（生理学专业论文）acsdkp对体外培养条件下小鼠骨髓间充质干细胞生长的影响.pdf

摘要 n 一乙酰一丝一天冬一赖一脯氨酸( a c s d k p ) 是一种生理性调节因子，它抑制造 血干祖细胞和其它细胞的增殖。该小分子肽能阻止细胞进入s 期，使之滞留在 g 。g 1 期。这种抑制作用是完全可逆和非毒性的。骨髓闯充质干细胞( m s c ) 被 认为是骨和骨髓内几种细胞谱系的共同前体细胞，这些谱系包括成骨细胞、软骨 细胞、脂肪细胞和造血支持基质。骨髓m s c 本身也参与了造血微环境的组成及 功能。本文的工作假说是a c s d k p 对m s c 的生长可能有调节作用。我们进行体外 细胞克隆试验和采用有关实验技术，研究了a c s d 时对小鼠骨髓m s c 生长的影 向。 本研究所获结果为我们的假说提供了支持。体外培养条件下，a c s d k p 使小 鼠骨髓m s c 集落的生成数和大小显著减小；最大效应浓度为l x l 0 _ 1 2m o l l ，无论 其浓度下降或上升，效应都减低；在浓度n l x l 0 叫om o l l 干1 1 x 1 0 “4m o l l 时，抑 制效应明显减弱或消失：量效关系曲线是双相的。四甲基偶氮唑盐法( m t t 法) 的检测结果进一步证明了a c s d k p 能剂量依赖性地抑制小鼠骨髓m s c 的生长。 a c s d k p 在同样的m s c 培养体系中作用7 2 h - 被撤除后，m s c 集落数明显恢复，随 着a c s d k p 的作用时间缩短而m s c 集落数恢复程度增加，说明a c s d k p 对m s c 生 长的抑制作用是可逆的。然而，即使作用时间缩短至1 2 h 集落数仍明显少于不加 a c s d k p 对照组，意味着该四肽因子可能对m s c 的贴壁能力有抑制作用。在血清 浓度为1 0 3 0 的培养条件下，a c s d k p 显著减少m s c 集落生成数，但血清浓 度为4 0 时没有这样的效应，这提示a c s d k p 能阻断血清所含细胞生长刺激因子 的作用，而抑 帛o m s c 集落的生成。 总之，本研究首次获得a c s d k p 在体外培养条件下抑制骨髓m s c 生长的实验 结果，并且这种抑制效应具有双相的剂量依赖性、时间依赖性以及可逆性。 a c s d k p 阻断细胞生长刺激因子的作用可能是其抑制骨髓m s c 增殖的机制之一。 该小分子肽似乎还减低m s c 的贴壁能力。这些结果为深入探讨a c s d k p 对m s c 生长的负调控作用提供了有用的研究资料。 关键词：n 一乙酰一丝一天冬一赖一脯氨酸；细胞增殖；间充质干细胞；骨髓；小鼠 t h en u n l b e ro fm s cc o l o n i e sj nt h em u r i n eb o n em a 玎o wc l l l m r e sw i t h1 0 3 0 n e o n a t cb o v i n es e r u m ，b u ta t 羹嚣蠢鼓，自珏筵咭j 篓_ 1 “鬻q 点蛋攀 爿a i 鹜8 f 是“嚣! ；g “目* k f 1 h i 癸藩墓戛! 摹妻f 毯砒；墅 诤；杖z j 孳矗舛r i 殳芝最l 津冀l 擅# n i k i q j 材稍萎与酗墓吣萎争雾i n gs t i m u l a t o r a c t i o no nm s c s i nc o n c l u s i o n ，t h i ss t u d yo b t a i n st h ef i r s te v i d e n c et h a ta c s d k pi sa b l et oi n h i b i t t h ei nv i t r og r o w t ho fb o n em a r r o wm s c s a n dt h i si n h i b i t o r ye f f e c ti sb i p h a s i ca n d d o s e d e p e n d e n t ，t i m e - d e p e n d e n t ，a n dr e v e r s i b l e a e s d k pm a ye x e ai t si n f l u e n c eo n m s c sb yi n t e r f e r i n gw i t hs t i m u l a t o r so fc e l lp r o l i f e r a t i o n i tw o u l da p p e a rt h a tt h i s l o w - m o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d ea t t e n u a t e sm s ca d h es i o n t h e r e f o r e ，0 1 1 1 d a t ap r o v i d e v a l u a b l ei n f o r m a t i o nf o rt h er e s e a r c hi n t ot h en e ga t i v er e g u l a t i o no f m s c sg r o w t h ， k e yw o r d s ：a c s d k p ；c e l lp r o l i f e r a t i o n ；m e s e n c h y m x : 骨髓基质微环境是一个复杂的调控网络，其调节信号不仅对造血干细胞及其 后代的发育起作用，而且还调节包含m s c 在内的微环境自身细胞的生物学行为 ”。