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几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析中文摘要 中文摘要 实验测得了孔石莼( c 协口p p r 加口) ，浒苔( 砌纪加聊d 矽加即厦厣m ) ，格式礁膜 的( 坳，z 的玎柳胖纠跆f ) 而吐基因；孔石莼( 明馏矽砌孵) ，浒苔( 勘招m 聊础 刀加z 扣m ) ，格式礁膜( 胸，2 d 占加聊口胖v f 耽f ) 5 8 sr r n a 基因；孔石莼( 研阳严，觚口) ， 浒苔( 勘纪阳m d 印妇p r d 跪力朋) ，宽礁膜( j l 如加船d 聊胁汹砌扰垅) 1 8 sr i 斟a 基因； 浒苔( 勘幼d 聊d 础口p 阳磁撇) 格式礁膜( 勿刀d 咖移掰口胖调协) i t s 基因。通过 基因序列分析多种石莼目绿藻分子系统发育关系。序列数据经c l u s t a 1 8 软件排 序后，采用m e g a 2 软件根据m u r a s 双因子法计算遗传距离，并应用邻接法 ( n e i g h b o u r - j o i n t 岫和最大简约法( m a x i m 邶：lp a r s 妇o n y ) 构建系统树，b o o t s 仃a p 法 ( 1 0 0 0 次重复) 评估分支可信度。将5 8 sr r n a 基因、1 8 sr 】心渔基因、i t s 基因和 而吐组合起来，分析了多种大型绿藻的系统发育关系。 系统地讨论了海藻d n a 提取，建树方法的选择，石莼属和浒苔属的发育关系， 缘管浒苔的分类地位，浒苔的分类地位，扁浒苔和肠浒苔的关系，礁膜、宽礁膜和 格式礁膜三者之间的亲缘关系，袋礁膜、格氏礁膜和北极礁膜之间的亲缘关系。我 们认为石莼属和浒苔属不是严格区分的，缘管浒苔和浒苔都应并入石莼属，条浒苔 和肠浒苔是两个不同的种，格式礁膜和袋礁膜是同一个物种，袋礁膜和北极礁膜是 不同的种。 关键词：石莼目；5 8 sr r n a ；1 8 sr i 矾a ：r 6 吐；i t s ；系统发育 作者：张耀东 指导教师：沈颂东 ! 塑型塑里笪! 竺! 竖堡! ! ! ! ：! 翌! 望! ! 型! ! ! 苎堡! 里型翌! ! ! 壁! 垒! ! 塑堕 。o 。_ - 。i _ _ _ 。_ _ _ _ - _ - _ _ _ - _ _ - _ _ _ 。_ _ - _ _ _ - 。、_ _ _ _ _ _ _ - _ = _ _ - _ _ _ _ _ - - i - _ _ - 二；_ _ _ - _ o - - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ - _ _ - _ - _ i _ - _ _ _ - - _ _ _ _ _ - - - 一 一 一。一 t h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i so fs e v e r a lu l v a l e s l a r g em a “n ea l g a e a b s t r a c t 而c lg e n es e q u e n o tu v np e r t 凇a e m e m m o 翟蛔p r o l 谚r na n dm 0 n o s 昀m 口 g 陀，f 耽fw e r es e q u e n c e d 5 8 sr r n ag e n es e q u e n c eo f 明v 口p e 咖口，砌纪加聊d 伊施 胛厦尼，口觚d 朋r d ，z 的聊口g 理1 ，舭fw e r es e q u e n c e d 18 sr 附、丁ag e n es e q u e n c eo f 研阳 p 旧慨上z f 目心 ”d 巧砌j p m 龙z ，厂口a n d 勿即d 譬疗d 厅z 口 触砌阳啊w e r es e q u e n c e d i t sg e n e s e q u e n c eo f 点砌f p 加聊d 巾砌p 加埕厣阳a n d 勿门o s f r d 聊口g 愆1 ，讹fw e 陀s e q u e n c e d 1 k s e q u e n c e s 坝淝a l i 驴e du s i n gc 1 u s t a lx 1 8c o m p u t e rp r 0 酗n ，1 e nu s e dt 0c a l c u l a t e d d i s t a i l c em a t r i 】( 讹飚n 姗邯t w 0 - p 础l r i l e t e rm e n l o da i l dc o n s t r u c tp h y l o g e n e t i c 骶e sb y 印p l y i n gn e i g l l b o r - j 0 i n j n ga n dm a ) 【幽p a r s i i i l o n ya n a l y s e su s i n gm e g a 3 1 c 伽叩u t e p r o 伊锄b 0 0 t s t r a p 孤a l y s e sw c r ec 删e do u tt 