（细胞生物学专业论文）转盐芥zep基因提高烟草和沾化冬枣耐逆性的研究.pdf

山东大学硕士论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：继 日 期：么叠：区z 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人 授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定1 论寒作者签名：j 畦二茎一导师签名：碰日期 2 澎z i 岔。 山东大学硕士论文 摘要 脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) 不仅在植物休眠、衰老和果实发育等过程中 起着重要作用，而且还在植物的逆境适应中起着重要的调节作用，是植物体内重 要的逆境响应激素。本实验室从盐芥中克隆了a b a 合成途径中关键酶基因玉米 黄素环氧化酶( z e a x a n t h i ne p o x i d a s e ，z e p ) 基因，该基因催化来源于c 4 0 类胡萝 b 素的玉米黄素经过两次环氧化形成紫黄质。随后利用d n a 重组技术构建了植 物表达载体并转化烟草。在此基础上，本论文研究了转正、反义t h z e p 基因烟 草植株的性状变化，并将正、反义t h z e p 基因转入沾化冬枣植株中，希望在此 基础上进一步研究a b a 对沾化冬枣抗逆性和生长发育的影响。 在对t o 代转基因烟草的p c r 检测基础上，对正义转基因烟草分别进行了 s o u t h e r nb l o t ，结果显示绝大多数p c r 检测阳性植株杂交结果为阳性，表明外源 基因已整合到烟草基因组中。对s o u t h e r nb l o t 阳性的部分株系进行n o r t h e mb l o t 分析，证明在部分株系中外源基因已经表达。 在干旱胁迫条件下，脱落酸能够通过阻止气孔开放和诱导气孔关闭而减少 水分的散失。聚乙二醇可以模拟干旱胁迫条件，从而调控植株a b a 的合成以响 应环境的改变。离体条件下对转基因烟草植株的叶片进行1 0 p e g 6 0 0 0 胁迫处理 2 d , 时后，在检测的1 0 个株系中，除转正义t h z e p 基因的株系+ l 外其它株系的 气孔开度与对照植株相比差异不明显。将转正、反义基因烟草与对照植株进行整 株的p e g 6 0 0 0 胁迫处理，在用1 8 的p e g 6 0 0 0 处理4 小时后，转反义基因植株和 对照植株出现严重的叶片萎蔫症状，而转正义基因植株叶片基本未发生萎蔫；转 反义基因烟草和对照植株在16 的p e g 6 0 0 0 浓度处理4 小时后，转反义基因的植 株烟草先于对照植株出现叶片萎蔫症状。采用h p l c 法对经胁迫处理的不同转基 因株系的叶片进行a b a 含量测定，转正义t h z e p 基因的叶片a b a 含量明显高于对 照植株叶片的，而转反义t h z e p 基因的叶片中a b a 的含量比对照植株叶片低。 在对转基因烟草植株后代的t 代种子的萌发率进行分析后发现，转正义 t h z e p 基因的烟草植株种子与对照植株相比要延迟萌发，其中株系+ 4 6 的种子在 大约l o 天后刊萌发，比对照萌发时间延迟了5 天。转反义基因烟草株系的t 代种子有提前萌发的趋势，其中株系一1 9 的种子萌发速度最快。 山东大学硕士论文 本论文还以沾化冬枣无菌小苗的裸露茎尖为受体，采用农杆菌介导法进行 遗传转化。以除草剂筛选三代后成活的抗性小苗为材料，恢复培养后，取其新生 叶片，微量提取d n a 分别进行了p c r 和p c r s o u t h e r n 检测。检测结果表明， 获得了转基因的沾化冬枣植株，转化频率分别为转正义t h z e p 基因的阳性率为 3 1 3 ，转反义t h z e p 基因的阳性率为2 7 5 。为排除农杆菌污染对p c r 检测 结果的干扰，本试验根据p c a m b l a l 3 0 0 a l s 质粒中非t - d n a 区序列设计特异 性引物，以初步检测目的基因为阳性的植株d n a 为模板进行再一次的扩增检测。 扩增结果显示，部分植株为阳性，这表明可能存在农杆菌的污染，转正义基因植 株的农杆菌污染比例2 5 ，转反义基因植株的农杆菌污染比例为2 7 2 。 关键词：z e p 基因、转基因、烟草、沾化冬枣 山东大学硕： ：论文 s t u d y o ng e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no ft h z e pi n t ot o b a c c oa n dz h a n h u a w i n t e rj u j u b et oe n h a n c es t r e s st o l e r a n c e a b s t r a c t a b s c i s i ca c i d ( a b a ) i sap l a n th o r m o n et h a tp l a y sm a j o rr o l e si nt h ec o