（运动人体科学专业论文）耐力训练及补硒对大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响实验.pdf

华南师范人学体育科学学院2 0 0 4 屈硕二l 毕业论义 黄颖峰 。p 文捅要： 如何减少运动损伤、消除运动性疲劳己成为运动医学研究中的主要问题之 一。就骨骼肌而言，运动训练对骨骼肌的结构和功能有明显、直接影响，一方面 随着运动训练的增加，骨骼肌的结构增强、功能提高，但另一方面，也可导致其 结构损伤破坏、机能下降或障碍，特别是在急性或或慢性过度训练的情况下。现 代病理学研究证明，大强度的运动训练极易导致细胞损伤甚至死亡，从而引起组 织器官的损伤。传统观点认为，这种损伤是细胞坏死的结果。但是，近r 余年来 生物学和医学的研究表明，细胞的死亡实际上存在两种截然不同的形式：坏死和 凋亡。一般来说，坏死是病理性死亡，涉及到大片组织细胞死亡，通常导致炎反 应；而细胞凋亡则被认为是生理性死亡，表现为散在的单个细胞死亡，而且般 不产生炎症反应。 本实验的目的是观察不同训练时间、一次运动和不同恢复时间对骨骼肌细胞 凋亡的影响，并探讨补硒的情况下运动肌肉细胞的凋亡情况，并为进步开展细 胞凋亡：在运动过程中和运动后的发生状况的研究而提供实验数据。 三月龄s d 雄性大鼠1 5 6 只，将大鼠适应性喂养一周后，随机分为三大组： ( 1 ) 安静对照组、( 2 ) 训练组、( 3 ) 训练补硒组，并根据训练时间及宰杀时问与 最后一次运动的关系共分为2 6 个小组：训练l 、2 、3 、4 各周的运动后即刻组、 3 小时恢复组、2 4 小时恢复组。按坡度为0 ，速度2 5 米m i n ；每次连续运动共 3 3 分钟，其中准备活动3 分钟，速度由慢到快，正式训练时间3 0 分钟，按预定 强度跑。整个训练期间，负荷恒定，测试负荷与平时训练安排完全相同。分别按 运动后即刻组、3 小时恢复组、2 4 小时恢复组，断头取股四头肌分成两份，一份 做组织学之苏木一伊红( h e ) 染色在光学显微镜下观察；另一份用流式细胞仪测 试凋亡率。 结果发现，显微镜下观察到运动组细胞核染色质浓缩、靠近核膜、核膜增厚 等典型细胞凋亡的形态结构改变的现象，出现细胞核染色质浓缩、靠近核膜、核 膜增厚等现象第一周开始明显，但第二周开始变得不明显，第四周最不明显。运 动后即刻第一周和第二周骨骼肌细胞凋亡率与对照组相比较均没有显著性差异， 但第三周，凋亡率明显小于对照组( p ( o 0 5 ) ，显示大鼠对运动的适应，第四周 骨骼肌细胞凋亡率略有回升，但仍低于对照组。运动后3 h 恢复时，骨骼肌细胞 毕i 甜师范大学体育科学学院2 0 0 4 屈硕士毕业论文 黄颖峰 凋亡率与对照组无显著性差异。运动后2 4 h 小时恢复时，骨骼肌细胞凋亡率第 、 二周明显高于对照组( 口 g s s g + 2 1 - 1 2 0 2 g s h + r 0 0 h _ g s “一9 x _ 一 g s s g + r o h + h 2 0 在g s h p x 的催化作用过程中，其分子中硒半胱氨酸( e c y s s e 一) 起到了重 要作用。即 e c y s s d + h + + r 0 0 h k 1 一 e c y s s e o h + r o h e - c y s - s e o h + r o h + g s h _ j l e - c y s s e s g + h 2 0 e - c y s s e s g + g s h 一“l e c y s s e 一+ g s s g + h + 在有充足硒的情况下，只要g s h p x 清除脂质氢过氧化物的能力不受到影响， 脂质氢过氧化物对机体的损伤就可以得到减轻，避免细胞膜和生物大分子物质受 2 0 华南师范人学体爵科学学院2 0 0 4 届硕上牛业论文黄颖些 到损害，保护机体的正常生理功能。陈亚军等人认为，硒缺乏会因为自由基的过 度堆积导致人体运动能力的下降。 1 、4 、2 硒参与内分泌代谢 硒是i 型、i i 型和i i i 型甲状腺原氨酸脱碘酶( i d ) 的组成成份，参与甲状 腺激素的代谢。硒参与雄性激素的代谢，在伊木清等人建立低硒实验动物模型的 研究中指出：硒缺乏时睾丸问质细胞的抗氧化能力受损，引起合成分泌睾酮能力 下降。硒还参与胰岛素的代谢，硒缺乏时，胰岛素对脂肪细胞内葡萄糖氧化的促 进作用降低。硒具有胰岛素样作用，与胰岛素义具有协同作用。 1 、4 、3 硒参与免疫反应 许多学者认为巨噬细胞的杀菌活性与含硒的g s h p x 有关。补硒可以使人的 巨噬细胞吞噬活性增加，杀菌能力增强。硒与细胞免疫有关，h a w k e s 等人的研 究报告指出适量补硒可以增加t 、b 细胞活性，使t 、b 细胞增殖。硒还能促进 特异性体液免疫功能，增加体内抗体水平已为大量实验所证实。a w a d e h 等实验 指出，补硒可提高运动体内血清l g m 水平。体外试验结果表明硒主要促进l g m 的分泌。 1 、4 、4 硒缺乏对运动机体的影响 硒缺乏可导致运动机体的氧化损伤。陆肇海 5 9 】报导了有关不同硒营养和运 动和对机体抗氧化功能的影响。