（细胞生物学专业论文）拟南芥atnhx8基因的克隆及其功能研究.pdf

摘要 拟南芥单价阳离子：质子反向转运器1 ( c p a l ) 家族共包括8 个成员，命名为 a 姗l - a n q l 8 。a t n h x i 和a t n h x 7 s o s i 已经分别被证明为位于液泡膜及细胞质膜的n a * w 反向转运器a t n h x 2 - 6 在进化关系上与a t n h x i 比较接近，而a t n h x 8 与a t n h x 7 s o s i 同源 性较高。本论文的研究工作主要是对a t n h x 8 ( a t l 9 1 4 6 6 0 ) 进行功能鉴定 以拟南芥为材料，克隆了a t n h x 8 的c d s 和基因组d n a ，并利用c - 端亲水区进行了原核表 达( g 汀标签) ，纯化融合蛋白并制备了多克隆抗体。 从s a l k 突变体中心订购了a t n i - i x 8t - d n a 插入缺失突变体，经过筛选和鉴定后命名为 n h x 8 - 1 ( s a l k - 0 7 0 4 9 7 ) 和n k r s - 2 ( s a l k - 0 8 6 3 3 6 ) a t n x 8t - d n a 插入缺失突变体n k r 8 - 1 和n h r 8 - 2 对l r 胁迫比野生型敏感，但是对其它一价阳离子如n a * 、l f 、c 8 + 的处理都没有表现出与野生型 有明显的差异 利用酵母功能缺失突变体进行了功能互补实验。在一个缺失n g i r 反向转运器的三缺失酵母 突变体a x t 3 中异源表达该基因，可以专一性的恢复该酵母突变体对“+ 敏感的表型，而不能影 响其对n a + 或其它毒害离子的敏感性。我们分别以s o s j 突变体和野生型拟南芥为背景，对 a 吐仰【8 进行了超表达。在s o s 1 突变体及野生型拟南芥中超表达a 吐q h x 8 ，提高了s o s l - 1 及野 生型拟南芥对l i + 胁迫的耐受性，而对n a + 及其它离子的胁迫处理没有表现出与野生型明显的差 异。超表达a t n h x 8 的转基因植株可以耐受5 0m ml i c l 胁迫，而野生型拟南芥在2 0 m m “c l 处 理下便不能继续生长。 在l i c l 胁迫下，n h x 8 的“+ 含量较野生型要高一些，这和超表达植株的结果正好相反，超表 达植株的l + 含量较野生型要低。这个测定结果表明a t n h x 8 可能是在行使一个反向转运器的功 能。离子含量测定结果同时显示，随着l i c i 浓度的增加，拟南芥的l i + 含量是升高的，而心含量 是随之降低的。然而，与野生型相比，超表达植株体内的c 含量较高而突变体n h x 8 较低，这个 结果预示着c 营养对于植物在l i c i 胁迫下的生长是非常必要的a t n h x 8 可能在保持k + 吸收以 及维持体内离子平衡方面发挥重要的作用。 r t - p c r 结果显示，a t n h x 8 在转录水平不受处理的盐离子诱导对器官表达特异性分析。 发现a t n h x 8 在成熟拟南芥植株的根、茎、叶和花等器官中均有表达对a l n i i 【) 碍启动子- g u s 的转基因植株的g u s 活性检测，也发现其在叶片、根及根毛等部位均有表达对a t n h x 8 e g f p 融合蛋白进行亚细胞定位，发现a t n h x 8 可能定位于细胞质膜 综上所述，我们的初步研究结果表明，彳t 艘8 可能编码一个质膜的“佃+ 反向转运器，它在 减轻“+ 对植物的危害以及维持胞内离子平衡等方面发挥重要的作用就我们所知，这是目前植 物中第一个报道的有功能的可能的质膜i j + 反向转运器 关键词ta t n i - i x 8 , “+ 反向转运器，阳离予转运器，l i + ，拟南芥 a b s t r a c t t h ea r a b i d o p s i sm o n o v a l e n tc a t i o n ：p r o t o na n t i p o f t 即- i ( c p a l ) f a m i l yi n c l u d e 8e i f l l tm e m b e r s ， a t n i t x l 幻8 a 0 q l lm a da 悄i 玎订，s 0 s lh a v eh e a lw e l le h l n c t a i z o d t o n o p l n s ta n d 卿啪a m e m b r a n en r i - rm a t i p o r t e n ，r c s t , e 嘶c i y t h e 珥o t e i n 搴a t n h x 2 - 6b a v eb 。