0e v 2 l l u a t es t a ：t i s t i c a lr e l i a b i l 埘b a s e do n 1 0 0 0r e s a i 】叩l m g so f t h ed a t as c t t 1 1 i sp 印e rd i s c u s s e si ) n ae x 删i o no fm 撕n ea l g a e ，m e t l l o do fc o n s t n l c t i l l g p h y l o g e n e d c 仃e e ，r e l a t i o n s k p o fu v aa 1 1 d e n t e r o m o 印l l a ，t a x o n o i i l i cs t a t u so f 五协p 阳聊o ，p i i z 口肋黝髓d 勘胞聊竹d ，p 砌即蟛邑阳，g e n e t i cr e l a t i o r 枷p0 fj ) i 勿栉鲫抛肌口 g 化v 觑f ，胸玎d 肋叼m 口玎f 玎d 切l 锄d 朋r d 疗f 阳聊口肠髓姆砌甜聊，g e n e t i cr e l a t i o n s l l i po f m b 舶豇r o m 口a n g i c m 硷，a 如加s t r o m 口t i c t l m 越am f 0 黯叼m 口g 作v 戤e i u k aa 随 e n t e r o m o 硒1 1 aa r en o td i s t h l c tg e n e r a 面纪阳m o p 蛔z 眈瓣a n d 互h 地加聊d 垆砌p 粕z 咖m a r ei 1 1 c l u d e di i l u l v a ，勘招阳聊d 伽砌纪j f 切口玩a i l d 砌胞加聊唧施唧陀，口a r e d i 任e r e n ts p e c i e s ，胸，2 嬲肋力加甜c 比姗锄d 胸甩嘲，2 口g 愆v 肌ja r es a m es p e c i e s ， 胸，2 加肌口册酮阳a r l d 胸刀加所口口阳f f c 堋za r ed i 日e r e n ts p e c i e s k e yw o r d s ：u 1 v a l e s ；5 8 sr r n a ；1 8 sr 】州a ；柏吐；i t s ；p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p w m 【e nb yz h a l l gy 幻一d o n g s u p e r v i s e db ys h e ns o n g d o n g 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名：二墩日 期： 立攀& ：垒站 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 期：矽p 奠蕊 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析前言 l 上_ - j - - 刖吾 1 分子系统学研究概况 分子系统学是近3 0 年来发展起来的一门综合性学科，是通过检测生物大分子 包含的遗传信息，定量描述分析这些信息在分类、系统发育和进化上的意义，从而 在分子水平上解释生物多样性、系统发育及进化规律的一门学科。它是一门交叉性 很强的学科，以分子生物学、生物化学和仪器分析技术的最新发展为手段，其研究 结果已经用于系统分类、物种鉴定、生物保护等多个方面。 1 1 分子系统学的形成及其发展简史 几个世纪以来，博物学家和生物学家一直都在对生物多样性进行描述和解释， 这种工作及其结果便是生物系统学( s y s t c m a 廿c s ) 。系统学的研究是建立在分类学 基础上的，而对生物进行分类是人类认识生物世界的第一步。海克尔提出了系统发 育( p h y l o g e n y ) 这一概念，但早期建立起来的生物系统史很少有客观标准。1 9 4 2 年，赫胥里( j h u 】【l a y ) 出版的进化论的现代综合中仍未出现系统发生这个词。 后来，德国植物学家齐默尔埋( w z 油m e r i i l 锄) 建立了顶枝学说( t e l o m et l l e o 巧) 、 德国昆虫学家亨尼希( w h e n m g ) 创立了分枝系统学说( c 1 a d i s t i cs y s t i 锄撕c s ) 。6 0 年代开始，随着计算机的迅速发展与普及，计算机软件和硬件广泛应用于数据的处 理，使系统发生经历了长足的进步，同时进化学家开始应用蛋白质和核酸分子结构 检测的方法。这样，一门新的学科分子系统学就应用而生了。分子系统学的发 展根据研究方法的不断进步大致经历了三个阶段：2 0 世纪5 0 6 0 年代，分子系统 学的研究方法局限于蛋白质水平。5 0 年代，采用免疫学方法在脊椎动物亲缘关系的 研究上取得了一定的成果，后随着科学技术的不断进步，1 9 5 5 年s “t b j e s 首先发 明了淀粉凝胶电泳技术；6 0 年代中期，h u b b y 等应用同功酶电泳方法揭示出动物自 然群体中存在着大量的遗传变异，等位酶、同位酶技术开始成为分子系统学的重要 手段。 