其表明，无论是静息或训练状态，低硒使肝脏的 g s h p x 活性只达到适量硒状态的6 1 或7 7 ，肝脏中脂质过氧化物含量分别 为适硒状态的1 0 5 或1 7 7 ，训练使肝脏中脂质过氧化物含量不断升高，在低 硒情况下，训练组比静息组几乎增加了一倍；训练时补硒显著提高肝脏g s h p x 活性，静息时提高了酶活性，训练时提高更显著。与此同时训练中补硒使脂质过 氧化物含量显著下降。适量补硒不但使g s h - p x 活性升高，还使m d a 含量水平 下降。 硒缺乏对运动机体红细胞膜流动性也有影响。红细胞在体内能根据流场的情 况和血管的粗细来改变自己的形状，红细胞变形性与红细胞的流动性和弹性有 关。吴玲等报道在缺硒的情况下急性运动导致红细胞膜流动性的降低，同时伴有 丙二醛( m d a ) 含量的增高，他们认为膜上脂质过氧化反应是膜流动性降低的 原因之一。运动员红细胞的变形性除可以通过训练得到提高之外，硒对血液流变 2 1 华南师范人学体育科学学院2 0 0 4 届颤1 ：毕业论文 黄颖峰 有显著影响，缺硒同时缺v e 使红细胞变形性下降，补硒使红细胞变形性明显提 高。 硒缺乏对运动机体激素的影响。方子龙【6 0 】等人用实验证实了b e l m e 的观点， 发现硒缺乏导致大鼠睾丸分泌睾丸激素减少，从而影响运动大鼠机体的蛋白质合 成。 硒缺乏对运动机体心肌线粒体粒体的影响。研究显示，硒缺乏大鼠的心肌线 粒体膜脂质双层表层到中心的流动性均显著下降，伴m d a 含量的升高。有人推 测膜上的脂质过氧化反应是膜流动性下降的主要原因。 硒缺乏对运动机体免疫的影响。免疫是机体的防御性反应，对不同硒营养状 态下训练对机体免疫功能的影响研究表明：低硒状态下长期训练对机体免疫功能 有损害作用。补硒训练能提高机体的免疫功能。长期训练机体的免疫功能与肝脏 的含硒量和抗脂质过氧化的潜能呈显著正相关。淋巴细胞、巨噬细胞及嗜中性粒 细胞都有硒和g s h p x ，硒缺乏时免疫组织保留硒最多，g s h - p x 活性也l b 在其 它组织高，说明g s h p x 与免疫功能有密切关系。当硒摄入不足时，g s h p x 活 性下降。硒营养充足可以增强g s h p x 活性，从而抑制过氧化物的产生和自由基 对细胞的氧化作用，保持细胞的完整性和正常功能，提高机体的免疫功能。 1 、4 、5 硒的毒副作用 许多微量元素是动物体内必不可少的营养成份，但微量元素在机体内有积累 效应。长期大剂量使用硒时，对动物具有毒副作用。但仅当硒的剂量超过其生理 需要的i o g 上时，才会发生硒中毒。然而当前就这方面的研究还没有达成共识， 但硒的剂量高于3 - - 5 m g k g 通常具有毒性。组织病理学研究表明，亚硒酸盐的注 入可导致特别是中央静脉周围肝细胞的分裂。生长抑制、贫血和趾关节僵硬是硒 过量的典型症状。当喂给毒性剂量的有机硒时，导致了肝脏局部坏死、心肌衰弱 和肾曲小管的坏死。硒毒性的分子机制还没有完全被认识，大量研究表明氧化应 激是硒中毒主要的分子机制。事实上，亚硒酸盐与谷胱甘肽反应生成自由基能够 解释亚硒酸盐的强氧化特性。动物急性硒中毒的主要攻击部位是心血管系统、胃 肠道系统和造血系统。高剂量的有机硒也有毒副作用，但与谷胱甘肽反应时硒蛋 氨酸并不产生自由基。因此，硒中毒的分子机制有待进一步研究。元素态的硒毒 性不大，但硒的氢化物和酸则极毒，硒有两种形式，即无机硒和有机硒，常见的 华南师范大学体育科学学院2 0 0 4 届颂十毕业论文 黄颖峰 无机硒主要是亚硒酸钠和硒酸钠，有机硒有硒蛋白、硒酵母、含硒氨基酸及硒多 糖等。无机硒和有机硒都能提高缺硒动物中谷胱甘肽过氧化物酶的活性，但二者 吸收利用率不同，动物对无机硒的吸收是靠肠道被动扩散，有机硒则是主动吸收。 所以有机硒的吸收率高丁无机硒，此外亚硒酸钠为有毒物质，剂量不易掌握，而 有机硒毒性低，副作用小。 综上所述，事物都有其两面，补硒也一样，补硒量过少达不到预期的生理效 果，过多则会产生毒副作用，由于运动状态下补硒这块研究领域过去几乎没有被 涉及，所以补硒量的掌握控制就成为关键。本次实验的补硒量处于一个最初的探 索阶段，所以其数据对于后来者的研究具有重要的参考价值。 2 选题依据及研究目的 骨骼肌细胞凋i ：在骨骼肌正常生长发育过程中，对肌细胞的数量起着重要的 调节作用。研究表明，在体和离体的肌肉在不同的刺激后，都出现不同程度的细 胞凋亡。运动训练可使大鼠骨骼肌细胞凋亡增加，且凋亡率随着运动强度的增大 而增大。周未艾【6 1 i 等做过不同跑步速度训练大鼠肌肉细胞凋亡的研究。不同运 动强度对骨骼肌细胞凋亡的影响是不同的，适宜的运动刺激凋亡发生的比率增加 不多，而反复大强度运动可导致凋亡比率的增加。这可能是过度训练导致骨骼肌 损伤的机制之一。研究表明生物体内外多种因素可影响细胞凋亡的发生和发 展，机体可通过凋亡清除衰老的细胞并代之以富有活力的新生细胞，而保证器官 的正常功能状态。郑师陵、王建军【6 2 等研究了大鼠游泳运动状态下骨骼肌细胞 线粒体膜电位的变化与细胞凋亡的情况。 