p h y l o g c t i e a l l yl i n k e d t oa t n i t x i ，w h i l ea t n t t x $ a p p e a n it ob er e l a t e dt oa t q t - i x 7 $ o $ 1 h e r om 托p o r cf u n e t i o n n l c h a “嵋扯l z 撕o no f a t n - x $ ( a t l 9 1 4 6 6 0 ) w ec l o n e dt h ea t n 财c d sa n dg e l a o m i cd n af r o ma r a b i d o p s l ，a n d 删l h e ( 3 $ t - a t n t t x 8p r o t e i ni ne c o u s i n gt h ec - t e r m i n a lf r a g m t , o b t a i n e dt l a el , , a i f i e df u s i o np r o t e i na n d p 1 p a r c , tt h ea a t i - a t n i - i x 8a n t i b o d y t w oa 勰t - d n ai l i s c i i j o i il n u l l l n l l l , 埘i m e dn t 搏l ( 1 a l k - 0 7 0 4 9 7 ) a n dn h x s - 2 ( s a l k - o s 6 3 3 6 ) 。 w e mo r d e r e df r o ml h cs a 咄h l s l i l u 把柚dw i l l = 鞠酬m 旧i d e n t i f i e d 4 t 勰t d n i n l l e t t i o n m u t a n t sn t 撂l a n dn h x s - 2 蛳h y p e r s e m i l i v ot ol i r c l a t i v et ow i l dt y p ep l a n t s b u tn o tt ot h oo t l a 葺 m e t a l i o n s 。s u c h 罅n a + ，k ? d o i + t h ef t m e t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no fa t n h x 8w a si n v e s t i g a t e db yy e a s tc o m p l e m e n t a t i o ns t u d i e s a t n h x 8o v e r c x p r e s s i o ni nat r i p l e - d e l e t i o ny e a s tm u t a n ta x t 3t h a te x h i b i t sd e f e c t i v en a * i a + t r a n s p o r ts p e c i f i c a l l ys u p r e s s e ss e n s i t i v i t yt o 毪b u td o e 8n o ta f f e c tt h en 式s e n s i t i v i t y e o v c i c x p i c s s c da t n h x 8i n b o t hs o s l - 1a n dw i l d t , f o cb a c k g r o u n d a t n h x 8o v e r e x p r e i o n c o m p l e m e n t e dl i 十，b u tn o tn a + ，s e m i t i v i t yi ns o s l 1m u t a n ts e e d l i n g s , a n di n c r e a s e di a + t o l e r a n c eo f b o t ht h es o s l 1m u t a n ta n dw i l dt y p es e e d l i n g s t r a n s g e n i ep l a n t s 眦a b l et os u s t a i nu pt o5 0m ml i c l s t r e ga n dg r o wn o r m a l l yw h e r e a s2 0 m ml i ai sas u bl e t h a lc o n e c l a t r a f i o nf o rw i l d - t y p ep l a n t s a t n h x 8g 哪ci sn o tm m s e r i p t i o m l l , a c t i v a t e du n d e rt 8 t e ds a l ts t r e s sc o n d i t i o n s r t - i c r a n a l y s i su s i n gt o t a lr n ai s o l a t e df r o md i f f e r e n tt i s s u t r e - v e a l e dt h a ta t n i t x 8i sa p 姆。