n t r o lo f p l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n ti n c l u d i n gs e e dm a t u r a t i o n ，p l a n ts e n e s c e n c e ，a n d i nt h e r e s p o n s et ov a r i o u se n v i r o n m e n t a ls t r e s s e ss u c ha sd r o u g h t ，c o l d ，a n ds a l i n i t y o n eo f t h ek e yg e n e si n v o l v e di na b as y n t h e s i s ，z e pe n c o d e sf o rz e a x a n t h i ne p o x i d a s e ， c a t a l y s e st h ee p o x i d a t i o no f z e a x a n t h i na n da n t h e r a x a n t h i nt oa l l - t r a n s v i o l a x a n t h i n ， w h i c ho c c u r si np l a s t i d s b e f o r eo u rs t u d y ，w eh a v ep o s s e s s e do ft r a n s g e n i ct o b a c c o s ， w h i c hc o n t a i nac o m p l e t et h z e pc d n a ( c l o n e df r o mt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ) i na s e n s eo ra n t i s e n s eo r i e n t a t i o n f i r s t l y ，a na t t e m p th a sb e e nm a d eh e r et os t u d yt h e p h e n o t y p eo ft r a n s g e n i ct o b a c c oi ns t r e s se n v i r o n m e n t s e c o n d l yd e p e n d i n go na n e s t a b l i s h e dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo fz h a n h u aw i n t e rj u j u b e ，t r a n s g e n i cp l a n t s w e r eo b t a i n e db yi n t r o d u c i n gt h et h z e pi nas e n s ea n da n t i s e n s eo r i e n t a t i o n p u t a t i v et r a n s g e n i cp l a n t l e t sw e r ea n a l y z e db yp c ra n ds o u t h e r nb l o t t h e n ， s o m eo ft r a n s g e n i cp l a n t l e t sw e r ec o n f i r m e db yn o r t h e r nb l o t t i n g ，w h i c he x p r e s s i o n o f t a r g e tg e n ew a sc o n f i r m e d r e s p o n d i n gt od r o u g h ts t r e s s ，a b ar e g u l a t e ss t o m a t a la p e r t u r eb yi n h i b i t i n g s t o m a t a lo p e n i n ga n di n d u c i n gs t o m a t a lc l o s u r ei ng u a r dc e l l s ap o l y e t h y l e n eg l y c o l s o l u t i o ni se x p e c t e dt om i m i ct h ee f f e c to fw a t e rd e f i c i ts t r e s sa n di n c r e a s et h ea b a c o n c e n t r a t i o no fp l a n t s f u l l ye x p a n d e dl e a v e so ft r a n s g e n i ct o b a c c o sw e r ed e t a c h e d ， a n dt h el e a v e sw e r es l i c e di n t ol c m 2s