运动医学的研究领域中，关于运动与细胞凋亡关系的文章不是很多，在训练 动物上进行细胞凋亡的研究更是不多。运动导致的骨骼肌细胞凋亡相关的实验研 究报导更少，目前国际上许多学者所做的实验研究大多限于与医学领域特别是癌 症的治疗相关的组织器官上，训练及补硒对大鼠骨骼肌细胞凋亡影响的实验研究 尚未见报导。不同速度一次性跑台训练对大鼠骨骼肌细胞凋亡影响有报导，大强 度长时间力竭性跑台训练导致的大鼠心肌细胞凋亡的研究也有报导，但是在跑台 速度恒定的情况下大强度长时间力竭性跑台训练，以及有规律的中等强度跑台训 毕南师范大学体育科学学院2 0 0 4 屑硕+ 毕业论文 黄颖蜂 练导致的大鼠骨骼肌细胞凋亡实验则未见报导，本实验是有其探索与创新意义 的。在运动营养补剂方面，特别是补抗氧化剂方面，补牛磺酸、补维生素e 以 及补抗疲劳中药方面，前人已经做过相当多的实验研究，补硒作为抗氧化剂以提 高机体的运动机能则未见报导，选择补硒，是因为纳米硒作为一种新型的抗氧化 剂，理论上对运动导致的大鼠骨骼肌细胞捌亡应该有确定的阻抑作用。本次实验 所取得的数据将对今后监测运动员的骨骼肌细胞凋亡，以及纳米硒是否可以作为 种运动补剂起到一个良好的参照作用。 本实验的研究目的及意义在于( 1 ) 考察火鼠在不同耐力训练时间睦度( 1 、 2 、3 及4 周训练) 和训练后不同恢复时问( 即刻、3 h 以及2 4 h ) 骨骼肌细胞出 现凋亡的几率和规律。( 2 ) 在补硒的情况下考察大鼠在不同耐力训练时问长度( 1 、 2 、3 、及4 周训练) 和训练后不同恢复时间( 即刻、3 h 以及2 4 h ) 骨骼肌细胞出 现凋亡的几率和规律。( 3 ) 为进步开展细胞凋亡在运动损伤和运动疲劳中作用 的研究而提供实验数据。 3 材料与方法 3 、1 实验对象与分组 三月龄s d 雄性大鼠1 5 6 只，体重3 0 0 _ + 3 4 9 左右，由中山医科大学动物实验 中心提供。将大鼠适应性喂养一周后，随机分为三大组：( 1 ) 安静对照组( 2 ) 训 练组( 3 ) 训练补硒组，并根据训练时间及宰杀时间与最后一次运动的关系共分 为2 6 个小组。( 见表1 ) 表1s d 大鼠实验分组 w k l 对照6 w k 2 对照 6w k 3 对照 6w k 4 对照 6 w k l - 2 4 h5 w k 2 2 4 h6w k 3 2 4 h 5w k 4 - 2 4 h 5 w k l - a6w k 2 - a 5w k 3 - a 5w k 4 a 6 w k i - 3 h6w k 2 - 3 h 5w k 3 3 h5 w k 4 3 h5 s e w k l - 2 4 h6s e w k 2 - 2 4 h 5s e w k 3 2 4 h 5s e w k 4 - 2 4 h 3 s e w k l - a6 s e w k 2 - a5 s e w k 4 - a4 s e w k l - 3 h6 s e w k 2 - 3 h5 s e w k 4 - 3 h3 华南师范大学体育科学学院2 u u 4 届硕士毕业论文 黄颖峰 注：w k l 表示第惆，w k 2 表示第二周，依次类推。w k - 2 4 h 表示运动前宰杀组，即运动后 2 4 小时恢复组。w k - a 表示运动后即刻宰杀组。w k - 3 h 表示运动斤三小时宰杀组，即运动 后3 小时恢复组。s e 表示补硒组，补硒量为1 0 0 p 卧天。如s e w k 2 3 h 表示补硒的第二 周周末运动后三小时宰杀取样。 3 、2 运动训练方案 大鼠在室温为2 0 3 0 。c ，相对湿度为5 0 6 0 的饲养室内分笼饲养，每笼6 只，国家标准固体混合饲料喂养，自由饮食。安静对照组大鼠不训练。训练组大 鼠适应性喂养三天后，在国产动物跑台上进行适应性跑步训练三天，休息一天后， 正式开始进行有氧耐力训练。 训练为，强度，均速跑台运动，坡度为0 ，速度2 5 米m i n 。每次运动时问为 连续运动共3 3 分钟，其中准备活动3 分钟，速度由慢到快，正式训练时间3 0 分钟，按预定强度跑( 整个训练期洲，负荷恒定，测试负荷与平时训练安排完全 相同) 。训练时间为每周6 次，周闩休息，共持续4 周。 3 、3 取材方式 每周的第7 天，给大鼠称重，并分别在对照组和训练组随机抽取规定数目的 大鼠，抽取的训练组大鼠随机分成三组。安静对照大鼠断头处死；运动前组大鼠 在前次运动后的2 4 小时断头处死；运动后即刻和3 小时组大鼠在进行一次跑台 运动后，按规定时间分批断头处死，快速取股四头肌一式两份：一份立即用福尔 马林固定，用于h e 切片制作；一份置于p b s 溶液，用于流式细胞计数。 3 、4 指标测试 3 、4 、1 细胞形态结构检测 h e 染色【6 3 】 ( i ) 取组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4 um 切片。 ( 2 ) 切片用常规二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯( i ) 5 m i n - - - ) 二甲苯 ( i i ) 5 m i n - - ) 1 0 0 乙醇2 m i n - - - ) 9 5 的乙醇l m i n - - 8 0 l 醇l m i n - - 7 5 忆醇1 m i n 蒸馏水洗2 m i n 。 ( 3 ) 苏木素染色5 m i n ，自来水冲洗。 ( 4 ) 盐酸乙醇分化3 0 s ( 提插数下) 。 华南师范火学体育科学学院2 0 0 4 埘硕十毕业论文黄颖喹 ( 5 ) 温水( 约5 0 。c ) 浸泡5 m i n 。 ( 6 ) 置伊红液2 m i n 。 ( 7 ) 常规脱水，透明，封片：9 5 的乙醇( i ) l m i n - ) 9 5 的乙醇( i i ) l m i n - - 1 0 0 乙醇( i ) 1 m i n 1 0 0 乙醇( i i ) 1 m i n 二甲苯石碳酸( 3 ：1 ) l m i n 专二甲苯 ( i ) 1 m n 专二甲苯( i i ) l m i n - 中性树脂封固。 ( 8 ) 结果判断：光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡二细胞在组 织中单个散在分布，表现为核染色质浓缩，核碎裂等。坏死组织则呈均质红染的 无结构物质，核染色消失”“。 流式细胞仪样品处理： 3 、4 、2 细胞凋亡率检测 p i 染色【6 5 】1 6 6 】 ( 1 ) 取组织块在1 0 0 目不锈钢网上研磨出细胞，用2 5 0 3 0 0 目细胞滤膜过滤。 收集细胞( 1 - 5 ) x 1 0 6 个，5 0 0 r m i n 离心5 m i n ，弃去上清液。 ( 2 ) 3 m | p b s 洗次。 ( 3 ) 离心去p b s ，加入冰预冷的7 0 的乙醇固定，4 。c 过夜。 ( 4 ) 离心弃去固定液，3 m lp b s 重悬5 m i n 。 ( 5 ) 4 0 0 目筛网过滤1 次，1 0 0 0 r r a i n 离心5 r a i n ，弃去p b s 。 ( 6 ) 用l m lp i 用氩离子激发荧光，激发光波波长为4 8 8 n m ，发射光波波长大于 6 3 0 m n ，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及p i 荧光的直方 图。 ( 7 ) 结果判断在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与j e 常细 胞相比，前散射降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在p i 荧光的 直方图上，凋亡细胞在g 1 g 0 期前出现一亚二倍体峰( s u b g 1 ) 。本次实验所用 的流式细胞仪( 型号e l i t e ) 直接提供调亡率数据。 3 、5 数据统计 实验组与对照组多组数据比较用s p s s1 1 0 统计软件包a n o v a 方差分析进 行统计处理，两组相比用s p s s1 1 。0 统计软件包独立样本t 检验统计处理。结果 用平均数标准差表示，以p 0 0 5 为差异显著，p 0 0 1 为高度显著性差异。 华南师范大学体育科学学院2 0 0 4 届顽十毕业论文黄颖峰 4 结果 4 、1 骨骼肌细胞形态结构的改变 在皿染色片中，光学显微镜下观察到运动组细胞核染色质浓缩、靠近核膜、 核膜增厚等典型细胞凋亡的形态结构改变的现象，出现细胞核染色质浓缩、靠近 核膜、核膜增厚等现象第一周开始明显，但w k 3 开始变得不明显，w k 4 最不明 显。说明一丌始时大鼠骨骼肌凋亡细胞的数量很多，经过一段时间对训练的适应 后，细胞凋亡率有所下降。由此可见恒定负荷的训练对于大鼠机体所旋加的生理 刺激来说并不恒定，因为开始第一周大鼠在还没有适应此大运动量的情况下可以 说是力竭性的，经过两周的适应，大鼠对于原来的负荷已经具备良好的承受能力， 相对而言大鼠机体所受到的生理刺激变小了。在实践中人类运动员的训练逐渐加 大运动量就是基于此原理，负荷量增加了，但是对机体的生理刺激基本保持恒定， 所以运动机能的监测和评定是运动人体科学工作者的重要任务之一。 4 、2 骨骼肌细胞凋亡 表2实验大鼠骨骼肌细胞凋亡率分析结果 p 1 与对照组p 2 实验组 组别g r o u p样本数凋亡率比较闯比较 第一周对照组63 0 3 2 + 9 2 8 第一周末运动后2 4 h 恢复组54 9 。