di nr o o t s ， s h o o t s , l e a v e s 矗n df l o v c e n n h x $ ：g u si sa 【p f 麟e di nt h er o o t , 出o o t , i v 群a n dr o o th a i r s $ u b e e l l u l a rl o c a l i z a t i o no ft h ea t n h x s - e g f pf u s i o np r o t e i ns u g g e s t e dt h a ta t n h x 8p r o t e i ni s t a r g e t 例lt o 血ep l 舢m c m b i 1 m & u n d e ri a e ls l r e s 8 1 l h , l f 8m u t a n t ss h o w e dl a i g h c r “+ c o n t e n t s , w h i c l aa 把。叫乜宣r yt ot h o 埘飑嘻印托a s i 蚰1 j | 幅，w l a i d ah a d 荫l b 薯k w 冒盯e o l l t 脚t s t h 雠嗍l 协s l l g g e s ta t n i - 1 x $ m a y f l m c t i 触 勰a na n t i p o r t c r i ti so b v i o u st h 越t h es e e d l i n g s e e l h t l a rl i + c o n t e l a ti n c r e a s e da n dc c o n t e n td e e r e a s o d w i t h 缸c l c v a t c dl i c lm t , h o w e - , l l a jt h eo v e t c x p r e s s i o nl i n e sl a n dl a i 曲e ra n dn h x 8m u t a n t sh a d i o w a ：k + ：o n t e n 协，i n d i c a t e st l m tk + n u l r i t i o ni sn l s oe r u e i n lf o rp l a n tg r o w t hu n d e r 盯s t r e s sa n d a t n h x 8a l s op l a y s4r o l ef o rp l a n tk ? m a i n t e n a n c ea n di o nh o m e o s t a s i s b u tt h em e c h a n i s m ss t i l ln e e d f u l t h e rs t u d y t a k e aa l lt o g e t h e r , o u rf i n d i n g ss u g g e s tt h a ta t n h x 8e l l l c o d c ! ! ap u t a t i v ep l a s m am c m b r a n ol i * h - + a n t i p o r t e rt h a t f u n c t i o n si nf i t h i u md e t o x i f i e a t i a n di o nh o m e o s t a s i si na r a b i d o p s i s t oo u l k n o w l e d g e t h i si st h ef i r s tr e p o ao f ap u t a t i v es p e c i f i c 矗嚼a - t i p o r m - t ob ef u n c t i o n a li np l a n t s k e y w o r c l s ：a t n i - i x 8 ，l i + 硝a n f i p o r t e r , c a t i o ni r a n s p o r t e l , l i t h i u m ，a r a b i d o p s i s n 缩略词 英文缩写英文名称中文名称 6 - b a 6 - b e n z y ia m i n o p e r i n e 6 - 苄基腺嘌呤 a e r a c r y l a m i d e 丙烯酰胺 a m pa m p i c i l l i n 氨苄青霉素 b b n - n - m e t h y l e n eb i s a c r y l a m i d e 甲叉双丙烯酰胺 b p b a s ep a i r s 碱墓对 b s ab o v i n e8 e l - u r na l b u m i n 牛血清白蛋白 d ) n a c o m p l e m , m t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d互补d n a c d s d i n g $ 4 x i i i e u c a ) 编码序列 c e a l c a t i o n ：p r o t o na n t i p o r t e r - 1 阳离子，质子反向转运器家族1 d d a y 天 d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 d m s o d i m e l l l y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 d n t p d e o x y n u c l e o f i d et r i p h o s p h a t e “u s u a l l yam i x脱氧腺营三磷酸( 删 o f d a t p d t t p d c t p d g t p ) d t t p d c t p d g t p 的混合物) d t td i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e be t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e d 呵a e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e f i ca c i d 乙二胺四乙酸 e s t e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s 表达序列标签 g f p g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 绿色荧光蛋白 g u sm g l u c o m n i d a b - 葡糖苷酸酶 h h o u r 小时 h y zh y g r o m y c i n 潮霉素 i p t g i 脚o p 岫l h b p - d g a l t 0 】p y 哪i d c 异丙基一b d 硫代半乳糖苷 k 矾 k a n a m y c i n 卡那霉素 l mk i l o d a l t o n 千道尔顿 l b l u n a b c r t a n im e d i a l u r i a - b c n a n i 培养基 m 咂s 2 - ( n - m o r p h o l i n oe t h a n c s u lf o n i ca 6 d ) 2 - n 吗啡啉乙烷磺酸 m i l lm i n u t e 分钟 m r n a m e s s e n g e rr n a 信使r n a m s m u r a s h i g e - s k o o gm e d i a m s 培养基 n cn i t r o c e l l u l o s e 硝酸纤维素膜 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 v i i i a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p e g p o l y e t h y l e n e g l y c o l 聚乙二醇 p m s f p h e n y l - m e t h y l - s u l f o n y i - f l u o r i d e 苯甲基磺酰氟 r r i f a m p i c i n利福平 r n a ”ar i b o n u c l e a s e a 核糖核酸酶a r 1 4 rr e 胃s e m m s c r i p t a s ep o l y m c 粕s ed h a i n逆转录p c r r c a c t i o l l s e c o n d 秒 s d ss o d i u n ld o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 s d s 抛g es d s p o l y a c r y l a m i d e 霉e ie l e c u o p h o r c s i s s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 s m s t r e p t o m y c i ns u l f a t e 硫酸链霉素 s o ss a l to v e r l ys e n s i t i v e 盐超敏感 s s cs t a n d a r ds a l i n ed h a t e 标准柠檬酸钠盐 t a et r i s a c e t a t e e d l a t r i s - 乙酸电泳缓冲液 t et r i s _ e d t a t r i s - 盐酸电泳缓冲液 t e m 哐d n ，n n ，n - t e t r a m e c h y le t h y l e n e d i a m i n en ，n n ，n 一四甲基乙二胺 怖 t r i s ( h y d r o x y l ) a m i n om e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 