有研究者报告，m s c 禽e 表达多种基质与细胞、细胞与细胞间粘附相互作用 的反受体( c o u n t e r r e c e p t o r s ) 。骨髓微环境调控网络中，调节信号的作用方式主 要分为三种，除了细胞细胞直接粘附及细胞外基质分子与细胞接触之外，可溶 性因子的作用十分重要m 6 1 。组织微环境中细胞因子主要通过旁分泌和自分泌而 发挥作用。正、负调控因子共同作用，相互协调地控制着干祖细胞增殖和分化 活动的动态平衡。在功能稳态的骨髓内，尽管有多种生长因子存在，但大多数于 细胞都处于非增殖状态，而保持其“干性”( “s t e m n e s s ”) ，内源性抑制因子参与了 这种静止状态的维持。在生理应激和病理状态下，正、负调控信号发生相应的变 化，以适应机体功能活动的需要。对干细胞负调控的研究不仅能够完善我们对调 控机理的了解，而且可能为利用干细胞治疗许多“不治之症”提供新的思路h 7 l 。 本研究进行体外细胞克隆实验结合其它细胞增殖实验技术，在多种条件下 培养小鼠骨髓m s c ，探索a c s d k p 能否抑制m s c 的生长。 68 ) 沈两遍，瑞氏一吉姆萨( w r i g h t e g i e m s a ) 染色贴壁细胞。或者，b m c 培养 至2 4 h ，吸弃上清和未贴壁的细胞，加入含a c s d k p 的3 0 n b s 新鲜培养液，继续 培养7 天，同法做染色h8 1 。置培养板于显微镜下，观察成纤维细胞祥细胞组成的 细胞聚合，计数其组成细胞数，含成纤维细胞样细胞1 0 个的细胞聚合定为一个 m s c 集落。显微测微尺测量m s c 集落的直径( 或长径和短径) ，计算集落的平均 面积。 2 6 m s c 传代培养 用前述骨髓m s c 集落培养基，种植原代骨髓细胞于1 0 0 m l 塑料培养瓶内， 每c m 2 瓶底种植b m m n c 5 3 1 0 j 个。待m s c 集落增殖到亚融合状态时，移去 卜：恐液，用p b s - - e d t a 溶液洗2 次，加入2 m lo 2 5 胰蛋白酶溶液覆盖贴壁细 胞层，于3 7 。c 培养箱中消化3 5 m i n 。显微镜下见到基质细胞变形并开始脱离培 养瓶底时，加入少量缸清中止消化，用注射器反复吸冲贴壁细胞。将冲洗下来的 细胞悬液移入离心管中，4 离心，5 0 0 9 ，2 0 m i n ，弃上清液。加d m e m 培养液， 重复离心洗涤1 次，将细胞混悬于适量d m e m 液中，细胞计数后，种于新培养 瓶中，每c m 2 瓶底种植细胞1 3 1 0 4 个。贴壁细胞层生长至亚融合时，同法继续 做细胞传代种植 4 。 2 7 细胞活力测定( m t t 法) 按前法用2 4 孔板做m s c 集落培养，至第9 天，每孔加入m t t 溶液 ( 5 m g m 1 ) 5 0 u l ，继续培养4 h ，终止培养。小心吸去孔内上悬液，每孔加入3 7 5u l 二甲基亚砜( d m s o ) ，振荡1 0 r a i n ，使结晶物充分溶解。空白对照孔除不含细 胞外，其余操作完全相同。选择检测波长4 9 0 h m ，参考波氏6 3 0 n m ，在酶标仪上 测定各孔吸光比。 2 8统计学分析 所有数据用平均值标准差( 夏4 - j ) 表示。两组问差异比较，采用耐佥验： 多组间比较，采用方差分析；显著性水平为0 0 5 。s i g m a p l o t 计算机软件作图。 1 0 3 结果 3 1m s c 集落培养体系中一次或多次加入a c s d k p 及加入卡托普利的预实验 结果 培养之初，在小鼠骨髓m s c 集落培养体系中加入a c s d k p ，分为3 个浓度 组，其体系终浓度分别为1 0 _ 1 3 、1 0 _ 1 2 和1 0 一”m o l l ，每组共3 孔。培养8 d 后， 计数m s c 集落，结果如图1 图4 所示。对照组的m s c 集落生成数为3 4 5 8 士o 8 0 个1 0 6 b m m n c ，1 0 1 3 、1 0 1 2 和1 0 _ m o i l a c s d k p 组的集落数依次为2 1 5 8 士1 3 5 、1 9 4 2 士o 9 8 和2 0 5 0 士1 5 3 个1 0 0b m m n c 。各a c s d k p 组与对照组的差 异均有显著性意义( p o 0 1 ) 。 