6 8 = 0 _ + 1 2 0 3 p 0 1 5 第一周末运动后即刻组63 0 3 3 + 4 6 0 p = o 0 0 4 第一周末运动后3 h 恢复组63 0 5 0 + 8 7 5 第二周对照组62 5 ：6 5 + 5 0 4 第二周末运动后2 4 h 恢复组6 3 8 3 8 + 1 0 0 7 p = o i 0 2 第二周末运动后即刻组52 1 4 2 + 7 1 7 p = 0 0 1 0 第二周末运动后3 h 恢复组52 5 ，6 2 + 5 8 2 第三周对照组63 0 9 6 + 1 0 0 0 第三周末运动后2 4 h 恢复组52 4 7 0 + 5 7 6 第三周末运动后即刻组51 9 2 8 ： d ：0 _ + 39 4 p00 3 7 0 3 2 第三周末运动后3 h 恢复组52 9 3 8 + 5 8 3 第四周对照组6 2 4 9 0 + 1 0 0 5 第四周末运动后2 4 h 恢复组 5 2 9 8 6 + 7 1 1 第四周末运动后即刻组62 1 8 3 + 7 t 8 第四周末运动后3 h 恢复组52 3 1 0 + 1 3 3 8 产南师范大学体育科学学院2 0 0 4 屈硕上毕业论z 黄颖峰 注：p l 值表示本组与本周对照组比较有显著性差异 p 2 表示同一周实验纽问比较有显著性差异 由表2 的p 1 一栏中可以看山，第一、二周周末运动后2 4 h 恢复组与对照组相 比较，p = 0 0 1 5 、o 0 2 0 0 0 5 ，凋亡率均大于对照组，有显著性差异。第三周周术 运动后即刻宰杀组骨骼肌细胞凋亡率与对照组相比较p = o 0 3 7 0 0 5 ，有显著性差 异，但是凋亡率小于对照组。显示大鼠对运动的适应。第四周各试验组与对照组 相比较均没有显著性差异，各试验组之间相比较也没有显著性差异，显示大鼠对 运动的进一步适应。 从p 2 一栏中可以看出，第一、二周周末运动后2 4 h 恢复组骨骼肌细胞凋亡率 均大于运动后即刻宰杀组和运动后3 h 宰杀组，p = o 0 0 4 和0 0 1 0 小于或等于0 0 1 ， 有极显著性差异。第三周周末运动后2 4 h 恢复组骨骼肌细胞凋亡率恢复为 1 4 7 0 5 7 6 ，但运动后即刻宰杀组骨骼肌细胞凋亡率显著下降，p = o 0 3 2 0 0 5 ， 有显著性差异。第四周各实验组间没有显著性差异，从另一方面表明大鼠对运动 的适应。 5 讨论 如凋亡率走势表所示，在所有组别中除了对照组以外，第一周的凋亡率是最 高的，其后逐渐下降。凋亡率的下降表明了肌肉组织对运动的适应。从同一周的 情况来看，运动后2 4 h 恢复组的细胞凋亡率最高，运动后即刻组的细胞凋亡率是 最低的，也就是说凋亡不是运动后即刻发生的，它有一定的时相性，运动后2 4 h 恢复组的细胞凋亡率之所以最高是因为它处于前一天运动完的凋亡时相上升阶 段。运动后即刻组的细胞凋亡率之所以低，是因为它既由于运动使循环和代谢的 加快清除了由于上次运动造成的部分凋亡细胞，又处于本次运动造成细胞凋亡的 初始时相，本次运动所造成的凋亡还没有及时显现出来，所咀骨骼肌细胞凋亡相 对最低。 5 、1 训练后即刻骨骼肌细胞凋亡的变化 2 8 华南师范大学体育科学学院2 0 0 4 届硕上毕业论文_ 堕颖峰 图1 训练后即刻骨骼肌细胞凋亡的变化 由图1 得知，由图中可以看出，大鼠经过第一周的运动训l 练，于第一周周末 运动后即刻宰杀，运动训练后恢复时问为0 ，骨骼肌细胞凋亡率约等于对照组， 第二周丌始下降，低于对照组，第三周下降至更低，第四周略有回升，但仍低于 对照组。按上述讨论，第一周的运动训练对于正常喂养的大鼠来说运动量所带来 的生理刺激可能是超负荷的，造成大鼠骨骼肌细胞的大量凋亡，但是运动后即刻 宰杀，测出的凋亡率并没有象运动后2 4 h 恢复组那样显著高于对照组，而是与对 照组基本持平，由此可以假定是由于运动清除了凋亡的细胞：运动加快了大鼠机 体内的血液循环，加快了新陈代谢过程，加快了大鼠骨骼肌细胞重塑过程，导致 凋亡率降低。如果按s h a r o np h a n e u f 和c h r i s t i a a nl e e u w e n b u r g h 认为的“运动 导致的骨骼肌细胞凋亡是可逆的，并且可以用治疗加以恢复”的观点，可以假定 是运动恢复了某些即将凋亡细胞的生命，由于骨骼肌细胞是多核细胞，单个细胞 中其中某个细胞核出现凋亡，但是运动调整并清除了凋亡的细胞核，使得整个细 胞作为一个整体并没有死亡，并且恢复活性。第二周，大鼠在逐渐适应了此恒定 负荷的运动训练后，机体自身得到了调整，骨骼肌细胞凋亡率也进一步减小；第 三周和第四周运动的恢复作用基本上用达到一定限度，所以凋亡相对处于平衡状 态或略有反弹，不过仍低于对照组。 华南师范大学体育科学学院2 0 0 4 届硕上毕业论文 茧颖峰 周未艾【6 7 1 等进行过不同跑步速度训练大鼠肌肉细胞凋亡的初步实验研究。从 自由基堆积的角度探讨了运动造成的目+ 骼肌细胞凋：。方法是将雄性2 月龄大鼠 随机分为6 组，征经历两个月的训练后，分别按0 m r a i n ( 安静) 、1 8 m m i n 、3 0 m r a i n 、 4 2 m m i n 、5 4 m m i n 和6 6 m m i n 的速度在跑台上跑步3 m i n 即刻断头取股四头肌。 用膜脂质过氧化的最终产物丙二醛( m d a ) 作为指标，检测氧自由基的作用， 发现各运动组与细胞凋亡出现率一样有随运动强度增加而增高的趋势。认为氧自 由基在运动训练导致的骨骼肌细胞凋亡的起一定的作用。一般而言，在运动期间， 肌肉代谢增加，线粒体等位点产生的活性氧自由基物质也随之增多。