（农药学专业论文）苍耳素Ⅱ有效抑菌成分的分离纯化及其剂型加工.pdf

甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 苍耳素i i 是从植物苍耳中提取分离出的抑菌活性物质，对番茄灰霉病菌( b o t r y t i s c i n e r e ap e r s ) 、辣椒丝核病菌( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 、黄瓜枯萎病菌( f u s a r i u mo x y s p o r i u m s c h l ) 、黄瓜黑星病菌( c l a d o s p o r i u mc u c u m e r i n u me 1 1 e ta r t h u r ) 和番茄早疫病菌等 蔬菜常见病害有较强的抑制作用【l 】。本文通过对苍耳素i i 中的抑菌成分进一步分离纯 化及鉴定，获得苍耳素i i 活性物质的化学结构式，通过对制剂助剂的筛选研究，确定 了制剂配方中最佳助剂及乳油、水乳剂剂型配方，加工成了2 0 苍耳素i i 乳油( e c ) 及l o 苍耳素i i 水乳剂( e w ) ，并进行了质量检测和室内药效评价。研究内容及所 得结果如下： 1 以氯仿丙酮( 体积比3 0 ：2 ) 混合溶剂为淋洗液采用柱层析法对苍耳素1 1 分 离物进一步分离纯化，经柱层析分离后抑菌成分主要集中在流分2 到流分5 中，其抑 制率大于3 0 。以流分3 对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制率最高为9 6 7 9 ：对黄瓜 黑星病菌菌丝生长的抑制率最高为8 4 8 0 。流分3 经过二次柱层析得到3 2 个流分， 而活性也主要集中在2 - - 6 流分之间，对枯萎病菌抑制较高的是流分2 ( 抑菌率为 3 8 2 5 ) ，而对黑星病菌抑制作用最高的是流分3 ( 抑菌率为4 9 1 2 ) 。 对高活性流分采用柱层析和g c m s 联用仪鉴定，苍耳素i i 主要抑菌物质有：棕 榈酸、十八烷酸、西柏二烯丙烯酸内酯、二十烷酸、邻苯二甲酸单异辛酯、十八烯 - 9 - 酸、3 ，5 二特丁基2 羟基苯丙酸、十六烯一9 一酸、降姥鲛酮2 、5 丙氧基6 甲氧 基8 胺基喹啉、邻苯二甲酸单乙酸乙酯酯、3 苯基2 ，4 戊二酮、2 烯丙基1 ，4 二 甲氧基3 乙烯氧甲基苯、乙酸三甲基苯酚酯、邻苯二甲酸单乙酯、二十二烷酸、角 鲨烯及未知物质等4 1 种物质，可以证实苍耳提取物苍耳素i i 中存在大量的抑菌活性 物质。 2 以苍耳素i i 为原药，通过对其加工助剂及配合量的筛选研究，确定了二甲苯， 二甲基甲酰胺( d m f ) ，农乳0 2 0 3 b 为最适的溶剂、助溶剂、乳化剂，加工出了质量 稳定的2 0 苍耳素i i 乳油。质量检测结果表明该制剂符合国家标准。 3 。在苍耳素i i 加工成乳油的基础上，初步进行了苍耳素u 水乳剂的开发研究。 通过对其加工助剂及配合量的筛选研究，确定了二甲基甲酰胺( d 脏) ，n 长链烷基 吡咯烷酮，乙二醇，1 0 n a c i 溶液，农乳5 0 0 、农乳6 0 0 及b y l 4 0 按一定比例混配 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 为最适的溶剂、助溶剂、抗冻剂、乳化剂，加工出了1 0 苍耳素i i 水乳剂制剂。并对 水乳制剂的进行了质量检测，各项性能指标达到国家标准。 4 采用杀菌剂生物测定法，测定2 0 苍耳素i i 乳油和1 0 苍耳素水乳剂对黄 瓜枯萎病菌的抑菌活性。结果表明：2 0 苍耳素i i 乳油和1 0 苍耳素i i 水乳剂对黄瓜 枯萎病菌具有较强的保护作用，防治效果在4 0 左右；而治疗作用不显著。 关键词：苍耳素i i 提取液；抑菌成分分离鉴定；配方筛选；剂型加工；质量检测；药 效评价 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 鲁詈毫寡暑曼詈鼍詈毫宣詈寡鲁毫詈皇! 詈曼暑毫皇皇! 詈鲁暑寡! 詈鼍詈量寡皇! 曼鼍皇曼皇詈曼皇詈皇皇皇! 詈! 皇鼍暑鼍量! 皇詈i 一一| 皇皇! 鼍! 葛 s u m m a r y t h ec a n ge rs ui ii sf u n g i s t a t i cs u b s t a n c e s ，w h i c hi se x t r a c t e da n di s o l a t e df r o mp l a n t o f x a n t h i u ms i b i r i c u mp a t r e xw i d d t h ec a n ge rs ui ih a so b v i o u si n h i b i t i o nf o rb o t r y t i s c i n e m ap e r s ，r h i z o c t o n i as o l a n i ，f u s a r i u m o x y s p o r i u m s c h l ，c l a d o s p o r i u m c u c u m e r i n u me 1 1 e ta r t h u r 1 1 t h i sp a s s a g ea c c o r d sf o ra n t i b a c t e r i a lc o m p o n e n to ft h e c a n ge r s ui it od ot h ef u r t h e ri s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o na n da p p r a i s a l ，a c q u i r e st h e c h e m i c a ls t r u c t u r eo ft h ea c t i v i t ys u b s t a n c e sa b o u tc a n ge rs ui i t h r o u g hs t u d i e so nt h e p r e p a r a t i o no ft h em e t h o ds c r e e n i n g ，d e t e r m i n et h eb e s ts o l v e n t ，a d d i t i v e sa n dt h eb e s t m