c o n t r o l1 0 1 3 1 0 ”l f f “ a e s d k p ( m o l l ) 图1培养体系中一次加入a c s d k p 的m s c 集落生成数 f i g 1 c o u n t so f m s cc o l o n i e si nm u r i n eb m cc u l t u r e s w i t has i n g l et i m eo fa d d i t i o no f a c s d k p + + p 0 0 1 ，c o m p a r e d w i t hc o n t r o l g r o u p d a t aa r e f r o m t h r e ea s s a y s 加 己 o uz苫苫bi一一吕一ou u葛矗霉晕置 c o n t a c 1 3a c 一1 2a c 1 1 图2培养体系中一次加入a c s d k p 后m s c 集落生成情况的典型照片 f i g 2 a r e p r e s e n t a t i v ep h o t o g r a p ho fm s c c o l o n i e si nm u r i n eb m cc u l t u r e s w i t has i n g l et i m eo f a d d i t i o no f a c s d k p c o n t d e n o t e sc o n t r o l ，a n da c 一1 3 ，a c 1 2a n da c 11d e n o t e1 0 一”，1 0 1 2a n dl o 一“m o l lo f a c s d k pc o n c e n t r a t i o n si nt h ec u l t u r e sr e s p e c t i v e l y 图3 一个小鼠骨髓m s c 集落( 1 0 0 ) f i g3 am u r i n eb o n em a r r o wm c s c o l o n yf 1 0 0 ) 2 图4小鼠骨髓m s c 集落的细胞( 4 0 0 ) f i g4 c e l l so f m u r i n eb o n em a r r o wm c sc o l o n y ( 4 0 0 ) 分组在小鼠骨髓m s c 集落培养体系中1 次、2 次和3 次添加a c s d k p ，各 组的a c s d k p 加入时间分别是：1 次添加组为培养的第2 天( 培养2 4 h ，弃上悬 液并换液时) ；2 次添加组为第2 天、第4 天；3 次添加组为第2 天、第4 天、第 6 天。每组共3 孔，每孔的培养体系容积为1m l ，每次每孔添加1 0 _ 1 0 m o l l a c s d k p l o ul ，即第1 次加入使培养体系中a c s d k p 的终浓度为1 0 _ 1 2 m o l f l 。第2 次和 第3 次添加a c s d k p 时，均不换液。培养8 天后，m s c 集落计数的结果是：对 照与1 、2 、3 次添加a c s d k p 组的m s c 集落生成数依次为2 0 0 04 - 1 6 3 、2 0 5 0 士 0 9 6 和2 1 0 04 - 1 9 1 个1 0 6 b m m n c ( 图5 ) 。各a c s d k p 添加组的m s c 集落数 明显少于对照组( 尸 o ，0 1 ) ，而2 次添加组的集落数略多于1 次添加组，3 次添 加组的集落数又略多于2 次添加组，但组间差异无统计学显著性( 驴o 0 5 ) 。 图5不同次数添加a c s d k p 的培养体系中m s c 集落生成数 f i g 5 c o u n t so f m s cc o l o n i e si nm u r i n eb m cc u l t u r e s w i t h1 2o r3t i m e so fa d d i f i o no f a c s d k p + + p 0 0 5 ) 。 表1 加入a c s d k p 或，和卡托普利的小鼠b m c 培养体系中m s c 集落的生成数仅s ) 对照组 2 5 6 7 士5 8 62 1 6 7 士1 5 3 1 6 3 3 士2 0 81 1 6 7 士7 5 7 实验组 2 4 0 0 士6 5 6 2 2 3 3 士1 5 31 6 3 3 士1 15 1 1 3 3 硅1 5 3 f 卡托普利l u g l ) 1 4 3 5 3 0 c o n t r o l1 0 1 41o 】3l0 1 2 a c s d k p ( t o o l l ) 图6 加入a c s d k p 或和卡托普利的小鼠b m c 培养体系中m s c 集落的生成数 f i g 6 c o u n t so fm s cc o l o n i e si nm u r i n eb m cc u l t u r e sw i t ht h ea d d i t i o no f a c s d k po r a n dc a p t o p r i lr e s u l t sa r ef r o mt h r e es e p a r a t ee x p e r i m e n t s 3 2 不同浓度a c s d k p 培养条件下m s c 生长的抑制 根据以上预实验结果，按培养体系中a c s d k p 为1 0 叫4 m o l l 1 0 叫o m o l l 的浓度范围，在体系中一次加入这种短肽因子，并加测m s c 集落的平均面积和 组成细胞数，进一步探究该因子对小鼠骨髓m s c 增殖的影响。