7 0 年代，分子系统学研究进入了核酸水平。7 0 年代末期，m t r n a 的限制性片 段长度多态性技术开始在脊椎动物和无脊椎动物的种群结构研究中应用；到了8 0 年代末期，m t d n a 开始日益成为动物分子系统学研究的有力工具。2 0 世纪9 0 年代， p c r 技术广泛应用，随之衍生出一系列分子生物学技术，如随机扩增多态性标记 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析前言 ( r a p d ) 、限制性内切酶片段长度多态性标记( i l p ) 、微卫星标记( s s r ) 、扩 增限制性片段长度多态性( a f l p ) 及核酸序列分析等。分子系统学在d n a 水平 的研究得到了迅猛发展，并取得了显著的成果。 1 2 分子系统学常用的研究方法及其应用 分子系统学的研究包括两大方面，一是蛋白质，包括核心蛋白、可溶性蛋白、 同功酶( 等位酶，系统血清学) ；二是核酸，包括核d n a 、线粒体d n a 、叶绿体d n a 等的分析，从分子水平上探索植物居群的遗传结构、研究植物遗传多样性、系统与 进化，揭示植物系统分类和进化的分子规律。目前，常用的蛋白质分析技术有：免 疫学技术、同功酶电泳、蛋白质电泳、氨基酸分析等。常用的核酸分析方法有d n a 杂交、串联重复序列数目变异、单链构象的多态性、变性梯度凝胶电泳、限制性片 段长度多态性、随机扩增多态性d n a 测序和克隆等。随着分子系统学的发展和研 究方法进一步完善，分子系统学得到了广泛的应用。如应用于生物分类学构建生物 分子树或生物进化树、系统树等，b r e c 锄( 1 9 9 1 ) 应用分子系统学方法，成功解 释了昆虫和宿主植物之间的协同进化关系。另外，在中草药的鉴定、分离，人类流 行病的分析、基因和基因组进化、生态学、发育生理学等方面也得到了广泛的应用。 分子系统学在生物保护中也具有重要意义，在确定生物保护单元和更好地理解群体 的历史过程方面发挥了重要作用，促进了保护生物学的发展。 2 植物分子系统学 2 1 植物分子系统学的发展简史 经典的植物分类学是研究植物分类原理、方法和实践的学科，包括分类 ( c l a s s i 丘c 拍o n ) 、命名( n o m e n c l 孤玎e ) 、描述( d e s 嘶p t i o n ) 、鉴定( i d e n t i f i c a t i o n ) 等内容。二十世纪六十年代初，z u c k e r k a n d l 和p a m i n g ( 1 9 6 5 ) 提出分子可以记载 进化历史的构想和“分子钟”( m o l e c u l a rc l o c k ) 的概念，即以年计时的氨基酸( 或 核苷酸) 替换率保持恒定，从而开始了利用分子进行系统与进化研究；同时利用同 功酶和细胞色素c 等蛋白质分子结构为依据的生化方法也得到了发展。七十年代， 酶电泳技术开始应用于植物系统进化的研究；二十世纪八十年代至今，人们开始以 核酸结构分析为基础，探索植物系统亲缘关系本质的研究。植物分类学已从单一的、 以形态描述为主的古典分类学发展到了当代多学科和方法综合的现代分类学。 分子生物学技术的发展，如植物材料的保存、核酸提取和标记技术的改进、p c r 技术的问世等，产生了大量可利用性状用于重建系统关系；大量分析方法和软件的 2 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析前言 应用，尤其是分支分析理论的提出与完善，使得利用大量原始性状研究系统进化树 成为可能。由于多种技术在植物分类学及系统学领域的应用，促进了植物分类学与 系统学革命性的发展。随着分子生物学的迅速发展并渗入系统学，产生了一门新的 边缘学科分子系统学( m o l e e u l a r 巧s t e m a t i c s ) ，就是在分子水平上对植物进行 系统发育研究的学科。狭义的植物分子系统学是指以核酸( 尤其是d n a ) 分析为 手段，探讨植物的系统发育。随着技术、手段的更新、d n a 序列数据的大量积累， 被子植物起源和早期演化领域涌现出许多新的热点并取得了很多鼓舞人心的进展， 用分子生物学方法解决系统发育问题的论文近几年来呈倍数增加。分子系统学已成 为系统与进化植物学研究的最大热点，不断改善人们对现存植物类群间系统发育关 系的认识。分子系统学结合形态分类学、解剖学、化学分类学、发育生理学、细胞 学、分子生物学等学科的发展，为探求接近真实自然的植物系统演化关系提供了新 的充满生机的途径。 2 2 植物分子系统学的研究特点 植物学家在研究种子植物各阶元分类群相互关系时，大多是建立在对多种营养 性状( 包括次生代谢物) 和生殖性状分析的基础上。不同学者对不同性状的不同加 权，导致了不同系统各分类群的范围及等级建立标准不同，甚至存在一些根本分歧。 植物学工作者都希望能突破表型性状的障碍尤其是人为主观性的干扰，寻求不受外 界环境影响、能真实反映植物亲缘关系的本质属性( 性状) 。分子生物学的快速发 展使得所有生物的分类学都发生了革命性的变化，分子系统学的出现为系统学研究 提供了良好的发展契机。分子系统学的分子指的是大分子即d n a 和r n a ，虽然 蛋白质和黄酮类化合物也是分子，但研究过程中核酸的应用倍受青睐。