t r i p sw i t has h a r pr a z o rb l a d e t h e n ，t h el e a f s l i c e sw e r ei n c u b a t e di n1 0 p e g 6 0 0 0s o l u t i o nf o ra b o u t2h t h e r ew a sn o to b v i o u s d i f f e r e n c eo ns t o m a t a la p e r t u r eb e t w e e nt e nt r a n s g e n i ct o b a c c o sa n dw i l d t y p ep l a n t s e x c e p tf o rl i n e + 1 t h er e s u l ta t t e s t e da g a i nt h a ti nl e a v e st h et r a n s c r i p tl e v e l so f z e p g e n ed i dn o tr e s p o n s et os t r e s st oi n v e s t i g a t et h ec h a n g ei na b a c o n t e n ta n dt h e d i f f e r e n c eo ns y m p t o mo ft r a n s g e n i ct o b a c c o s ，t h et r a n s g e n i cp l a n t sa n dw i l d t y p e p l a n t sw e r es i m u l t a n e o u s l yt r e a t e dw i t hp e g 6 0 0 0s o l u t i o n u n d e rn o r m a lg r o w t h 7 山东大学硕士论文 c o n d i t i o n s ，n op h e n o t y p i cc h a n g e sc o u l db eo b s e r v e di nb o t hs e n s ea n da n t i s e n s e t h z e pt r a n s g e n i cp l a n t s h o w e v e r ，t h eo v e r e x p r e s s i o no fs e n s et h z e pg e n ei n t r a n s g e n i cp l a n t sd i s p l a y e da ni m p r o v e dd r o u g h tt o l e r a n c ec o m p a r e dw i t hw i l d t y p e p l a n t sa n da n t i s e n s et r a n s g e n i cp l a n t s ，w h i c hw i d e t y p e a n da n t i s e n s et r a n s g e n i c p l a n t s e x h i b i t e dw i t h e rs y m p t o mi n18 p e g 6 0 0 0s o l u t i o ni n c u b a t e df o r4 h a n t i s e n s et r a n s g e n i cp l a n t sa n dw i d e - t y p ep l a n t sw e r es t r e s s e db y1 6 p e g 6 0 0 0i n 4 h ，a n da n t i s e n s et r a n s g e n i cp l a n t sr e p r e s e n t e de a r l i e rw i t h e rs y m p t o m s u b s e q u e n t l y t h ea v e r a g ea b ac o n t e n ti nl e a v e so ft r a n s g e n i cl i n ea n dw i d e t y p ep l a n t ss t r e s s e db y p e g 6 0 0 0w e r ed e t e r m i n e db yh p l c t h ei m p r o v e dd r o u g h tt o l e r a n c ew a s d e m o n s t r a t e db yh i g h e ra b ac o n t e n ti ns e n s et h z e pt r a n s g e n i cp l a n t sl e a v e s c o m p a r e dw i t hw i l d - t y p ep l a n t s t h e l o w e ra b ac o n t e n tw a sa l s oo b s e r v e di n a n t i s e n s et h z e