结果如表2 和图 7 - 1 0 所示，各a c s d k p 加入组m s c 集落的生成数、面积和细胞组成数均少于 对照组，其中在1 0 1 2 m o l l 浓度组，这三个测定指标减低最为明显( 尸 o 0 1 ) 。 巧 孙 侣 加 o o ouooo u 邕j o b o 鲁善 表2 不同浓度a c s d k p 培养条件下m s c 集落的数目、面积和组成细胞数 与对照组比，p 0 叭；$ 与对照组比，p o0 5 t 0 o 1 31o - 1 2 1 0 l o 1 0 a c s d k p ( m o l l ) 图7 不同浓度a c s d k p 培养条件下m s c 集落的生成数 f i g7 c o u n t so fm s cc o l o n i e si nm u r i n em s cc u l t u r e s ， w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fa c s d k p + + p 0 0 1a n d + p 0 0 5 ，c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 d a t aw e r ef r o mf o u rs e p a r a t ee x p e r i m e n t s 6 娟 柏 拍 如 坫 加 幅 佃 0 6z苫苫bi)sqgoo u苫矗d基；口 c o n t r o lt f f l 1 0 ”1 口1 2 1 f f l l1 0 o a c s d k p ( t o o l l ) 图8 不同浓度a c s d k p 培养条件下m s c 集落的平均面积 f i g 8 m e a r la r e a so f m s cc o l o n i e si nm u r i n eb m cc u l t u r e s w i t hd i f f e r e mc o n c e n t r a t i o n so f a c s d k p 4 + p o 0 1a n d + p o 0 5 ，c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 d a t aw e r ef r o mf o u rs e p a r a t e e x p e r i m e n t s 1 0 0 o c o n l r o l 1 口”1 。_ 1 3 l f f 2t o 。”1 0 。” a c d k p ( m o l l ) 图9 不同浓度a c s d k p 培养条件下m s c 集落的平均细胞数， f i g 9 m e a nn u m b e r so f c e l l so f m s cc o l o n i e si nb m cc u l t u r e s w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f a c s d k p ”p o ，叭a n d + p 0 0 5 ，c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 d a t aw e r e f r o mf o u rs e p a r a t e e x p e r i m e n t s 1 7 8 6 4 2 o m 6 4 一奢。葛u赢基唇一盘舌一。u u=j0廿nis liooujog暑【l=oo 图1 0 不同浓度a c s d k p 培养条件下m s c 集落生成情况的典型照片 f i g 10 a r e p r e s e n t a t i v ep h o t o g r a p ho fm s c c o l o n i e si nm u r i n eb m c c u l t u r e sw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f a e s d k p c o n t d e n o t e sc o n t r o l ，a n d a c - 1 4 ，a c - 1 3 ，a c 1 2 ，a c 1 1a n d a c 1 0 ，d e n o t e l 0 一“1 0 1 3 1 0 1 2 ，1 0 一“，a n d1 0 1 0m o l lo f a c s d k pc o n c e n t r a t i o n si nt h ec u l t u r e sr e s p e c t i v e l y 3 3 添加a e s d k p 的m s c 集落培养体系中活力细胞数减少 依所前述，做培养体系中a c s d k p 浓度为1 0 - 1 4 m o l l 1 0 _ 1 。