大分子数据， 尤其是作为一级信息分子的d 】姚序列数据，在进化研究中比形态学和生理学等更 为可靠，因此能够勾画出一幅更为清晰的生物亲缘关系图；其次，分子数据比形态 学数据更经得起数量处理的检验，很多复杂的数学和统计学理论已被用于d n a 序 列数据的分析；第三，分子数据量大，信息量大，非遗传变异影响小，包括大量不 连续性状，在构建系统树时不受人为主观因素影响，比较容易定量，因而被认为是 能够精确反映系统发育信息的性状。由于分子生物学技术和方法不断进步，分子序 列( 性状) 的获得并不比其它形态结构或生理生化性状的获得费事，所以分子资料 受到了人们的极大关注。现已被证明，分子数据对于理解陆生植物起源与演化、现 存各大类群之间的亲缘关系是非常有价值的，为综合评价各个分类阶元上的系统关 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析前言 系提供了大量新的假设。不难想象，在不久的将来，随着大量分子数据的积累，结 合古植物学的不断发现，植物系统发育研究将最终证实达尔文的梦想：“自然中每 个大界有一个相当真实的系统树 。 2 3 数据分析方法 系统树就是描述一群有机体发生或进化顺序的拓扑结构。系统树的表现形式多 种多样，根据研究所利用的数据类型，可选择不同的系统树构建方法。如距离矩阵 法，就是利用所有种的进化距离，依据一定的原则及算法来构建系统树，这种方法 首先要求原始数据以成对分类单元之间的距离形式表示，邻接法( n j ) 法就是距离 法中的一种，n j 法利用原始数据双重对比的距离矩阵来构建系统树，具有方法简 单直观、结果稳定等优点，但在n j 法的建树过程中，由于要将原始数据转化为距 离矩阵而容易导致数据的丢失，这就需要在构树前认真核对构树单元。另一种就是 离散特征法，就是利用具有离散特征状态的数据，如妊序列中的核苷酸的排列 等，建树时要充分考虑到每个特征或核苷酸位点在d n a 序列间的进化关系，如最 大简约法( m p ) 、最大似然法( m l ) 、等。简约法是基于简约性标准推论系统发育 的支序分析法，该方法直接应用原始性状数据，并不需要将原始数据转化成距离数 据，避免了不可逆转的信息丢失，与其他方法相比，较少依靠关于序列进化的假说， 但该方法只适用于亲缘关系密切的种类或序列之间的分析，对于进化时间比较长的 物种或序列，出于平行或回复突变的干扰，会得出不正确的结果。池法应用统计 来推断系统树，是比较可靠和有效的方法，目前主要用于核酸序列数据分析，但是 采用该方法时，要选择合适的参数模型，而且7 0 在序列长度较长或分类单元过多 时，计算复杂而且耗时巨大。各种不同的构树方法，在选择模型或计算方法上各有 利弊。系统树的构建方法，应该根据数据类型及来源选择，构树方法选择合理与否 是系统树能否正确体现系统关系的关键。 3 海藻分子系统学研究概况 分子系统学是指通过分析生物大分子如核酸和蛋白质或一些小分子来研究生 物不同分类阶元内和阶元间相互关系的科学，其在植物、动物和微生物系统学研究 中得到了广泛应用。但是，植物分子系统学研究多集中在陆生植物，对大型海藻的 研究尚处于起步阶段，而且主要是应用核酸分析的方法。因此，我们在这里只讨论 核酸分析技术在大型海藻分子系统学研究中的应用。 自1 9 4 4 年a v e r y 证明d n a 是遗传物质以来，核酸分析技术不断取得重大突 4 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析前言 破：d n a 双螺旋结构和d n a 半保留复制方式的发现为分子生物学的发展奠定了基 础；限制性内切酶的发现和d n a 体外重组技术的完善推动了分子生物学技术的高速 发展，也促进了限制性片段长度多态性( r f l p s ) 分析技术在大型海藻中的应用；d n a 测序技术和p c r ( p 0 1 y m e r 2 l s ec h a 证e a c t i o n ) 技术的发明及日臻成熟使核酸分析技 术成为分子系统学研究的主要方法，以p c r 技术为基础的m 心d 技术虽然在其它 生物中得到了广泛应用但由于海藻d n a 的提取和纯化问题使其应用只局限在有限 的一些物种，而p c r 产物直接测序和生物信息学的发展正在促使越来越多的研究 者采用核酸序列分析技术；其它近期发展起来的技术如扩增片段长度多态( a f l p ) 和单链构象多态( s s c p ) 等也在大型海藻中得到了应用。下面我们依次介绍各核 酸分析技术在大型海藻分子系统学研究中的应用。 3 1 大型海藻d n a 的提取 海藻分子研究的首要步骤是d n a 提取。在某个物种中成功应用的方法经常在 应用于其它物种时失败，一种特殊的研呵a 提取方法通常只在一个或几个物种中适 用( o i s e i l1 9 9 0 ) 【】而且一种方法往往不足以处理与d n a 提取相关联的所有问题， 只能针对不同的物种采取不同的处理策略。 大型海藻细胞不仅具有较高的核酸酶活性【2 】，而且细胞内含有大量的多糖【3 】， 在绿藻中，细胞壁纤维主要由木聚糖甘露聚糖纤维素组成，而且还有少量的葡聚糖 存在于细胞质中，另外还有大量的硫酸多糖组成细胞间物质。