i s i m i l i s m i c r o b i o l o g y2 0 0 6 ，1 5 2 ( p t7 ) ：l9 9 1 2 0 0 1 o s u l l i v a nl r o s sr p , h i l lc ：p o t e n t i a lo fb a c t e r i o c i n - p r o d u c i n gl a c t i ca c i d b a c t e r i af o ri m p r o v e m e n t si nf o o ds a f e t ya n dq u a f i t y b i o c h i m i e2 0 0 2 ， 8 4 ( 5 6 ) ：5 9 3 - 6 0 4 w a c h i n g e rm ，k 1 l e i n s c h m i d ta ，w i n d e rd ，y o np e c h m a n nn ，l u d v i g s e na ， n e u m a n nm ，h o l l er s a l m o n sb ，e m evb r a c k - w e r n e rr ：a n t i m i c r o b i a i p e p t i d e s m e l i t t i na n d c e c r o p i n i n h i b i t r e p f i c a t i o n o fh u m a n 7 l 2 3 4 5 6 浙江大学硕七学位论文 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 i m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s1b ys u p p r e s s i n gv i r a lg e n ee x p r e s s i o n jg e n v i r o l1 9 9 8 。7 9 ( p t4 ) ：7 31 7 4 0 c h e nh m ，l e u n gk w , t h a k u rm 叮，t a na ，j a c kr w ：d i s t i n g u i s h i n gb e t w e e n d i f f e r e n tp a t h w a y so fb i l a y e rd i s r u p t i o nb yt h er e l a t e da n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s c e c r o p i nb ，b 1a n db 3 e u r j b i o c h e m2 0 0 3 ，2 7 0 ( 5 ) ：9 1 1 - 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