m o l l 的m s c 集 落培养，8 天后，用m t t 法测定反映其中活力细胞数的吸光值。结果如表3 和图1 l 所见，各a c s d k p 浓度组的4 9 0 n m 与6 3 0 n m 波长的吸光值差均低于对照组( p 0 0 1 ) 。 表3 不同浓度a c s d k p 下m s c 集落培养体系的m t t 读数 a c s d k p 吸光值 两波长吸 ( m o l l ) 4 9 0 n m 波长 6 3 0 n t o 波长 光值之差 0 ( 对照) 1 0 一1 4 1 0 一【3 1 0 1 2 1 0 1 1 1 0 l o 0 1 9 5 0 0 4 7 0 1 3 3 0 0 0 8 0 1 2 9 0 0 6 6 + 0 1 0 9 0 0 1 0 “ o 1 1 9 0 0 1 r o 1 2 5 o0 1 9 0 1 0 2 o 0 】0 0 0 6 6 0 0 1 3 0 0 6 2 0 0 1 0 + 0 0 5 7 0 0 7 l ” 0 0 5 9 0 0 0 7 + 0 0 6 5 0 0 1 1 0 0 9 7 0 0 0 4 0 0 7 4 0 0 0 4 0 0 6 4 0 0 0 3 。 0 0 5 2 0 0 0 4 ” 0 0 6 0 0 0 4 7 + 0 0 7 2 0 0 4 4 毕与对照组比，尸 o0 1 ；丰与对照组比，_ 尸 o 0 5 c o n t r o i1 0 “10 1 31 0 1 21 0 。”1 0 + o a e s d k p ( m o l l ) 图1 1a c s d k p 对m s c 集落培养体系中活力细胞数的影响 f i g 1 1 e f f e c t o f a c s d k p o i l t h e n u m b e ro f v i a b l ec e l l s i nm u r i n em s cc u l t u r e s + + 尸 o 0 1 c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 d a d aa r ef r o mt h r e ee x p e r i m e n t s 1 9 住 竹 甜 苗3hb窆jo嚣uipg配 3 4 a c s d k p 对m s c 生长抑制作用的可逆性。 b m c * 十植之初在培养体系中) j h a c s d k p ，其终浓度为1 0 叫2 m o l l ，7 2 h 后吸 去卜悬液，用d m e m 轻轻涮洗一次培养孔，换入不含a c s d k p 的3 0 n b s 的 d m e m ，此为换液撤除a c s d k p 组。发3 个对照组，( 1 ) 换液添j h a c s d k p 全程作 用组，即培养7 2 h 后换入仍含a c s d k p 的培养基，其在体系中的浓度仍为1 0 一1 2 m o l l ；( 2 ) 换液的全程不加a c s d k p 组，种植之初，培养体系中不加a c s d k p ， 7 2 h 后换液，仍不加a c s d k p ；( 3 ) 不换液的不j j i i a c s d k p 缀。各组均培养共8 天， 计数m s c 集落，结果见图1 2 和图1 3 。换波撤除a c s d k p 组、换液添加a c s d k p 全 程作用组、换液的全程不加a c s d k p 组和不换液的不加a c s d k p 组的m s c 集落生 成数依次为：1 4 0 04 - 3 6 1 、0 3 3 4 - 0 3 3 、1 9 6 7 士2 8 5 t r 2 2 o o 土2 0 8 + 1 0 6b m m n c 。 换液撤除a c s d k p 组的集落数均明显少于各对照组( p o 0 1 ) 。 a b c d 图1 2 小鼠b m c 培养体系中撤除a c s d k p 后m s c 生长的恢复 f i g 1 2 r e s t o r eo f g r o w t hm s ci nm u r i n eb m c c u l t u r e sa f t e r i t hd r a w a lo f a c s d k p + + p 0 0 1 ，c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 d a d af i r ef r o mt h r e ee x p e r i m e n t s a ：不换液的不加a c s d k p 组：b ：换液的全程不加a c s d k p 组： c ：换液撤除a c s d k p 组； d ：换液添加a c s d i ( p 全程作用组 筋 加 侣 如 5 o 6苔矗苫0一一一旨ioo u苫矗。