、t w i l dt y p e野生型 x - g a l5 - b r o m o - 4 - e h l o r o - 3 i n d o l y l b - d - g a l a c t o s i d e5 一溴4 氯一3 一吲哚一i ；- d 一半乳糖苷 x - g l u e5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - p d - g l u c u r o n i c 5 - 溴4 氯一3 吲哚b - d 一葡糖醛酸 a c i d v i i l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：当多如 时间： 加。年，月2 ；日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：鹱彩为 时间： 如。年，f 月弓日 导师签名： 圜 时问：如p f 年，月弓日 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 盐对植物的伤害及植物的耐盐机理 1 1 1 引言 植物必须最大限度的利用周围的环境来生存和繁衍植物不能够像动物一样快速的运动也就 意味着植物生长被很多环境因子所限制。当遇到不利的环境或逆境胁迫时，它们要依靠自身的生 理或形态的变化来抵御逆境胁迫 盐胁迫影响全世界的农业生产。尤其是对干旱半干旱地区的农业生产影响尤为严重。全世界大 约l ，5 的灌溉农田受到盐胁迫的严重影响( f l o w e r sa n d y e o 1 9 9 5 ) 植物在高盐环境中生长，臆 质中盐离子的积累导致了新陈代谢过程的破坏及生长抑制植物对盐胁迫的响应是非常复杂的。 它们必须协调起来互相作用以缓解细胞的高渗胁迫和离子平衡的紊乱。 1 1 2 盐胁迫对植物的伤害 一般根据植物能否在高盐环境中生长，将其分为两类；甜土植物和耐盐植物( f l o w e r se t a l 1 9 7 7 ) 耐盐植物可以在高浓度= n a c l 存在下生长，有一些甚至可以在超过两倍的海水的盐浓度下 生长。但是大多数的植物，包括大多数的农作物都是甜土植物，它们并不能耐受高浓度的盐离子。 对于甜土植物来讲，盐对植物伤害主要表现为渗透胁追、离子伤害等初级胁迫和由此引起的 包括氧化胁迫及营养不平衡在内的其它次级胁迫( z h u ，2 0 0 t ) 渗透胁迫和离子伤害目前被认为是 对植物危害的两个主要过程 1 1 2 1 盐对植物产生的初级胁迫 植物细胞内离子浓度的平衡对活细胞发挥正常的生理功能是非常重要的。土壤中过多的盐离 子会在许多方面影响植物的生长和发育。正常状态下，植物的胞质内都维持一个正常的k + n a + 比， 其中c 的浓度相对较高而n a + 相对较低胞内钾钠的平衡对于许多胞质酶活性是非常重要的 离子特异性的胁迫包括胞质内l ( 俸a + 比的降低以及较高的n a + 和c r 的浓度等，而胞质则是许 多酶类发生重要的生化反应的场所当受到盐胁迫时，l q a + 会通过n a + c 共转运体与c 竞争。并 且还可能会抑制盐胁迫下根细胞特异性c 转运器这将会引起毒性n a + 的积累和c 的缺乏( z l m ， 2 0 0 3 ) 此外盐胁追还会导致n a + 对膜上c a 2 + 的取代，从而破坏膜系统( c r a m e r e t a i 。1 9 8 5 ) c a 2 + 在稳定膜结构、维持膜的完整性方面具有重要作用当细胞内c a 2 + 缺乏时易引起细胞解体 另外高浓度的盐离子会使介质的水势下降，水分的有效性降低，造成植物吸水困难导致植物 细胞失水，使植物产生生理干旱。对植物形成渗透胁迫( 图1 1 ) 植物受到盐胁迫后。生长速率 下降，其下降程度与根际渗透压成正比。近年来以提高植物抗旱能力为目的的基因工程研究表明； 转基因植株在提高了抗旱能力的同时，耐盐能力也得以提高( g a v ii g s h o r e ta 1 。1 9 9 5 ) ，表明盐胁 迫对植物可产生渗透胁迫效应。 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 田i - i 盐( n a c i ) 胁迫对植物引起两个伤害：( 1 ) 由渗透胁迫引起的非特异性的失水反应l ( 2 ) 由胞质毒性+ 积累造成的特异性的离子胁迫( n a k a y a m a e t a l 2 1 ) 0 5 ) 1 1 2 3 盐对植物产生的次级胁迫 离子毒害、渗透胁迫等初级胁迫还会对植物产生次级胁迫如植物的营养不平衡、细胞生 理结构的变化、膜的去极化以及活性氧的过多积累所引起的引起氧化胁迫等( z h u , 2 0 0 2 ) 1 1 3 植物耐盐的分子机制 植物对盐胁迫的响应是许多复杂的过程，它们必须协调起来互相作用以缓解细胞所受到的伤 害包括调节离子和渗透平衡，胁迫损伤控制，修复和脱毒以及生长调控等，包括合成小分子有 机渗透剂酶类的基因，蛋白质类保护剂的基因，涉及盐分吸收、转运和在细胞中区隔化分配的一 系列酶类基因。