pt r a n s g e n i cp l a n t s t 1s e e do ft r a n s g e n i cp l a n t sw a sa l s os e l e c t e dt ot e s tt h ee f f i c a c yo ft h z e pi n t h et r a n s g e n i ct o b a c c o t h es e e do ft r a n s g e n i cp l a n t so v e r e x p r e s s i n gt h z e pg e n e e x h i b i t e dd e l a y e dg e r m i n a t i o n ，p r e s u m i n gt oi n c r e a s e da b al e v e l si nm a t u r es e e d s t h es e e d so ft r a n s g e n i cl i n e + 4 6r e p r e s e n t e dt h em o s tn o t a b l ed e l a y e dg e r m i n a t i o n h o w e v e r ，e x p r e s s i o no fa na n t i s e n s et h z e pr e s u l t e di nr a p i ds e e dg e r m i n a t i o n ， b e c a u s eo far e d u c t i o no fa b ac o n t e n ti nt r a n s g e n i cs e e d s e s p e c i a l l y ，t h es e e d so f l i n e - 1 9g e r m i n a t e dt h em o s tr a p i d l ya m o n ga l lt r a n s g e n i cl i n e s i nt h i ss t u d y ，t h ea p i c a lm e r i s t e m so fz h a n h u aw i n t e rj u j u b et i s s u ec u l t u r es h o o t s w e r eu s e da st h er e c e p t o r so fa g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n t h es h o o tt i p s w e r ei n o c u l a t e dw i t ht h ea g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sl b a 4 4 0 4s t r a i nw h i c hc a r r y i n g t h ev e c t o rp c a m b i a l 3 0 0 一z e p f + ，) 一a l s t h ep r e s e n c eo ft h z e pg e n e ，i ns e n s ea n d a n t i s e n s e o r i e n t a t i o n ，i nt r a n s g e n i cp l a n t l e t s w e r ei d e n t i f i e db yp c ra n d p c r s o u t h e ma n a l y s e s t h et r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yi s3 1 3 i ns e n s eo r i e n t a t i o n ， a n d2 7 5 i na n t i s e n s eo r i e n t a t i o n i no r d e rt ot e s tt h ev e r a c i t yo ft h er e s u l t ，t h e p r i m e r sf l a n k i n g n o n t d n a s e q u e n c e o f p c a m b i a l3 0 0 一z e p 卜l 七一a l s w e r e d e s i g n e dt ot e s tw h i t h e rt h e r ew a st h ec o n t a m i n a t i o no fa g r o b a c t e r i u m t h r o u g ht h e a n a l y s i so ft h ee x p e r i m e n t a t i o nr e s u l t s ，w ec a nk n o wt h a to n l yp a r tt r a n s g e n i cp l a n t s 山东大学硕士论文 h a dm i g h tb ei n t e r f e r e db y t h er a t eo fa g