由于海藻细胞是水溶 性的，使得海藻细胞忍受渗透压的能力较强。海藻多糖将d n a 缠绕包裹其中，因 此，多糖的去除是海藻d n a 提取的难题。 为了减少多糖的影响，m a y e s 等( 1 9 9 2 ) 【4 】采用减数分裂后含有微量多糖的海 带孢子子作为d n a 提取的材料，所得纯化聊叮a 适用于限制性酶切反应、s o u t l l 锄 杂交和p c r 反应。这种方法虽然尽量避免了多糖的影响，但孢子子不易获得，在 数量和时间上对d n a 提取有很大限制。 通常，粘稠易溶的多糖在用液氮研磨紫菜( p d p 妙口) 组织的过程中释放，加m e t t 等( 1 9 9 1 ) 【5 】以紫菜原生质体为材料配合使用蛋白酶k 和酚抽提提取d n a ，获得 了较好的效果；h o n g 等( 1 9 9 5 ) 【6 】，利用l i c l 软化海藻组织替代液氮研磨也从紫 菜中提取得到了较高质量的d n a 戊功用于p c r 反应，为d n a 提取技术提供了新 思路。 一些学者尝试了使用少量干燥藻体提取d n a 。g o f r 和m o o o n ( 19 9 3 ) 【7 】保存 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析前言 在标本室达1 1 年之久的干燥的江篱囊果中提取d n a ，扩增了质体r u b i s c o 和核糖 体基因井测序，其扩增片段大小及序列与从新鲜藻材中获得的结果相似。s a u n d e r s ( 1 9 9 9 3 ) 【8 】提出一种快速，简单的胶纯化方法，从多种红藻干燥藻体中成功分离 出微量基因组d n a ，用于p c r 及进一步分析。 国内也有一些相关研究。郭宝太等( 2 0 0 0 ) 【9 】先用海螺酶处理紫菜叶状体制备 细胞，然后用s d s 、蛋白酶k 裂解细胞提取总d n a ，再用玻璃粉浆对其纯化，得 到的总d n a 可被完全酶切，同时建立了种极简便的质粒状d n a 提取方法。王勇 ( 2 0 0 2 ) 尝试紫菜丝状体中提取d 1 叮a 。刘泳等( 2 0 0 4 ) 【l l 】用碱煮法制备海洋浮 游生物d n a ，可以直接用于p c r 扩增。 3 2 随机扩增多态性标记( 黜心d ) 随机扩增多态性( m 心d ) 是一种建立在p c r 基础上的分子标记。其一般原 理是：以一个l o 碱基的任意核苷酸序列片段为引物，在未知序列的基因组d n a 上 进行随机的p c r 扩增，在反应过程中，引物将同源序列从非同源的竞争位点中识 别出来并进行扩增。其优点体现在：首先，它具有极大的丰富性，能反应整个基因组 的变化；第二，极大的探测性，无需合成特定序列引物；第三，高效性与灵敏性，可 在短期内获得大量的多态性d n a 片段，只要遗传特异性发生变化，即使亲缘关系非 常近的个体也能认别。此外，廿d 还具有简便、快速、费用低、分子认别率高、 对环境污染小等优点，因而它在植物技术中被广泛应用。在实际应用中也表现出不 足，如显隐位点性，在后代中不能区别是纯合体还是杂合体：稳定性较差，由于单链 引物随机结合在众多反向重复序列上，因而每次得到的实验结果不可能一致，解决 办法是对单链引物进行筛选，优化p c r 条件；高度的变异性，即使在亲缘关系非 常近的物种间，结果也造成很大差异。此外，t m 低的随机引物，易受外界条件影 响，如反应体系m 贮+ 浓度。反应使用不同引物导致产物信号差异太大，无法进行 分析。 在分子系统学中，凡啦d 方法已广泛应用于种群间亲缘关系、分类和系统发生 等方面的研究，并表现出了其独特的优越性。 廿d 技术在海藻分子研究中得到了广泛的应用如( 表1 ) 6 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析前言 p o s t e i s i ap d 湘a 咖瑚i s p 唧h y r q 4 c 脚砌d ”f c i 口陀f d g r a c i t a r i ag r m s g e l i d i m f 讥已 c z ，- 缸而删6 ，f c 口胁 c o y e re ta 1 ，1 9 9 7 b u t c h e ra n dk a p r a 岫1 9 9 4 o p p e n e ta 1 1 9 9 4 l i 等( 1 9 9 9 ) p a 撕a a n d v 觚d e r m e e r1 9 9 4 、，a l 甜( ae ta 1 2 0 0 0 鼬婶d 技术在大型海藻中的应用大多数为种株鉴定和遗传指纹【1 2 - 1 3 1 p a t 、 ，a r y 等 ( 1 9 9 3 ) 【1 4 】以g 勉f 扣f i 群珑为外群，应用黜谨d 技术研究了g e f 溉铭聊v 昭“搠的1 3 个隔离种群以鉴定这些隔离种群是否具有足够的遗传变异，作为能获得杂种优势的 亲本。研究表明，这两个种亲缘关系较远，z 访”聊v q 舒册各隔离种群间遗传变异 为o 1 0 3 ，形态上可区分的四个隔离种被用于杂交，产生一系列近交和杂交后代。 通过检测父本特有扩增产物的有无确定杂交后代，进一步的生长分析证明了杂种优 势的产生( p a 觚a r y 等，1 9 9 4 ) 阅。 