吕jc 图1 3小鼠b m c 培养体系中撤除a c s d k p 后m s c 生长恢复的典型照片 f i g 1 3 a r e p r e s e n t a t i v ep h o t o g r a p hf o rr e s t o r eo f m s cg r o w t hi nm u r i n e b m cc u l t u r e sa f t e rw i t h d r a w a lo f a c s d k p a ：不换液的不自h a c s d k p 组 c ：换液撤除a c s d k p 组； b ：换液的全程不) j h a c s d k p 组； d ：换液添自h a c s d k p 全程作用组 3 5a c s d k p 对m s c 生长抑制作用的血清浓度依赖性 配n b s 浓度为1 0 、2 0 、3 0 和4 0 的小鼠骨髓m s c 集落培养体系，每一 浓度点包含两个组，其中一组添力w a c s d k p ，终浓度为1 0 - 1 2m o l l ；另一组不加 a c s d k p 。按前述培养后，计数m s c 集落，并按下式计算4 孓n b s 浓度点a c s d k p 对m s c 集落生成的抑制率： 抑制率( ) = ( 不女h a c s d k p 组集落数- - a c s d k p 添加组集落数) 不) 3 a c s d k p 组集落数x1 0 0 结果如表4 和图1 4 所示。随血清浓度增高，各组的集落生成数均增多。在n b s 为 1 0 、2 0 、3 0 的条件下，a c s d k p 添加组的集落数明显少于不加组( p 0 0 5 ) 。a c s d k p 对m s c 集落生成的抑制率随n b s 浓度升高而降低( 图1 4 的插图) 。 表4 不同血清浓度培养条件卜a c s d k p 对m s c 生长的影响 1 0 2 0 3 0 4 0 1 0 3 3 1 2 0 1 6 0 0 1 1 5 2 1 0 0 2 0 8 2 8 o o 1 5 3 5 3 3 0 3 3 9 6 7 2 6 0 1 3 6 7 1 3 3 2 7 ，3 3 3 4 8 4 6 8 0 3 8 l 3 3 3 9 6 7 3 2 6 4 0 3 6 1 4 0 4 6 8 6 一_ _ _ 一 口 l | *” o f n b s m ) c o n t r 0 1 匿露鄹a c s d k p | 0 1 0 2 0 3 0 4 05 0 c o n c e n t r a t i o no fn b s ( ) 图1 4 不同血清浓度培养条件下a c s d k p 对m s c 生长的影响 f i g1 4e f f e c t so f a c s d k p o ng r o w t ho f m s ci nm u r i n eb m cc u i t u r e s w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fs e n l i n + 8p o 0 l a n d + j p 0 0 5 ，c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 d a t aw e r ef r o mt h r e ee x p e r i m e n t s j 皇 o m #一h。兰z5 加 o ( o 7d乏至o【言。一iiooq u 窆铀o ja口暑jii 3 6a c s d k p 对m s c 生长抑制作用的时间依赖性 用2 4 孔板做m s c 集落培养，分为8 组，每组3 孔。其中4 个组的培养体 系中含a c s d k p ，浓度为1 0 1 2 m o l l ，分别于培养1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 和7 2 h 后进行 全量换液，换为不含a c s d k p 的培养基。其余4 个组为不含a c s d k p 组，亦于 相同时问同法换液。各组均培养共8 天，作m s c 集落计数，结果见表5 和图1 5 。 与相应对照组比，各a c s d k p 一定时间作用组的m s c 集落生成数均显著减少( p 00 1 ) 。 表5a c s d k p 作用持续不同时间后培养条件下m s c 集落的生成数( 个1 0 6b m m n c ) 分组 培养开始至换液或换液撤除a c s d k p 的时间 1 2h2 4h 4 8h7 2h d u r a t i o no f a c s d k p t r e a t m e n t ( h ) c o n t r o i a c s d k p 图1 5 a c s d k p 作用持续1 2 h ，2 4 h ，4 8h 或7 2h 后m s c 的生成数 f i g 1 5 c o u n t so f m s cc o l o n i e si nm u r i n eb m cc u l t u r e sa f t e r 1 2 h ，2 4 h ，4 8h o r7 2 h o f a c s d k p t r e a t m e n t + + 尸0 0 1a n d + p 0 0 5 ，c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 d a t aw e r ef r o mt h r e ee x p e r i m e n t s u蚤z毫b_【奄uiuoio口u苫jo担clgfl岛 3 7a c s d k p 对传代培养的m s c 生长抑制作用 在a c s d k p 为1 01 4 m o l l 1 0 1 0 m o l l 的培养下，用传至第三代的m s c 做 集落形成实验，m s c 集落生成数的结果与前述相同，传代培养的m s c 及其集落 如图1 6 - 1 7 所示。 