涉及碳代谢转变或调节酶类的基因，以及受激素调控的基因或调节生长发育特性 的基因等( z h u , 2 0 0 1 ) 1 1 3 i 盐胁迫下离子平衡的调节 各种各样的离子转运器在限制n a 十进入细胞，促使n a + 流出细胞，调节n a + 在液泡中的区域化 作用以及选择性的导入c 离子等方面发挥作用。当遭受盐胁迫时，植物需要激活一些离子转运 器或增强它们的活性，另一方面需要抑制其它离子转运器( 如n a + 内流转运器) 的活性。此外， 在盐胁迫反应过程中许多转运器在转录水平上受到调控( h a s c g a w a e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。理论上，可以 利用三种机制阻止过多的n a + 在植物细胞质中积累。 2 中国农业大学博七学位论文第一章文献综述 首先，可以通过调控n a + 内流转运器限制n a 十进入细胞内盐胁迫下限制n a + 从根细胞或者木 质部蒸腾流进入植物体是保持胞内正常的k * n a + 比的一个途径之一钠离子进入细胞通过高亲和 性的钾离子转运体h k t l ( r u se ta 1 。2 0 0 d 和非选择性的阳离子通道 其次，可以通过液泡膜n a i + 反向转运器将进入细胞内的n r 转运和储存于液泡中植物受到 盐胁迫时。往往把盐从细胞质和细胞器中清除出去，使其集中于液泡中，这种现象被称之为盐的区 隔化。这种犒n a + 区域化在液泡内的生理过程是植物细胞耐受盐胁迫的高效策略，因为储藏于液 泡中的n a + 有助于渗透势调节。当植物受到高盐胁迫时，其体内的离子平衡遭到破坏，从而导致 n a + 毒害，帮助植物在盐胁迫环境下维持离子内环境的相对稳定对于植物抵抗盐胁迫至关重要。 许多研究发现各种逆向转运蛋白和质子泵在维持植物对盐胁迫的耐性方面发挥着重要作用。 一些天然耐盐的盐生植物依靠在液泡内积累大量的n a + 增强耐盐性液泡膜n a + h + 反向转运 器基因已经在一些甜土植物中得到克隆( 椭e ta l ，1 9 9 9 ；, g a x i o l ae tm ，1 9 9 9 ；f u k u d ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 液泡膜n a + t r 反向转运器基因a t n - d i 超表达的转基因拟南芥( a p s ee te 1 。1 9 9 9 ) 、油菜( z h a n ge t m , 2 0 0 d 和西红柿( z h a n ga n db l u m w a l d , 2 0 0 d 耐盐性大大增强但这个策略有一个潜在的局限性： 一些关键的细胞如根分生组织细胞没有大液泡实际上，野生型的a t n t t x l 基因在根分生组织中 不表达。因此，根分生组织依赖下述机制阻止过多的n a + 在细胞质中积累( s h i e ta 1 。2 0 0 2 ) 。 第三，可以通过质膜n a + w 反向转运器将共质体中雕j n a + 排出到外部生长介质或质外体空间 中。在裂殖酵母( s p o 柚e ) 中，质膜n a + i - i + 反向转运器基因s o d 2 突变失活后耐盐性降低，而s d d 2 超表达后耐盐性增强。当将一种耐盐蓝细菌的质膜n a + i - i + 反向转运器基因转入淡水生蓝细菌中使 其超表达后，大大增强了淡水生蓝细菌的耐盐性，以致于这种光合生物可以在高盐环境或海水中 存活。研究表明，在高盐浓度下植物可以通过质膜的n a + 小+ 逆向转运蛋白，逆n a + 浓度梯度将n a + 运 出细胞，以维持细胞质n a + 稳态和n a + c 比相对稳定，减少n a + 对胞质中细胞器的毒害。质膜n a + ，i r 逆向转运蛋白主要与植物对n a + 的外捧有关。在植物体内顾膜 ra t p a s e 利用水解a t p 的能量把 旷从细胞质中泵出细胞，产生跨膜的旷电化学势梯度，提供能量，驱动质膜上的n a + 但+ 逆向转运蛋 白，使i + 顺其电化学势进入细胞。同时n i a + 逆其电化学势捧出细胞，以维持胞质内的低h i a + 水平 s o s i 基因是植物中第一个也是目前为止唯一得到克隆和鉴定的质膳i n a + h + 反向转运器基因( s h i e t a 1 ，2 0 0 0 ；s h ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 超表达s o s l 的转基因植株及其愈伤组织耐盐性增强( s h i 矗d 。2 0 0 3 ) s o s i 基因的表达集中在根尖表皮细胞和根、茎、叶中位于木质部，共质体边界的薄壁细胞中由 于根分生组织细胞中没有大液泡，并且液泡膜n 丑+ 埘+ 反向转运器基因h t n i 吼l 在根分生组织中不表 达，因而s o s i 作为质膜n i h + 反向转运器在保护根分生组织中起着至关重要的作用( s h ie ta 1 。 2 0 0 2 ) 在盐胁迫生理学中一个重要的问题是n a + 从根到茎的转运问题。