c h 0 ( 1 9 9 7 ) 【1 6 】采用该技术对采自韩国不同地区的7 种石莼目主物进行了研究， 用j a c c 砌平衡计算出这7 种植物的遗传距离。和其他石莼目6 种植物的遗传相似 度最小，因而亲缘关系最远。用o p b 0 1 这条引物。其他绿藻都能扩增出6 5 3 b p 条 带，但是礁膜扩增带中未见这一条带。 h o ( 1 9 9 5 ) 【1 7 】的研究表明黜心d 可用于决定勋嘲，“所属种间关系和作为区 分个体的指纹图谱。 杨君等( 2 0 0 0 ) 【1 8 】对在大连海区采集的7 种海藻样品，采用心d 分析绿藻 门石莼属和浒苔属进行了分子系统学研究，所试的6 0 个引物中有3 2 个经扩增得到 了2 3 7 个多肽片段，分析结果表明，通过遗传距离分析，可以基本判断材料之间的 亲缘关系。从u p g m 聚类分析结果来看，除缘管浒苔和石莼属聚为一类外，都是 同属的首先聚为一起，然后是同为石莼科的石莼属与浒苔属再聚到一起，最后才与 刚毛藻属聚类。 李向峰等( 1 9 9 8 ) 1 1 9 】优化了廿d 反应条件并将其用于在同形世代交替的龙 须菜中检测基因组变异并寻找与时期和性别相关联的特异遗传标记。2 0 0 0 年，他们 又用m 心d 技术检测了龙须菜色素突变体基因组的变化，发现野生型藻株与突变株 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析 前言 基因组有明显差异。 贾建航等【2 0 】使用垤d 技术对4 种紫菜( pj ，眩d e 船趣p 砌订酐疗e 珊旭p 勋幻如扛 w ，| j i 纫z 枣哟厦肠和户斫匆唧p 删口f 册砌) 的1 5 个无性系丝状体进行了遗传多样性研 究，发现黜钮d 多态性比例达9 7 1 。根据2 条鼬心d 引物扩增的8 条多态性条带 构建了紫菜d n a 指纹图谱，该图谱可方便的应用于紫菜无性系的种质鉴定。 也有一些报道应用m 心d 技术进行大型海藻居群遗传【2 1 ，2 习和生物地理翔1 研 究。许多海藻属于同形世代交替，在形态上难以区分单倍体和二倍体，而砒心d 标 记的共显性特征对于这些海藻的居群研究是一个主要限制但在这些物种的人范围 系统地理研究中具有优势。经过与其它分子数据比较，、o p p e l l ( 1 9 9 6 ) 【2 5 1 认为 r a p d 适用于鉴定上百公里至上千公里的生物地理居群，孢子体和配子体的同时存 在并不影响大范围系统地理研究。 3 3 限制性内切酶片段长度多态性( r f l p ) 标记 限制性内切酶片段长度多态性i 心l p 技术，是1 9 8 0 年由美国b o s t e i i l 提出的， 是一种d n a 多态性分析技术，其基本原理是将目标d n a 序列经一定数目和种类 的限制性内切酶进行酶切，由于不同的目标d n a 的序列结构有差异，内切酶在其 上识别位点的数目和距离就发生了改变，因而产生相当多的大小不等的d n a 片段。 然后通过s o u t h e m 杂交可以把与被标记d n a 相关的片段检测出来，从而构建出多 态性图谱，进行系统进化和亲缘关系的分析。r f l p 分析可随机选取足够数量能代 表整个基因的砌l p 标记，且每个标记变异大，检测方便，用于探测r f l p 的克隆 探针可随机选择。目前在分子系统学中用于r f l p 分析的主要信息来源主要还是叶 绿体d n a ，它在植物细胞的叶绿体中拷贝数多，便于分离、纯化，容易获得；而 且叶绿体d n a 的资料较全面。 随着p c r 技术发展，人们将p c r 技术与盯l p 分析联合起来，先用p c r 扩增 包含多态位点的d n a 区域，扩增产物用限制性酶消化后经凝胶电泳分离检测；既 克服了标准i 心l p 分析需要大量d n a 的缺陷，也较单纯比较p c r 扩增片段大小可 检测出更多的变异。 s t i l l e 和w 砌a n d ( 19 9 3 ) 【2 6 】应用该技术分析了紫菜属核糖体小亚基s s u ( s m a l l s u b u i l i t ) 基因和i t s ( i n t e m a l 臼彻s c 舶e ds p a c e r ) 序列，结果表明目前的紫菜亚属不 代表一个单系群，传统的形态和生态分类特征不足以鉴定种和用于分析种间关系。 g o 行和c o l 锄锄【2 7 】首次将质体d n ar f l p 应用于红藻江蓠属( g r a c i l 撕a ) 不 8 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析前言 同种间、种内及不同种群间的分析，发现同属的不同种之间存在明显的多态性，而 同种的不同种群之间则带型完全一致，表明该方法可作为江蓠属分类和系统进化研 究的1 种新方法。 利用r f l p 进行多态性分析具有众多优点，主要表现在：第一，较高可靠性， 这是由限制性内切酶识别序列的专一性决定；第二，来源于自然变异，依据研蛆 上丰富的碱基变异不需任何诱变剂处理；第三，多样性，通过酶切反应来反映d n a 水平上所有差异，因而在数量上无任何限制；第四，共显性，指i 心l p 能够区别杂 合体与纯合体；第五，数量性，具有数量化。