图1 6 传代培养的间充质干细胞集落( 1 0 0 ) f i g 1 6 a s u b c u l t u r e dm c sc o l o f i y ( 1 0 0 ) 图1 7 传代培养的间充质于细胞( 4 0 0 ) f i g 1 7c e l l so f s u b c u l t u r e dm c sc o l o n y ( 4 0 0 ) 2 4 4 讨论 以本文的研究背景和工作假说为基础，我们采用体外细胞克隆( 集落生成) 试验，探索a c s d k p 对小鼠骨髓m s c 生长的影响。之所以选择骨髓m s c 作为被试 对象，主要由于a c s d k p 对骨髓造血干祖细胞的生长具有显著的抑制作用，而骨 髓基质及其前体细胞( m s c ) 与造瓤干，祖细胞在结构和机能上有着密切关系。 除此之外，还因为m s c 易于获取和培养，并且在体外培养条件下表现出高度增 殖能力【5 。在仅补充了适宜血清( 一般为经实验筛选批号的胎牛血清) 的培养 液中，m s c 就能贴附在塑料培养器皿壁上生长。如低密度转植骨髓绌胞，培养 一定时间后，在塑料器皿底形成一个个清晰可分的集落，每一个集落来源于一个 前体细胞，也就是m s c 。体外培养研究证明，骨髓m s c 具有强大的扩增能力， 在相应诱导因素的作用下它们可向骨、软骨、脂肪及造血基质等细胞谱系分化 i 划。将m s c 集落细胞移植到宿主动物的肾囊下或其它部位，它们能形成异位小骨， 其中的骨细胞、造血支持基质细胞和脂肪细胞是供体来源的。将异位小骨的供体 源骨髓细胞串连移植给次级受体动物，它们能连续再生成新的异位小骨罔。这 些研究结果证明了m s c 的干细胞性质0 5 3 1 。目前，在塑料器皿内培养骨髓细胞获 得贴壁生成的集落是分离和检测m s c 的主要方法1 5 。 本研究的预实验中，种植小鼠骨髓细胞之始在培养体系加入a c s d k p 一次， 不更换培养液培养8 天。我们发现a c s d k p 能显著抑制m s c 集落的形成，而且， a c s d k p 在培养体系中的起始浓度为1 0 _ 1 2 m o l l 时，其对m s c 生长的抑制作用 既比1 0 1 3m o l l 浓度组强，也比l o _ 1 1m o 忱浓度组强。为了进一步证实这一发 现，需要排除一些可能的干扰因素，严格设定培养条件，使实验结果更有说服力。 首先考虑一个因素是a c s d k p 在培养体系中的浓度。j a c k s o n 等口。峙艮告，在长期 骨髓培养体系中，a c s d k p 对造血于，祖细胞的抗增殖活性如何，其浓度是至关 紧要的。 有研究结果显示，该体系的内源性a c s d k p 主要来源于巨噬细胞，也能由内 皮细胞分泌，而主要由其它基质细胞降解腿5 翻。骨髓基质细胞含有血管紧张素i 转换酶( a c e ) ，a c s d k p 是该二肽酰羧肽酶n 端结构域活性位点的生理底物。 由于血清中含有a c e ，故含血清的培养基亦有该酶| _ 1 6 j 。因此，在研究a c s d k p 调控活性的体夕 细胞培养实验中，研究者们往往每天将a c s d k p 加入培养体系， 或加入a c e 抑制剂，以维持a c s d k p 在体系中的浓度。 我们对上述m s c 集落培养方法作了适当的改变，即先培养小鼠骨髓细胞2 4 h ， 此时吸去t 清及未贴壁的细胞，换入新鲜培养基。与此同时，加入a c s d k p ，以 后每隔l 天再添加1 次，共加1 3 次：或加入a c s d k p1 次，同时加a c e 抑制 剂卡托普利。结果显示，a c s d k p 加入次数增多以及 托普利对m s c 集落 生成数没有明显影响，多次添加a c s d k p 还使m s c 集落数略有减少。对这些结 果尚不能作出令人满意的解释。但推测的可能原因有：培养所用n b s 的a c e 含 量较低，并且经过了5 6 的热灭活处理，所含a c e 可能有一定程度的变性失活： 同时，培养体系中细胞数较少，而且巨噬细胞产生a c s d k p 的速率与其降解速 率相当，使得该四肽因子在培养体系中基本上维持稳定的水平。甚至多次添加 a c s d k p 可能使其在体系中浓度有所增加，从而出现其对m s c 生长的抑制效应 略有减弱的现象。 