氧自由基可 以使d n a 受损，改变抑制或触发细胞凋亡的蛋白表达，直接导致细胞凋亡：氧 自由基也可以攻击细胞膜结构生成脂质过氧化物，一方面这种膜损伤可以刺激细 胞外c a 2 + 进入胞内，也可导致线粒体和内质网或肌浆网或肌浆网内储存的c a 2 + 释放，胞内c a “增加激活细胞凋亡的信号传导途径。可见氧自由基在在运动导致 的肌肉细胞凋亡中起着不可忽视的作用。 5 、2 不同恢复时问对骨骼肌细胞凋亡的影响 5 、2 、1 训练后恢复3 h 对骨骼肌细胞凋亡的影响 瓣 u 熙 图2 训练后恢复3 h 对骨骼肌细胞凋亡的影响 毕南师范大学体育科学学院2 0 0 4 届硕上毕业论文 黄颠峰 由图2 中可以看出，大鼠经过一、_ 二、三、四周的运动训练，于每一蒯周末 运动后三小时宰杀，训练后恢复时问为3 小时。骨骼肌细胞- q 产率与对照组无显 著性差异，按上述假设和讨论的情况，可以认为运动对已经凋亡骨骼肌细胞的具 有清除作用或对即将凋亡的骨骼肌细胞有恢复作用，但是运动停止后三小叫内发 生的新的细胞凋亡。这两种相反的作用相互抵消，共同参与了骨骼肌的重塑过程。 这里可以再做出进一步的假定：这运动停止后三小时内发生的细胞凋亡情况与对 照组f 常状态下大鼠骨骼肌细胞普通三个小时内所发生的凋亡情形是不同的， 运动训练组大鼠本次运动后三小时内所发生的骨骼肌细胞凋亡，除了过去多天内 由于运动所造成的潜在的诱发细胞凋亡的因素外，可能还是本次三小时前的运动 所造成的细胞凋亡的延迟表现，这与人类运动后发生的延迟性肌肉酸痛的原因可 能是一致的。本实验观察到的这一现象问接支持了s a n d r 一8 】等人的观点，延迟性 肌肉酸痛虽然是运动后2 4 小时后明显表现出来，但是与延迟性肌肉酸痛相关的 机体细胞凋亡在运动后3 小时已经达到很高的水平。 那么为什么运动状态f 运动后的- c d , 时与普通无训练状态下的i 小时骨骼 肌细胞所发生的凋亡情况不一样呢? 本研究认为长期运动动员了机体的大部分 能量储备、免疫储备以及其它储备，使机体处于高度应激状态和易感状态。运动 本身清除凋亡坏死骨骼肌细胞的同时，也会使骨骼肌细胞出现大量的延迟性凋 亡，这两种相反的作用相互抵消，使得运动后3 h 恢复组外在表现出与对照组基 本平行的情况，没有显著性差异。这两种相反的作用共同参与了骨骼肌的重塑过 程，使骨骼肌增粗增大，变得更加适应需要运动的环境。 5 、2 、2 训练后恢复2 4 h 对骨骼肌细胞凋亡的影晌 牛南师范大学体育科学学院2 0 0 4 藉硕士毕业论文堕塑坚 瓣 u 熙 1 一对照1 a * - w k - b 图3 训练后恢复2 4 h 对骨骼肌细胞凋亡的影响 由图3 中骨骼肌细胞凋亡率走势可以看出，大鼠经过第一周的运动训练，休 息恢复2 4 小时，于第一周周末运动前宰杀，骨骼肌细胞凋亡率明显高于对照组， 笫二周开始下降，第三周下降至略低于对照组，第四周略高于对照组。说明第一 周的运动训练对于正常喂养的大鼠来说运动量所带来的生理刺激是超负荷的，造 成大鼠骨骼肌细胞的大量凋亡；第二周，大鼠在逐渐适应了此恒定负荷的运动训 练后，机体自身得到了调整，骨骼肌细胞凋亡率也逐渐减小；第三周和第四周基 本上与对照组持平。 在一些实验中，在体和离体的肌肉材料在经历各自不同的刺激后，表现出典 型的细胞凋亡特点。例如乳突肌过分伸展超过3 小时即可引起凋亡的肌细胞急剧 增加，f a s 表达，活性氧( 包括n o ) 含量增加1 6 9 1 。在后肢悬浮1 4 天的大鼠肌肉中细 胞凋亡增加了，提示细胞凋亡有利于消除萎缩纤维【7 0 】。 5 、3 训练各组之间骨骼肌细胞凋亡分析 华南师范大学体育科学学院2 0 0 4 届硕士毕业论文 黄颖峰 图4 训练各组之间骨髂肌细胞凋亡分析 综合前面分析，从图4 各运动组骨骼肌细胞凋亡率走势可以看出，从第一周 至第四周总体骨骼肌细胞凋亡率趋势是下降的，与郝选民预期的运动大鼠机体免 疫力走势相对应，即运动开始大鼠免疫力大幅降低，第二周第三周由于大鼠对运 动的适应而逐渐恢复；在运动后2 4 h 恢复组、运动后即刻组以及运动后3 h 恢复 组各组的骨骼肌细胞凋亡率中，运动后2 4 h 恢复组最高，运动后3 h 恢复组居中， 运动后即刻组最低。恢复时间与凋亡率成反比。说明了两个假设：一是运动可以 引起细胞凋亡，但是运动本身由于机体新陈代谢的加快而具有清除已凋亡细胞的 作用。二是运动引起的细胞凋亡不是运动时即刻发生的，而是延迟发生的。在运 动后2 4 小时内由于运动产生的骨骼肌细胞凋亡率随时问的增加而增加。如果假 设成立，就能很好解释运动对骨骼肌细胞的重塑，外在的表现是运动机体对运动 的适应，在恒定负荷量运动训练后期，有训组骨骼肌细胞凋亡率可以比无训组骨 骼肌细胞凋亡率更低。运动引起的凋亡作用与运动本身对凋亡细胞的清除作用互 相抵消。这两种相反的作用是运动过程中骨骼肌细胞重塑原因，在运动本身对凋 亡细胞的清除作用更大的情况下，骨骼肌细胞得到了有效的重塑，使骨髂肌变得 _懈崾lif 华南师范大学体育科学学院2 0 0 4 届硕上t 乎业论文竟颓峰 更粗更壮，更适应需要运动的环境。 5 、4 补硒人鼠情况 本次实验是一个长期大型实验中第一阶段的一个部分。补硒量仍处于探索阶 段，并且不同补硒剂量的后续实验仍在继续进行当中。 