但也存在不足，如具有种属特异性， 在实际应用中受到限制；要制备放射性探针和进行s 0 u m e m 转移及杂交、放射自显 影，因而费时、繁琐、污染大，对环境和人体造成不良影响；此外，对d n a 含量与 纯度要求高，多态性水平低，技术难度高，只适应单“氐拷贝。 3 4 微卫星标记( s s r ) 在真核生物基因组内存在大量的重复序列，微卫星d n a 就是其中的1 种，其重复 单位一般由l 6 个碱基组成，重复次数在1 0 6 0 之间。1 9 8 9 年，3 个独立的研究小 组几乎同时建立了这一技术，并且证实它作为位点特异遗传标记具有巨大潜力( 曾 莉娟等，2 0 0 1 ) 【2 8 】简单串联重复序列的组成基元是1 “个核苷酸，由于在所有真核 生物基因组中随机分布，重复次数和程度也不同，因此使得其所在的基因座位呈现 出一定的多态性。微卫星d n a 在基因组中多态性高，并且等位基因数目多，呈共 显性遗传，其指纹图谱有极高的多态性，结果稳定可靠，重复性好，适用于任何真 核生物的系统进化研究( 徐宏发等，2 0 0 1 ) 【2 9 j 。 3 5 简单序列重复区间扩增多态性( h l ：t c rs i l n p l es e q u e n c er 印e a t ，i s s r ) i s s r 是在s s r 基础上开发的1 种新型分子标记。由于s s r 在真核生物中分布 非常普遍，并且进化变异速度非常快j 因而锚定引物的i s s r - p c r 可以检测到基因 组中许多位点的差异，可应用于遗传多样性分析、d n a 指纹图谱绘制和品种鉴定 等研究领域。s 【3 0 】用该技术对来自同一条河流，相距只有4 5 m 的5 个采样点的串珠 藻( 肋臼留c 办d 印p ，- 聊口协) 种群内的单配子体进行了遗传分析，发现每个配子体的整 体带型都不一致，根据带型构建的矩阵显示配字体间相似率在4 1 多钆8 2 。结果表 明，采自河流上游的个体和下游的个体亲缘关系较近，据此推测种群内可能存在基因 的流动或扩散。 孙雪等 3 l 】用i s s r 标记对7 种江蓠属海藻进行了遗传多样性研究，发现i s s r 标 9 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析前言 记的多态性达到7 7 4 8 。青岛产龙须菜与其选育种相似性最高( s 为0 9 3 9 ) ，而青 岛龙须菜与南非龙须菜的遗传距离最近( s 为0 6 4 3 ) ，并根据龙须菜在内的4 种江 蓠间的相似性系数范围值( 1 4 3 ) ，初步推断委内瑞拉龙须菜不属于龙须菜种。 2 0 0 5 年李文红等【3 2 j 还采用i s s r 标记对龙须菜的1 个野生群体和选育品系进行了亲 缘关系分析，发现野生型和选育品系的遗传相似性分别为o 7 3 0 1 和o 7 1 8 9 ，聚类分 析证明它们亲缘关系较近，并根据特异扩增片断构建了龙须菜选育品系的指纹图谱， 可用于区分龙须菜选育种群和野生种群。 i s s r 标记被证明比黜妞d 更可靠而且更接近孟德尔遗传因而适用于基因型分 析和基因组作图【3 2 1 。通过对淡水红藻肋护口c 矗d 印p 朋“珑6 d 伽，z 甜掰的分析，d o n a l d s o n ( 1 9 9 9 ) 【3 3 】，认为i s s r 分子标记在区分同一居群内单个配子体时很有用并将被证 明在系统地理研究和其它大型海藻研究中很有价值。 g l l i u i e n 血等【3 4 】从智利江蓠( g 如沈埘捃) 基因组d n a 文库中分离到6 个多态 微卫星位点，同时对2 个种群的遗传多样性分析显示种群内杂合度较低( 5 1 ) ， 此6 个微卫星位点可用于对智利沿海遭过渡开发的江蓠资源进行评估。w 砌e r 等【3 5 】 用分离到的4 个微卫星标记对世界范围内的江蓠( 西口c 肋蛔) 进行了分析，发现位 点g v l a a g 和g v l 地没有等位基因变异，而另2 个微卫星探针g v l c t 和g v 2 c t 在种群内显示出高度的多样性，因此该探针为江蓠科内不同物种的识别提供了有用 的遗传标记。 3 6 扩增限制性片段长度多态性( a f l p 标记) a f l p 兼具i 心l p 和乳心d 的优点，因此，a f l p 被认为是迄今为止最有效的分子 记。其优点如下：具较高的可靠性和高效性、具有共显性和显隐性、多态水平最高、 检测位点最多、操作简便、分子认别率最高、速度快、t m 值高、d n a 用量少等。 但a f l p 不是万用表，也存在二些缺陷，如对模板反应迟钝，谱带可能发生错配与缺失， 成本较高，对技术要求苛刻等。i 沁眦1 0 和d 1 1 l e l l l ( 2 0 0 0 ) p 6 】应用a f l p 技术研究了 彳胁妇朋口厂g 办刎的遗传结构，认为该种符合距离隔离( i s o l a t i o n - 1 ) y d i s t a n c e ) 模式， 遗传相似度随时间( 季节) 和空间( 海浪暴露度) 变化。 杨锐( 2 0 0 1 ) 【3 7 1 用此方法研究了浙江不同地理群体( 普陀列岛、渔山列岛、南 麓列岛) 及福建坛紫菜( 尸d 印砂阳办口f 砌以p 刀廊) 遗传多样性，指出遗传距离与地域 分布里正相关；在对野生型和养殖型的分析中，找到了与叶片厚薄性状相关的特异 分子标记。 