根据预实验结果，本工作确定在小鼠骨髓细胞种植2 4 h 吸去上悬液的培养体 系中加入a c s d k p 次，并扩大其加入剂量范围，以m s c 集落数、集落的平均 面积和组成细胞数为指标，测定该小分子肽的抗增殖活性。集落数是增殖调控因 子活性测定的灵敏指标，而集落面积和细胞数可更全面地反映集落形成细胞的生 长状况。所获实验数据表明，在加入一定剂量a c s d k p 的培养体系中，小鼠骨 髓m s c 的生长受到显著抑制。至今，尚未见到a c s d k p 调控m s c 生物学行为 的报道。虽然l e n 胁t 等删曾报告a c s d k p 对骨髓基质细胞系( m s 1 t ) 的增 殖有抑制作用，但该细胞系细胞并不是m s c 。h o n g 等【3 9 1 的研究结果提示， a c s d k p 可能对骨髓基质细胞有作用，而影响种植在这些细胞体外培养贴壁层上 的造血祖细胞的增殖。这一四肽因子对基质细胞层内可能存在的m s c 有某种影 响，不过这只是我们的推测而已。因此，本文是首次提供a 。s d k p 抑制m s c 生 长的实验证据。 a c s d k p 对骨髓m s c 增殖的抑制作用表现出特征明显的剂量依赖性，在 a c s d k p 浓度为l o 叫4 m o l 几1 0 叫om 0 1 几的范围内，剂量效应关系描绘为先下 降后上升的双相曲线。在l o - 1 2m o l l 的a c s d k p 浓度组，m s c 生长星现最大的 抑制效应，不论a c s d k p 的加入剂量减少和增多，其对m s c 生长的抑制作用均 减弱。至l o 矗1 4 m o l l 浓度组和l o - 1 0 m o l 几浓度组，这种抑制效应显著减弱。这 m s c 能产生e c m ，如纤连蛋白、层连蛋白及i 、i i i 、i v 、v 、v i 型胶原等： 【旦表达c a m ，包括多种整合素及其亚单位、l 一选择素和其它c a m s 。m s c 集落 培养体系中的其它细胞也能产生e c m 和c a m 。无疑，这些分子的分泌和表达 是m s c 贴壁生长的必要条件 7 ”。有作者报道，对内皮素1 诱导下心肌成纤维细 胞的胶原合成，a c s d k p 具有明显的抑制作用 3 6 】。从本工作获得的a c s d k p 抑 制m s c 生长具有时间依赖性的结果来看，该四肽因子对m s c 贴壁可能有一定 的抑制作用。这一推论是基于以下分析：种植小鼠骨髓细胞进行m s c 集落培养 之初，即在培养体系中加入了a c s d k p ，于培养1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 和7 2 h 后通过全 量换培养液撤除a c s d k p ，结果表明，a c s d k p 抑制m s c 生长具有作用持续时 间依赖性。然而，即使a c s d k p 的作用时间短至1 2 h ，撤除m s c 后集落生成数 仍明显少于对照组，提示该小分子肽可能抑制了m s c 的贴壁，培养1 2 h 后有较 多的m s c 未能贴壁或贴壁较松，随着换培养液而被吸去，成为m s c 集落数明 显减少的一个不可忽视的原因。当然，这一分析还缺乏有说服力的实验证据，至 于a c s d k p 影响m s c 贴壁的机制，是否因为抑制了胶原等e c m 分子及c a m 的合成，或者对抗了血清中促贴壁因子的作用，都有待迸一步的研究证实。 本文的研究结果还表明，对传代培养的m s c ，a c s d k p 也有明显的增殖抑制 作用。目前，本实验室在继续小鼠及人骨髓m s c 和原代和传代培养，继续深入 研究a c s d k p 对这类干细胞的调控作用。 小结 a c s d k p 在体外培养条件下抑制小鼠骨髓m s c 的生长，这种抑制效应具有 双相的剂量依赖性，最大效应浓度为1 0 一1 2 m o i l ，浓度增高或降低，抑制作用减 弱甚至消失。a c s d k p 对小鼠骨髓m s c 生长的抑制作用具有时间依赖性，随着 其作用时间延长，抑制效应更显著：其抑制作用是可逆的，撤除其作用后m s c 的增殖恢复明显。阻断细胞生长刺激因子的作用可能是a c s d k p 抑制骨髓m s c 增殖的机制之一，该小分子肽可能还减低m s c 的贴壁能力。 15 l e n f a n tm ，g r l l l ( o nc ，r i e g e rk j ，e ta 1 f o r m a t i o n o f a c e t y l s e r - a s p l y s p r o ，an e wr e g u l a t o r o f 【h eh e m a t o p o i e t i cs y s t e m ，t h r o u g he n z y m a t i cp r o c e s s i n go f t h y m o s i n b e t a4 - a n nnya c a d s c i ，1 9 9 1 ；6 2 8 ：1 15-1251 6 r o u s s e a ua c h a u v e t m t ，e ta 1 t h eh e m o r e g u l a t