e t h o do fs c r e e n i n gf o rf o r m u l a t i o n s ，e ca n de w p r o c e s s i n gt h e2 0 c a n ge rs ul ie c a n d10 c a n ge rs ui ie w ，a n da p p l yt ot h eq u a l i t yo ft e s t i n ga n de v a l u a t i o no fi n d o o r e f f e c t t h er e s u l t so fr e s e a r c ha r ea sf o u o w s ： 1 i s o l a t e df u r t h e rp u r i f i e df o rc a n ge rs ui ib yc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ，w h i c hw a s u s i n gv o l u m ec h l o r o f o r m a c e t o n e ( v o l u m er a t i oo f3 0 ：2 ) m i x e de l u e n t a f t e rs e p a r a t i o n f u n g i s t a t i cc o m p o n e n tm a i n l yc o n c e n t r a t e d i nt h ef r a c t i o n s2t o5i nt h ee l u e n t ，i t s i n h i b i t i o nr a t ei sm o r et h a n3 0 t h ef r a c t i o n3w a st h eh i g h e s tr a t eo fg r o w t hi n h i b i t i o n f o rf u s a r i u m o x y s p o r i u m s c h l ，i tw a s9 6 7 9 ；a n di n h i b i t e dt h e g r o w t ho f c l a d o s p o r i u mc u c u m e r i n u me 1 1 e ta r t h u rf o r t h eh i g h e s ti n h i b i t i o nr a t eo f8 4 8 0 a f t e r t h ef r a c t i o n3i s o l a t e dt w i c ew i t hc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ，r e c e i v e d3 2f r a c t i o n s ，w h i l et h e m a i na c t i v i t yw a sc o n c e n t r a t e di nt h ef r a c t i o n s2t o6 ，i n h i b i t i o no ff u s a r i u mo x y s p o r i u m s c h l w a st h eh i g hf r a c t i o n2 ( i n h i b i t o r yr a t ew a s3 8 2 5 1 ，w h i l ec l a d o s p o r i u m c u c u m e r i n u me 1 1 e ta r t h u ri n h i b i t i o nw a st h eh i g h e s ti nf r a c t i o n3 ( i n h i b i t o r yr a t ew a s 4 9 1 2 ) i d e n t i f i e dt h ef r a c t i o no fh i g h a c t i v i t yo fc a n ge rs ul ib yc o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya n d g c ，m s ，i tc o n t a i n s4 1m a j o ra n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e s ：h e x a d e c a n o i ca c i d ，o c t d e c a n o i c a c i d ，g e r m a c r a - l ( 10 ) ，4 ，11 ( 13 ) 一t r i e n - 12 一o i ca c i d ，6 a l p h a 一h y d r o x y - g a m m a l a c t o n e ， e i c o s a n o i c a c i d ， m e t h y l2 - e t h y l h e x y lp h t h a l a t e ， 9 - o c t a d e c e n o i ca c i d ， 3 ，5 b i s ( 1 ，1 一d i m e t h y l e t h y l ) 一4 - h y d r o x y -b e n z e n e p r o p a n o i ca c i d ，d r o pb a s k i n g s h a r k s 2 5 - c o x y g e n 一6 m e t h o x y 一8 a m i n o - q u i n o l i n e ，p h t h a l a t e e t h y le s t e r ，3 - p h e n y l - 2 ， i i i 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 4 - g l u t a r i c - ，2 一a u y l i c 一1 ，4 - d i m e t h o x y - 3 - o x y g e n e t h y l e n eb e n z e n e ，p h e n o la c i dm e t h y l e s t e r ，s i n g l e d i e t h y lp h t h a l a t e ，d o c o s a n o i ca c i d ，s q u a