由于第三、四周样品数量不足，所以补硒组只列举和讨论第一、二周的情况。 5 、4 、1 补硒大鼠骨骼肌细胞凋亡数据统计 表3 补硒大鼠骨骼肌细胞凋亡数据统计 样本 p 1 与对照组p 2 实验组间 望型鱼竺竖鍪塑圭奎丝堕望 堕堑 第一周对照组 6 3 0 3 1 9 ：2 8 补硒第一周末运动后2 4 h 恢复组 补硒第一周末运动后即刻组 补硒第一周末运动后3 h 恢复组 第二周对照组 补硒第二周术运动后2 4 1 恢复组 补硒第二周术运动后即刻组 补硒第二周末运动后3 h 恢复组 3 7 7 3 + 4 5 9 3 6 0 0 + 5 ：2 6 2 8 1 8 2 6 7 2 5 6 5 + 5 0 4 3 4 。2 0 + 7 7 i 3 0 7 4 + 6 9 9 2 7 1 4 8 8 2 = 0 0 0 1 - 0 0 0 9 注：p l o 0 5 或o 0 1 值表示本组与本周对照组比较有显著性差异或极显著性差异。 p 2 o 0 5 或o 0 l 表示同一周实验组问比较有显著性差异或极显著性差异。 由表3 得知，第一周上述各试验组与对照组之间没有显著性差异 p 2 + = o 0 0 1 0 0 5 。第一周不补硒组3 0 5 + 8 7 5 ，第一周补硒组2 8 1 8 + 2 6 7 2 4 h 恢复组： g r o u ps t a t i s t i c s v a r 0 0 0 0 1nm e a ns i ds t d e r r o r d e v i a t i o nm e a n v a r 0 0 0 0 2w k l 2 4 h54 9 6 8 0 0 1 2 0 3 0 0 5 53 8 0 0 0 s e w k l 2 463 77 3 3 8 4 5 7 8 9 41 8 6 9 3 4 h p = 0 0 9 0 0 5 。第一周不补硒组4 9 6 8 _ + 1 2 0 3 ，第一周补硒组3 7 7 3 + 45 8 第二周： 运动后即刻组 g r o u ps t a t i s t i c s v a r 0 0 0 0 1nm c a ns l d s t d e r r o r d e v i a t i o nm e a n v a r 0 0 0 0 2 w k 2 胡5 2 1 4 2 0 07 1 7 0 9 13 2 0 6 9 3 s e w k 2 - 45 3 0 7 4 0 ( 6 9 9 1 2 83 1 2 6 6 0 p = 0 0 7 1 0 0 5 。第二周不补硒组2 1 4 2 _ + 7 1 7 ，第二周补硒组3 0 7 4 _ + 6 9 9 3h 恢复组： g r o u ps t a t i s t i c s v a r 0 0 0 0 1nm e a rs t d s t d e r r o r d e v i a t i o nm e a r l v a r 0 0 0 0 2w k 2 - 3 h5 2 5 6 2 0 c58 2 5 1 22 6 0 5 0 7 s e w k 2 3 h52 7 1 4 0 ( 38 8 1 4 9 33 9 4 2 1 华南师范大学体育科学学院2 0 0 4 属硕士毕、i k 论文黄颖峰 p = o 7 5 7 0 0 5 。第二周不补硒组2 5 6 2 - - + 5 8 3 ，第二周补硒组2 71 4 88 2 2 4 h 恢复组： gr o u ps t a t i s t i c s v a r 0 0 0 0 1nm e a ns l ds t d e r r o r d e v i a t i o nm e a n v a r o o 0 0 2w k 2 2 4 h83 8 3 8 3 31 0 0 6 8 0 54 1 1 0 2 e s e w k 2 2 453 4 2 0 0 07 7 1 2 6 53 4 4 9 2 c h p = 0 4 5 6 0 0 5 。第二周不补硒组3 8 3 8 + 1 0 0 7 ，第二周补硒组3 4 2 0 - + 77 1 槲 u 熙 硒组大鼠与补硒大鼠骨骼肌细胞凋 亡规律比较 图6 不补硒大鼠与补硒大鼠骨骼肌细胞凋亡率比较图 从上述数据和图6 可以看出，第一、二周不补硒组和补硒组的综合凋亡率都 没有显著性差异，但是第一周不补硒组的大鼠骨骼肌细胞凋亡率均值3 6 0 8 高于 补硒组3 3 9 7 ，说明补硒具有一定的抗氧化抗凋亡作用。尽管这种作用不是显著。 第二周则相反，不补硒组的大鼠骨骼肌细胞凋亡率均值2 9 0 9 低于补硒组3 0 6 9 ， 说明硒作为机体必不可少的微量元素，在体内积累产生了中毒。 6 结论和建议 通过本研究结果的分析和讨论，可得出下述结论： 6 、1 我们在显微镜下观察到运动组细胞核染色质浓缩、靠近核膜、核膜增厚等 典型细胞凋亡的形态结构改变的现象，出现细胞核染色质浓缩、靠近核膜、核膜 增厚等现象第一周开始明显，但第二周开始变得不明显，第四周最不明显。 6 、2 本实验采用的训练方案使骨骼肌细胞凋亡增加，规律是运动训练开始第一 华南师范大学体育科学学院2 0 0 4 俑硕十毕业论文 黄颖峰 周、第二周可以导致骨骼肌细胞出现大量凋亡。