r o b a c t e r i u mc o n t a m i n a t i o ni ns e n s ea n d a n t i s e n s et r a n s g e n i cp l a n t si s2 5 a n d2 7 2 ，s e p a r a t e l y k e yw o r d s ：z e p ，g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ，z h a n h u aw i n t e r j u j u b e 9 山东大学硕士论文 缩略词表 a b a a l s 6 一b a c a m v c d h c e f c t a b d i g e d t a i a a i p t g k a n n c e d p c r p e g t f i s z e p a b s c i s i ca c i d ，脱落酸 a c e t o l a c t a t es y n t h a s e ，乙酰乳酸合成酶 6 - b e n z y l a d e n i n e ，6 - 苄基腺嘌呤 c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s ，花椰菜花叶病毒 c h r o l i n ed e h y d r o g e n a s e ，胆碱脱氢酶 c e f o t a x i m e ，头孢霉素 c e t y l t r i e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ，十六烷基三甲基溴化铵 d i g o x i g e n i n ，地高辛 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d ，乙二胺四乙酸 i n d o l e a c e t i ca c i d ，吲哚乙酸 i s o p r o p y l3 - d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d ，异丙基硫代b d 一半乳糖苷 k a n a r n y c i n ，卡那霉素 9 - c i s - e p o x y c a r o t e n o i dd i o x y g e n a s e ，9 - 顺式环氧化类胡萝h 素过氧化物酶 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应 p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，聚乙二醇 t r i s h y d r o x y m e t h y la m i n om e t h a n e ，三羟甲基氨基甲烷 z e a x a n t h i ne p o x i d a s e ，玉米黄质环氧化酶 o 山东大学硕二 = 论文 1 1 植物抗逆性研究 1 前言 自然条件下，由于不同的地理位置和气候条件以及人类活动等多方面原因， 植物生长的环境并非总是适宜的。某些环境条件超出了植物正常生长、发育所能 承受的范围，即逆境，导致植物生长发育受到阻碍，严重时甚至引起死亡。农业 生产过程中面临的各种不良环境是影响产量的最直接、最重大的因素之一，其中 干旱和盐渍又是对植物生长和发育影晌最大的两种胁迫【1 ，2 1 。据统计，每年仅 由于干旱造成的农作物减产量相当于其它逆境因素所造成减产量的总和。我国是 一个水资源相对匮乏的国家，全国约有二分之一的国土面积是干旱、半干旱地区。 因此，加强植物抗逆性生理的研究，探明植物在不良环境下的生命活动规律并加 以人为调控，对于获得农业高产稳产具有重要意义。 植物没有动物的运动机能和神经系统，基本生长在固定的位置上，因而不能 主动的躲避生长发育过程中所遭受的各种不利因素的影响。但是，在长期的进化 过程中植物形成了一系列反应保护机制：迅速的感知外界环境的变化，经过细胞 问和细胞内的复杂信号传递与转化，引起相关生理反应，从而对环境变换作出的 适应【l l 。 干旱、盐渍、高温、低温等胁迫都能够影响植物的水分代谢，使细胞脱水造 成水分亏缺( w a t e rd e f i c i t ) ，导致植物生长发育受到阻碍。因而，植物细胞水分 亏缺是植物面临的最为普遍的环境胁迫形式f 4 i 。目前在植物水分胁迫和胁迫抗性 方面上的研究比较深入，主要集中在两个方面：一是植物形态在水分胁迫时的变 化和适应性：如叶片和根系的生长、排列和结构的变化：二是植物在水分胁迫时 生理生化反应和适应性：如渗透调节、光合和呼吸代谢、蒸腾作用、氮代谢、气 孔反应、活性氧代谢、糖代谢、核酸代谢和内源激素的变化等。 1 1 1 水分胁迫时植物形态解剖上的变化与抗逆性 面对如何高效利用有限的水资源，减少水分损失这样一个问题，植物在进化 过程中形成了许多特殊的结构，o n 【】1 - 表面的蜡质层，叶片表皮专门负责进行气体 交换的组织一气孔 5 。植物叶片是水分散失的主要器官，水分胁迫下叶片面积 山东大学硕士论文 减小、新叶发生速率减缓、叶片的扩展生长提早停止、落叶增加、叶片出现萎蔫 症状、叶片改变方位等【6 ，7 一i 。