生理学研究表明，盐生植 物和耐盐的甜土植物活跃地将n a + 从根转运到茎，而对盐敏感的植物则似乎阻止n a + 进入蒸腾液流 中s o s i 作为质膜n 办i + 反向转运器z e n a + 从根到茎的转运中发挥着重要的作用，这可以从鼠琏， 基因的表达模式及在盐胁迫条件下野生型和s o s l 突变体的根和茎中n 矿含量差异得到说明f s h ie t a 1 。2 0 0 2 ) 。因此，离子转运系统的调节对于植物耐盐性是非常重要的 钾离子是高等植物细胞中含量最丰富的阳离子，也是高等植物生长发育所必需和唯一的一价 阳离子，它在植物生长发育过程中起着重要的作用，是多种酶的活化剂，参与了蛋白质的合成、 同化物的运输、水分代谢、蒸腾作用、光合作用和呼吸作用等植物生理生化过程，调节植物体内 的阴阳离子平衡等，因此盐胁迫下k + 的吸收和保持是非常重要的( c h i n n u s a m ye ta 1 。2 0 0 5 ) 。在 3 中田农业大学博士学位论文第一章文献综述 拟南芥中，r 的转运主要通过h a k p ，k t 转运蛋白家族，k a t 和a l 【t 通道蛋白家族，n h x 反 向转运器以及还可能通过一些目前尚未鉴定功能的c 及k e a 家族成员等( p a f d o e ta 1 2 0 0 6 ) 在盐胁迫下，为了避免细胞损伤和营养缺乏，植物需要维持足够的c 营养和适宜的k n a + 比，而 盐胁迫会使胞质的k * n a * 比大大降低，因为物化性质的相似性，n a + 会与c 相竞争引起c 缺乏 ( m a a t h i u sa n da m 缸伽1 9 9 9 ) 1 1 , 3 , 2 小分子渗透调节物质的合成 主要包括l 艟酸甘露醇脱氢酶类基因( m o l d ) 、6 - 磷酸山梨醇脱氢酶基因( g l l d ) ) 、脯氨酸生 物合成的关键酶( p s c s ) 及甜菜碱醛脱氢酶基因( b a d h ) 等，其中甜菜碱与耐盐性关系密切，且 合成酶系统相对简单，且微生物与高等植物的b a d h 有很高的同源性，已用于基因工程培育耐盐 植物的研究较多目前报道的可以提高植物耐盐性的一些渗透调节物见表1 1 襄i - i 超表达渗透调节物质提商量物耐盐性的有关报道( a 曲m 瑚m y e t - l ，2 5 ) e 麟黜：川怛帆岫喘徽：妒岫一b 岫嘲d n d n 种t 帅n 口e 哪 e 糟“w ，d a 用 汹岫静r m 矗雌口i 枷埘a ec o i l _ “d删词- h r e ”h i e 憎靴l n 柚稿“d r h e d 矾t e 挪- f o f 吨州种卧- d 钿i 自“n 耐i a w l d- i 州i t r o 细m - 耐，_ i l ， 埔bs 弋i 螗蚺 r c d m c t k i n ；h e n “州一i o 5 嘎f d 淑墩噶f q m l r dp l m hi 釉i l 甜 n c 1 d 舯一h d 珊r ，- b o 岫io - r n h n - pt h t 忡h _ t m u dd 吩，秭 r e f u s e ) d - - _ h 岫 s i 确 ? 糯麓撇绺 3 _ 州。”“山h 釉岫。幽m “ m i v 瑙m n ” c i y d j ek e b 臀 “自强h 附咖州舯矗c 函la 一甜幽k 出 钟r - h 0 峨蠕- t 姗_ mn a c t 傩t - 堆率_ ，州- i d i a e 们甜- 甜洲m m n 峨蜘l 啪“p 科i 州h 酊一 4 0 ( i m ”n 棚 a 咖的删缸( “ 蛳州l o t 赫f a 耐rr m 嘲，1 0 j e t i 黛m m m 枷秭 r o t ”巾t h _ f ，柚 i * - 咖，蚰c 硪庙嘶倒i l i c 甜崞曹州h t 慵h i 靠l d ， c t 惴棚 一_ 峨h j 帅 fr 炳 晡l - - 一e d 由。牡m 麓m 埔- 帅- k 稀4 蚺 蚪b 蚺年冉附- 竹岫 e n dh 1 日叶t d 曲kd e b ，d r o t e | 1 0 d e r # r e 螂( 】h a c rr 州甘f 哥f 埔d b 帅 瑚 l 瑚l 脚 i n h 帅i e n m i d 4 ，- 咖l l l - h _ i h 二d a 川、口拍_ 帅h 如m _ h h h - - ， | i t l + u p ；r _ m 捌硼r h - l “n _ 如 摊i - - 村蝴 m h 、d r w - w 鼬d mp ” u r e t e rm “* l 印h hp | m l 啦 h d 肌删t r e e 舢 。锗喘 酱燃繁= ：= ：= 留k m do - hb tm a i m w e dx + 时” p r o l b k y 枷- 蚺州舶lj t 虻s l a l 卜“榔n 州s r o 州u 帕 魄叫p - _ i t 囊孓a l “蚺k 畸b b - ”i8 e e e y 轴删坳妇l 麒j 柚岫蛔甘m 唧h 一畔o 妯栅_ - - d 竹t h - i v 2 2 前- 时 m 蜊鬣基勰蠹雪需：黜曲一屯测箔黝樱r h b “心 膏* i 辨he n di l l l k l ( tt p m i , 吣) i h j l k - “善譬p 州。