第二、第四周由于大鼠对运动 的适应，骨骼肌细胞凋亡率逐渐下降。 6 、3 本研究发现，运动后即刻第一周和筇二周骨骼肌细胞凋亡率与对照组相比 较均没有显著性差异，但第三周，凋亡率明显小于对照组( p o 0 5 ) ，显示大鼠 对运动的适应，第四周骨骼肌细胞凋亡率略有回升，但仍低于对照组。运动后 3 h 恢复时，骨骼肌细胞凋亡率与对照组无显著性差异。运动后2 4 h 小时恢复时， 骨骼肌细胞凋亡率第一、二周明显高于对照组( p o 0 5 ) ，第i 、四周骨骼肌细 胞的凋亡率与对照组相比没有明显差异。 6 、4 补硒对阻止和延迟运动造成的细胞凋亡的发生有一定的作用，但由于其自 身的副作用可能会诱导一定数量的细胞凋亡。 6 、5 在补硒的情况下，训练第一、二周时，运动后即刻、运动后起3 h 、运动后 2 4 h 运动各组与对照组骨骼肌细胞凋亡率没有显著性的差异。并_ l l 总体来说骨骼 肌细胞凋亡率第二周比第一周低。 6 、6 本研究观察到，运动训练导致的肌肉细胞凋亡有一定的时相性和矛盾性， 运动可以导致骨骼肌细胞凋亡，但是运动本身对已经凋亡骨骼肌细胞可能具有清 除作用或对即将凋亡的骨骼肌细胞有恢复作用。 给教练员和体育科学工作者的建议：运动训练可以导致人体骨骼肌细胞出现 凋亡。凋亡最容易出现于长久休息后进行恢复性训练的运动员身上，开始训练负 荷量与凋亡率成正比，所以建议运动员长时间休息后进行恢复性训练时运动量不 宣过大，应该遵循循序渐进的原则，同时做好运动员的机能评定工作。 在运动员适应目前的运动训练负荷之后，可以适当加大训练强度以提高运动 负荷，体育科学工作者最好能研究无创骨骼肌细胞凋亡率活检的方法。 7 致谢 本人能够完成本次实验和论文，靠的是直接指导本人的导师博学资深的徐 晓阳教授的直接指导，运动生理学泰斗邓树勋教授的谆谆教诲，在此特别感谢! 还感i 9 f 郝选民教授的指导，感谢在研究生期间给我打下牢固基础知识的黄玉山教 授肖国强教授、崔丽萍副教授、吴吴副教授。感谢在这个实验组中通力合作的同 华南师范大学体育科学学院2 0 0 4 届硕士毕业论文 黄颖峰 学们，特别是万志军、何卫龙、石真玉、张钢、种焕朝以及2 0 0 0 级的师哥师姐、 2 0 0 2 级的师弟师妹们的无私帮助和奉献。祝愿华南师范大学运动人体科学系取 得更大的成就1 8 硕士在读期问发表的论文简介 “内隐学习与运动技能的获得”发表在南京体院学报2 0 0 3 年篼+ 期。第 作者。 沦文摘要：内隐学习与体育运动密切相关，几乎所有的运动技能的获得以及熟练 化，都属于内隐学习的范畴目前，人们对内隐学习的概念是：日常生活中，人们通 常能对自己学习的过程和结果进行陈述，然而大量的例子显示，在某些情况下， 人们并没有意识到也无法控制他们行为的规则是什么，但却学会了那些规则，这 些类型的学习便是内隐性学习内隐性学习是当代心理学家新近提出来的一种学 习类型，是当今学习和认知心理学领域的热点谋题。对内隐学习的研究不仅有助 于对无意识认知心理过程与机制的了解，同时，对体育训练学和教育教学等诸多 实践领域也具有重要意义，本文追溯和总结了内隐学习研究的历史、现状，并对 现有的对内隐学习的认识提出自己的看法，以及支持这些看法的实验 9 参考文献 1 成军主编程序性细胞死亡与疾病北京医科大学。中国协和医科大学联 合出版社，1 9 9 7 ，北京：卜3 2 v a u x d a v i d l c e l ld e a t hi nd e v e l o p m e n t j c e l l 一，1 9 9 9 ，2 2 9 6 ( 2 ) ：2 4 5 2 5 4 3 姜泊细胞凋亡基础与l 临床 m 北京：人民军医出版社，1 9 9 9 ，： 4 4 s a l v e s e n g u y s p r o g r a m m e dc e lld e a t ha n dt h ec a s p a s e s j a p m i s 一， 1 9 9 9 ，1 0 7 ( 1 ) ：7 3 7 9 5 a g a p i t e j u l i e ， s t e l l e r h e r m a n n m e c h a n i s m sa n d c o n t r 0 1o f p r o g r a m m e d c e l ld e a t hi n i n v e r t e b r a t e s ， b e r g m a n n a n d r e a s ， 华南师沮大学体育科学学院2 0 0 4 届顾士毕业论文黄颖峰 o n c o g c n e 一，1 9 9 8 ，1 7 ( 2 5 ) ：3 2 1 5 - 3 2 2 3 6 f u s s e n e g g e r m a r t i n ，b a i l e yj a m e s e m o l e c u l a r r e g u l a t i o n o f c e l l 一c y c l ep r o g r e s s i o n a