另外在以葡萄、龙眼叶片为材料进行研究表明， 水分胁迫下叶片增厚，这有利于促进光合效率，增加水的利用率，提高抗旱性 1 9 j o l 。 在水分胁迫下，植物根系结构发生明显的变化。适度胁迫能使苹果新根的中 柱加粗，但随着胁迫加重，新根的中柱变扁，凯氏带越来越不明显，而且导管比 正常供水时发达，木质部向心分化速度加快，导管分子直径加大1 。另外多种 果树如柑橘、龙眼、番木瓜、板栗等有菌根产生，增大了树根的吸收面积，增强 抗旱力。 1 1 2 水分胁迫时植物生理生化变化与抗逆性 干早胁迫环境下，植物叶片通过关闭气孔可减缓或避免水分大量散失，减少 干旱对植物生长发育的影响。气孔对水分胁迫的反应有前馈式反应( f e e d f o r w a r d m a n n e r ) $ 1 反馈式反应( f e e d b a c km a n n e r ) 。前馈式反应是气孔对空气湿度变化 所作出的直接反应，是植物气孔感受空气中水气压亏缺与否而决定气孑l 开度大 小。气孔的前馈式反应可以主动阻止细胞水势进一步下降，因而也称为“预警系 统”。这种现象最早是s c h u l z e 等在以色p j n e g e v 沙漠气候下生长的杏树上发现 的1 ”，以后相继在柑桔类、苹果、葡萄、草莓、桃等果树上发现了这种现象。 气i l 的反馈式反应是指干旱胁迫条件下叶片水势低于l | 缶界值而引起的气孔关闭， 可减缓叶子失水。这种气孔反馈式反应在= i = 果、葡萄1 5 i 等多种果树上都有报 道。同时植物逆境激素脱落酸作为重要的调节物质参与气孔的调节过程4 0 ，“i 。 水分胁迫对光合系统的抑制作用可分为气7 l 抑制和非气孑l 抑制两种。气孔抑 制是指胁迫促使气孔导度下降，c o ：进入叶片受到阻碍，引起植物净光合速率 ( p n ) 下降”1 。非气孔抑制则是由于胁迫造成细胞内光合系统被破坏所引起的。 在轻度或中度水分胁迫时气孔因素占主导作用，严重胁迫时非气孑l 因素起主要作 用【18 1 。 环境胁迫往往能够造成外界环境水势降低，植物若要继续吸收水分，就必须 通过各种途径降低自身的水势，维持一定的膨压，保持吸水能力。植物受到渗透 胁迫时细胞内可以积累渗透保护物质来降低细胞的渗透势，而且这些渗透保护物 山东大学硕士论文 质即使是在高浓度下也不干扰细胞内正常的生化反应。渗透保护物质大致可分为 三类，即氨基酸及其衍生物( 甘氨酸、甜菜碱、脯氨酸等) 、糖类及其衍生物( 山 梨糖醇、甘油、甘露糖醇等) 和叔硫酰化合物( b 二甲基硫代丙酸等) 。这些小 分子渗透保护物质在植物抵抗逆境中起着重要作用，如多元醇类化合物的积累可 以清除活性氧的伤害，甘氨酸甜菜碱可以使蛋白质处于稳定状态，并可有效保护 细胞膜系统。此外，无机盐离子在植物的渗透调节尤其在气7 l 的开关调节上起着 重要的作用9 ，2 0 2 ”。 多种胁迫能导致植物体内活性氧的积累，过多的活性氧的产生一方面能直接 攻击膜系统中不饱和脂肪酸，导致膜脂过氧化，膜脂过氧化产物丙二醛( m d a ) 的增加可造成细胞膜系统损伤2 ”。另一方面相应的植物体内活性氧自由基清除 剂包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 等活性在 胁迫的条件下增强。上述酶的过量表达能够提高植物的抗逆性。另外活性氧能够 作为一种信号分子参与整个的植物逆境应答，包括激活保卫细胞c a z + 离子通道、 诱导气孔关闭”1 、调节a b a 的体内代谢等”l 。 植物激素在代谢、生长和形态建成等植物生理活动的各个方面均起着十分重 要的作用，也包括逆境下植物的胁迫应答反应。在论述与研究植物激素与抗逆性 的关系时，脱落酸总是处在最重要的位置。a b a 不仅在植物生长发育过程中起 着重要作用，而且对植物在干旱、盐碱、低温等逆境环境下进行的生理活动起关 键的调节作用【2 4 】。植物激素中除了a b a 外，国内学者在对向日葵、小麦、 玉米2 7 i 、香蕉、苜蓿的研究中发现，植物在水涝、干旱、低温、盐渍等逆 境胁迫下，体内乙烯能，l 倍或几十倍的增加，乙烯促进器官衰老，引起枝叶脱落， 减少蒸腾面积，有利于保持水分平衡。细胞分裂素可以调控植物耐盐性，通过丙 酮将激动素渗入莴苣种子，出于细胞分裂素能促进a c c 氧化酶活性，从而提高 了乙烯的生物合成，减轻了n a c l 对莴苣种子萌发的抑制作用【3 。进一步研究表 明，盐胁迫条件下玉米素对维持葡萄叶片中c a t 和p o d 等清除h 2 0 2 酶类的活 性起着重要作用，因而细胞分裂素能缓解或减轻盐胁迫对植物的伤害可能与其对 胞内h 2 0 2 清除酶类的刺激作用有关 3 1 i 。 山东大学硕士论文 1 2 a b a 研究的进展 1 2 1a b a 与植物抗逆性 脱落酸( 天b s c i s i ca c i d ，a b a ) 是以异戊二烯为基本单位的倍半萜烯化合物， 早在2 0 世纪6 0 年代就已被发现，广泛存在于植物体内。a b a 在植物休h 民、衰老 和果实发育等过程中起着重要作用，能够提高植物的抗逆性。