蜘蛔p ”山删舭唿雒2 篙：艘2 祭怒瞻一 t | 啊田n 酗一 l 略 t _ 龋甜- l ，帖 b 矾* t i 也1 9 ” - e h _ l 姗 鲰时d 竹一 1 9 9 7 翻h t 撕i ，- - d i ，町 铽酗“e e l 岬心 m l 埘一 ，吐 n “h l m h 岫叫d l 姗 i c ；- a _ k k - i 州撕 目- - _ t 9 蟹 z i _ 一i q p j l h i l 舯呻 n _ 帅一t 1 睁 撇 挪一 雾趋墨 l 一 4 栅 船一 苍；l鎏 1 1 4 植物响应盐胁迫的s o s 途径研究进展 盐胁迫影响全世界的农业生产植物在高盐环境中生长，胞质中钠离子的积累导致了新陈代 谢过程的破坏及生长抑制为了避免盐胁迫对生长和发育造成的伤害，植物有一套机制来保持胞 质的低盐水平其中一个机制就是通过转运蛋白把胞质中的钠离子转移到液泡中或者运出胞外 这种运输由存在于液泡膜或者是质膜的n a + h + 反向转运器来完成通过筛选拟南芥盐敏感突变 体，鉴定出了一条与盐胁迫应答直接相关的调控途径，即s o s 调控途径此途径包括三个基因， 分别命名为s o s i 、s o s 2 和s 0 5 3 这三个基因突变之后，拟南芥植株表现出对盐的敏感性，其 中s o s l 最敏感( s h ie ta 1 2 0 0 0 ) 田1 2 盐胁追下调节离子转运嚣的裹达和活性，以保持较低胞质n a * 浓度的信号转导途径( z i m 。2 0 0 3 ) s o s l 基因是植物中第一个也是目前为止唯一得到克隆和鉴定的质膜n a * h + 反向转运器基因 ( s h ie ta 1 。2 0 0 0 ) ，它与细菌和真菌质膜的n a * h * 反向转运器有较高的同源性它对细胞n a * l c 平衡的维持及植株的耐盐性都起到重要的作用超表达s o s i 的转基因植株及其愈伤组织耐盐性 增强( s h ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 印田基因的表达集中在根尖表皮细胞和根、茎、叶中位于木质船哄质体 边界的薄壁细胞中。这也表明了根在盐胁迫应答中的重要性。s o s i 的表达特点及其突变体对盐的 敏感性，表明它可能行使如下几个功能：首先，将n a * 排出到胞外；其次，通过减缓n a + 在胞质 中的积累，为n a + 进入液泡节省了时间；第三。通过n a + 在木质部和韧皮部的装载和卸载，控制 了n a + 在根和叶片闻的远程运输( s h ie ta 1 。2 0 0 2 ) s n 鼢编码一个丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，它含有一个n 端的催化区和一个c 端的调节区( l i u e t a l ，2 0 0 0 ) ，它们之间的相互结合使s o s 2 激酶失活。负责这种结合作用的是c 端调节区上的 “f i s l 元件( g o n g e ta 1 ，2 0 0 2 ) ，它同时也是s o s 3 结合的位点，该元件删除之后，s o s 2 变成组 5 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 成型激活的激酶 s 0 5 3 编码一个c a 2 + 结合蛋白，它含有一个豆蔻酰化位点和三个与c a 2 + 结合的e f 手型结构域 将s 0 5 3 的豆蔻酰化位点和c a 2 + 结合域突变之后，拟南芥植株表现出对盐的超敏感性，这表明了 两个结构对s o 鼢功能都是必须的( 1 s h i t a a i e ta i 。2 0 0 0 ) s o s 3 在膜上的定位可能有助于它对目 标离子转运器的调控 盐胁迫下，细胞内c a 2 + 的增加，激活了s o s 3 ，s o s 3 与s o s 2 的“f i s l 竹元件结合，使得s o s 2 的催化区暴露出来，转变为活性状态。s o s 3 s o s 2 复合物激活了s o s i ，提高了质膜n a + h + 反向 转运的能力，阻止了n a + 在细胞内的过多积累( 见图1 - 2 ) s o s i 被认为是s o s 途径的产物或者对象，它的活性被s o s 2 ，s o s 3 控制。当植物在氲n a c i 环境 中时，娜7 基因表达被正调控，这种盐的调节部分的被s o s 2 和s o s 3 调节( s h ie ta l 2 0 0 0 ) 转运实验证明了质膜 k j n a + h + 交换活性相对于野生型在j 中降低了，这种活性在体外不能被加 入有活性的s o s 2 蛋白而恢复。q i ue ta 1 ( 2 0 0 2 ) 报道s o s 2 和s o s 3 基因的突变导致了质g l q a + i - i + 交换活性的降低；然而，在这些突变体中的转运可以被体外加入有活性的s o s 2