l o 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析前言 k h s u m o ( 2 0 0 0 ) f 3 8 1 研究了翅藻( 彳胁砌聊缈咖口砌) 不同采样时间、地点的遗 传差异。利用a f l p 指纹图谱，分布相距几分米及大于1 0 0 k m 的个体都能够被区分， 遗传相似度变化范围为7 6 ( 相距几分米) 、7 1 ( 相距1 5 m ) 、6 7 ( 相距1 8 5 k m ) ， 遵循遗传距离与分布距离呈正比的关系，并且a f l p 图谱随采样时间的不同而呈现 季节性差异。 s c h a e 髓r 等【3 明成功的利用a f l p 标记对l i m o p h y l l u mm a r g a r i t a e 的2 个形态差 异较大的种群进行了种群间和种群内的分析，结果表明这2 个种群虽属于同1 个种， 但遗传分化较大。2 个不同种群内的遗传相似度分别为0 7 5 o 8 5 和o 5 5 o 6 7 ，这 表明在2 种形态差异较大的种群之间基因流动非常有限。 3 7 单链构象多态性( s s c p ) 能够区分d n a 片段的原理在于单链d n a 的分子构象是核昔酸序列特异性的， 这种构象随点置换、插入和缺失而改变，在聚丙烯酞胺凝胶电泳过程中这种构象改 变影响分子运动。z u c c a r e l l o 等( 1 9 9 92 0 0 0 ) 【钓。4 1 】应用该技术发表了一系列文章： 通过同时应用r u b i s c o 间隔区s s c p 和i t s i r f l p 分析阮曲) 旧厉招珊口嘲呖研口和j 9 l 阳妣口珊的亲缘关系，他们认为这个方法可以区分只有一个碱基对差异的序列： 园l d s 砂c 办细纪刀口栅西撇南方和北方居群r u b i s c 0 间隔区s s c p 的分析结果与报道的多 元醇模式分析结果完全相符。 4 核酸序列分析 通过测定核酸一级结构中核苷酸序列组成来比较同源分子之间相关性的方法 称为核酸序列分析方法( 徐宏发等，2 0 0 1 ) 【4 2 1 。对于分子系统学来说，d n a 序列 方法的结果可靠、直接，对近缘种或远缘种均适合。自p c r 技术出现后，使得不 仅从新鲜组织，而且从陈旧的标本中获得功妊也变得比较容易，因而p c r 直接测 序技术得到了广泛的应用。对组织样品中所获得的d n a 进行特定片段的序列测定 后，再用特殊的软件包进行分析，就可重建植物系统发育关系。植物分子系统学研 究中常使用的基因组有三种：叶绿体基因组、线粒体基因组、核基因组，但由于技 术要求以及耗费较大，目前的测序主要集中在r b c l 、i t s 等一些小的片段。目前， 核酸测序一般采用荧光标记的自动测序仪，同时也出现了相应的分析软件。 序列数据的真正应用用始于7 0 年代后期，8 0 年代中期p c r 技术的出现极大的 促进了d n a 测序的系统学应用，其最大优点是可以在实验室间自由互换，可以整 合进数据组分析和内分析。随着自动测序仪的应用盯和直接测定p c r 产物技术的 几种石莼目大型海洋绿藻的系统发育分析前言 日益成熟，近年来核酸序列分折越来越多地运用于海藻的系统发育与进化等研究中。 l i m 等f 4 3 4 5 】首先尝试将5 s r 鼢妣。应用于大型海藻分子分析，他们认为红藻和褐 藻在系统发生上关系较远，褐藻在较近的时期内快速多样化。后来，5 s r r n a 基因 由于序列短( 1 2 0 b p ) ，被证明存在明显的变异饱和及受到r r n a 二级结构的限制而 不再被采用【4 5 4 8 】 4 11 8 sr i 斟a 高度保守的编码区( 1 8 s ，2 6 s r d n a ) 主要适用于科及以上阶元。尽管这两个 区域可应用的一般分类范围非常相近，1 8 s 的全序列大小( 约1 8 0 0 b p ) 与2 6 s 基因 ( 大于3 0 0 0 b p ) 相比，更适于p c r 扩增和测序，因此1 8 s r d i n 删a 序列较 2 6 s r e n a 水n a 序列应用更普遍，后者常作为前者的替代和补充。早期大型海藻研 究同时应用部分1 8 s 和2 6 s 基因序列【4 9 】，后期则多采用1 8 s 基因全序列，而且研 究集中于大型褐藻和红藻。 p a t 啪r ) ，等【5 0 】对4 种石花菜( g 口，砌“m ) ，觑厂d c 概妇胁c 讽口和n g 阳c 死础p 如 c 印f 砌c p 口18 s 枞序列进行了分析，证实了，眦绷和p t e r o c l a d wp t e r r o c l a d i e l l a 2 个属间存在分化。h 觚唧等【5 l 】获得了珊瑚藻目的1 8 sr d n a 序列，发现c h o f e o n 锄a 属和珊瑚藻目其它属是平系进化的，将分子水平的证据同形态学、解剖学、超微结 构及分类学数据整合后发现c h o r e o n e m a 属非常独特，它具有多个生殖窠，应属于 h a p a l 础a c e a e 科，而该科还包括先前置于珊瑚藻科的亚科d 增d 聆伽铂沈口岛 m e l o