a b a 是在植物受 到胁迫时产生的一种信号分子，能参与快速的生理变化过程如气孔运动和叶片生 长调节等口2 1 ，也能通过诱导特定基因表达对胁迫作出响应【3 3 】。因而，a b a 被称 为逆境响应激素m 3 5 , 3 6 1 。 l 2 1 1a b a 与植物的抗旱性 自1 9 6 9 年w r i g h t 等研究发现小麦叶片失水萎蔫时体内的a b a 会大量积累以 来，国内外开展了大量的工作来研究a b a 与植物的抗旱性的关系。绝大多数植 物在受到干旱胁迫时体内a b a 含量会快速增加”1 ，增加的a b a 主要来源于根系 新合成的a b a 3 8 】。a b a 含量在体内的变化十分迅速，胁迫时体内a b a 含量能够 在短时间内增加几倍到几十倍不等，当胁迫解除后体内a b a 含量又可以恢复到 原来的水平，而且外施a b a 同样也能够提高植物的抗逆性3 9 j 。目前普遍的观点 认为，a b a 是干旱胁迫时根系合成的主要的逆境信号物质之一，在根系中大量 合成后通过蒸腾作用被快速的运送至地上部分，并且能够在叶片水势没有改变之 前调节气孔运动。水分胁迫条件下，气孔内的a b a 含量迅速增加，a b a 与受体 结合后引起多种信号转导体系的变化，对c a ”、k + 离子通道进行调节，引起保卫 细胞膨压变化，导致气孔关闭，还能诱导保卫细胞内的脱水素蛋白表达和积累 4 0 ， “1 。进一步的研究发现，干旱胁迫条件下a b a c a 够诱导一些与适应水分胁迫有关 基因的表达f 4 2 l 。 植物体内重要的渗透调节物质脯氨酸在体内的积累与胁迫下的a b a 含量成 正相关。水分胁迫h , 寸a b a 的积累要比脯氨酸来的早，胁迫解除后积累的a b a 先 于脯氨酸消失，而且外施a b a 可引起植物脯氨酸含量增加【4 3 。s a v o u r e 等研究发 现干旱胁迫下脯氨酸的合成过程中关键酶基因可以被不同途径所诱导：一条为依 赖a b a 的途径( a b a d e p e n d e n c e ) ：其表达依赖于内源a b a 积累或外源a b a 处 山东大学硕士论文 理：另一条为非依赖a b a 的途径( a b a i n d e p e n d e n c e ) ：其表达除受a b a 的影 响外，还受其它因子如干旱，低温等的影响。 1 2 1 2a b a 与植物抗逆性的交叉适应 早在1 9 7 5 年，b o u s s i b a 等提出“交叉适应( c r o s sa d a p t a t i o n ) ”的概念，认为受 到某一种环境胁迫的植物不仅具有抵抗这种胁迫的能力，而且对另一种环境胁迫 的抗逆性也增强。在盐渍、缺肥、缺氧与低温等逆境环境下烟草内源a b a 含量 增加，而在a b a 含量下降至正常水平之前，将其转入其它胁迫环境中，抗逆性 仍较强，随后大量的试验证据相继证明了这一现象 3 9 】。 随着分子生物学技术的快速发展，人们对植物逆境反应的认识也由原来的生 理生化水平上升到分子水平【4 。通过对各种类型a b a 突变体的分析，尤其是通 过对a b a 缺乏和a b a 非敏感突变体的分析，使人们逐渐从分子水平上了解了 a b a 的生物合成途径、调节机理和a b a 的信号传导途径等 4 5 , 4 6 , 4 7 , 6 5 】。 s e k 等( 2 0 0 2 ) 1 4 8 等通过基因芯片技术对7 0 0 0 个拟南芥基因进行表达分析， 结果显示其中包括2 9 9 个干旱诱导表达的基因，5 4 个低温诱导表达的基因，2 1 3 个盐渍诱导表达的基因和2 5 4 个a b a 诱导表达的基因。进一步分析比对后发现， 干旱所诱导的基因5 0 以上能同时被高盐和a b a 所诱导。x i o n g 等( 1 9 9 9 ) 【4 9 】 研究发现在常温下，渗透胁迫或温度胁迫与a b a 在诱导某些特异基因表达时是 相互促进的，而低温条件却能抑制渗透胁迫所引起的诱导作用。通过分析胁迫所 诱导基因的表达调控的顺式作用元件和反式调节因子，目前已经归纳出至少4 条 基本的逆境信号传导途径，两条a b a 依赖型途径( 途径i 和途径l i ) 和两条a b a c k 依赖型途径( 途径i l i ) i 途径i v ) ，其中一条a b a c i 依赖型途径与低温( 途径i v ) 重迭 在一起。a b a 依赖型途径中的这两个分支的区别在于a b a 诱导基因表达时是否 需要蛋白质的合成，如图1 所示【4 4 】。 山东大学硕士论文 图l ：胁迫一i - 主要的细胞信号传导途径 途径i 、i i 是a b a 依赖型，其中途径i 依赖蛋白质的合成；途径玎i 、 是a b a 非依赖性，其中途径与低温的信号途径部分重合。 综上所述，a b a 作为一种重要的逆境信号分子，它不仅能够通过气孑l 快速 的调节植物的水分代谢，减少水分损失，提高抗逆性，而且更为重要的是它能诱 导特异性基因的表达，进而影响植物整体水平上的代谢活动。 1 2 2a b a 与植物果实成熟等生物学作用 果实成熟是一个高度协调的遗传调控过程，受内部和外部因素的影响。根据 果实成熟过程中是否有呼吸跃变，果实可分为呼吸跃变型和非呼吸跃变型两种类 型【5 0 i 。植物激素a b a 在上述两类果实的成熟过程中都担负着重要的调控作用队 5 2 , 5 3 i 。作为调控果实成熟的重要激素，a b a 在非呼吸跃变型果实中起着比乙烯更 为重要的作用。c o o m b e ( 1 9 8 9 ) 1 5 4 、张大鹏等( 1 9 9 7 ) 1 5 5 1 研究证明非跃变型果 实中a b a 含量在成熟启动前急剧增加，启动了果实的成熟过程。冬枣属于高呼 吸强度的非跃变型果实。张有林等( 2 0 0 0 ) 5 6 1 、李红卫等( 2 0 0 3 ) 1 5 7 1 研究表明 在枣类果实成熟过程中，a b a 有一逐渐积累的过程，并且在果实全红时，也是 a b a 峰值出现的时候。a b a 是导致枣类果实成熟、衰老的主要因素之一。 山东大学硕： = 论文 a b a 除了在植物抗逆性和果实成熟等方面起着重要作用外，在其它生命过 程中也起着重要的调节作用，包括种子的萌发与休眠【5 8 】、胚胎发育和叶片衰 老脱落【6 0 】等。 1 2 3a b a 的生物合成与z e p 基因的表达调控 目前，a b a 主要的合成途径已基本清楚，高等植物中a b a 合成主要通过类 胡萝h 素间接途径，由甲羟戊酸( m v a ) 聚合成c 4 0 前体一类胡萝h 素( c a r o t e n e ) ( 图2 ) 【5 9 6 1 , 6 2 1 。a b a 合成途径中关键的第一步在质体内进行，来源于c 4 0 一类胡 萝h 素的玉米黄素环氧化形成瑾菜黄素，瑾菜黄素再次环氧化形成紫黄质，催化 这一步骤的基因是玉米黄素环氧化酶( z e a x a n t h i ne p o x i d a s e ，z e p ) - 基n 1 5 9 ，6 柚。经 过一系列的结构改变，紫黄质形成9 顺一环氧类胡萝h 素，经9 一顺一环氧类胡萝h 素过氧化物酶( 9 一c i s - e p o x y c a r o t e n o i dd i o x y g e n a s e ，n c e d ) 基因催化发生裂解反 应形成c 15 黄质醛素( x a n t h o x i n ) ，此步反应是a b a 合成途径中关键的第二步 1 5 9 , 6 1 , 6 4 1 。裂解产生的黄质醛素从质体运输到细胞溶质中，通过两步a b a 醛氧化酶 ( a b s c i s i ca l d e h y d eo x i d d a s e ，a a o ) 催化a b a 醛形成a b a l 6 1 。 图2 ：a b a 的生物合成途径及调控 山东大学硕士论文 在a b a 的合成途径中存在着3 个关键调节位点，涉及到3 个调控酶，分别是 玉米黄素环氧化酶( z e a x a n t h i ne p o x i d a s e ，z e p ) 、9 - 顺一环氧类胡萝h 素过氧化物 酶( 9 一c i s - e p o x y c a r o t e n o i dd i o x y g e n a s e ，n c e d ) 和a b a 醛氧化酶( a b s c i s i ca l d e h y d e o x i d d a s e ，a a o ) ，这3 个酶在植物生长发育过程中协同控制着a b a 的合成( 表1 ) 【6 5 】。 e n z y 眦酗i 珊e 埘t i o n g 眦。砷 血n t p l 皿t 畔h ) g e r , e m u t a n t s 。 f a m i l y 缶l “叩e d 4 i 1 z “n 髓n 面n o f 碾联蚴 i n d u c e d b y d e h 5 d r n t l o n i n r o o m b 毗加t 血k 捌e - 堪b 厶牟 n o 曲1 2 a 垂， 鞭e j j 嘲删烛酶l 叩h 噜山q 函) a b a l ( 龇) o d i u r n a l f l u g t u a f i d n i n l e m j q * k n c e d o 虹h 曲c t * m l g e o f g c h h u l u g e d b y d e h y d n a i o n i n k 瓣蔑1k 舟舄滓p t 、 y e u 叩1 4 ( 嚣蹲p 印瞩刚娜藏嗯越l - 瓢x 萍) o r i h k p h 曲矗毒) 强女晚虢暖昂) 碱绷嘲量如竞) 。 r 和l i i 吒h 试b 毋l p d i u n u d n 眦t u 岫n 虹k 玳 p s 咀o 划l a f i d no f 掘叫壤5 虹 i n d u c e d b y , u p r i n m e d k n 龋 ( o 五h d 皿“积碱呦颤瑚，) b u t m t b yd e h y d r i t i a n o f k 蛳s 矗占) n o 曲1 2 觚) “ a oo x i d a f i a no f 破蛹嫩棚甄域ei d 嫩扑y 如h n 血n i n k 嘲b 硼m t i ar b 矗占) y e s a 柚3 诅 ) o ( 0 矗h 缸。f 积删嘲瓿却痂妊豫 ) + 吐d 皈) ” 如搬q 女y 出- l