l e n ea n du n k n o w ns u b s t a n c e s i tc a l l c o n f i r mt h a tc a n ge rs ui ie x t r a c t e df r o mx a n t h i u ms i b i r i c u mp a t r e xw i d dh a si nal a r g e n u m b e ro fa n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e s 2 t h eo r i g i n a lm e d i c i n e sw a sc a n ge rs ui i ，t h r o u g hi t sp r o c e s s i n ga i da n ds t u d i e do n t h em e t h o do fs c r e e n i n gt od e t e r m i n e dt h ex y l e n e ，d m f ，0 2 0 3bo fe m u l s i f i e ra st h eb e s t s o l v e n t ，c o s o l v e n t ，e m u l s i f i e r i th a dp r o c e s s e do f2 0 c a n ge r s ui ie c ，w h i c hw a ss t a b l e q u a l i t y q u a l i t yt e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r e p a r a t i o n sa c c o r d e dw i t hn a t i o n a ls t a n d a r d s 3 t h ep r o c e s s i n go nt h eb a s i so ft h ec a n ge rs ul ie c ，w et r i e dt or e s e a r c ha n d e x p l o i t m e n to nc a n ge rs ul ie w t h r o u g hs t u d i e do fi t sp r o c e s s i n ga i da n dt h em e t h o d s c r e e n i n gd e t e r m i n e dt h ed m f ，n l o n gc h a i na l k y lp y r r o l i d o n e ，e t h y l e n eg l y c o l ，1 0 n a c is o l u t i o n ，e m u l s i f i e r5 0 0 ，6 0 0a n db y l 4 0b yac e r t a i np e r c e n t a g et om i xf o ra c q u i m t h eo p t i m a lm i x t u r eo f t h es o l v e n t ，a n dc o s o l v e n t ，a n t i f r e e z ef o r m u l a t i o n s ，e m u l s i f i e r s ， p r o c e s st h ef o r m u l a t i o no f10 c a n g e rs ui ie w f o r m u l a t i o no fe wp a s s e dt h e p e r f o r m a n c ei n d i c a t o r so ft h es t a t es t a n d a r d so nq u a l i t yt e s t 4 u s e df u n g i c i d eb i o a s s a r y ，s t u d i e do ni n h i b i t i o na c t i v i t yo f f u s a r i u mo x y s p o r i u m s c h l b yt e s t e d2 0 e co f c a n g e rs ui ia n d1 0 e wo f c a n ge rs ui i t h er e s u l t ss h o w e d t h a t2 0 c a n ge rs ui ie ca n d10 c a n ge rs ul ie wo nf u s a r i u mo x y s p o r i u m s c h l 。h a d s t r o n gp r o t e c t i v ee f f e c t ，t h ee f f e c ta b o u ti n4 0 ，w h i l et r e a t m e n tw a sn o ts i g n i f i c a n t k e yw o r d s ：t h ee x t r a c t i o no fc a n ge rs ui i ，i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no ff u n g i s t a t i c c o m p o s i t i o n ，t h em e t h o do f s c r e e n i n g ，p e s t i c i d ef o r m u l a t i o np r o c e s s i n g ，q u a l i t yt e s t i n g ； e f f i c a c ye v a l u a t i o n i v 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 独创性声明 本人声明说所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得甘肃农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 殳少i 出 签字日期：厶州降月日 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 _ - j k 刖吾 植物源农药是利用植物根、茎、叶、花、果实等部分或分离到的活性成分加工成 的农药制剂，它来自于天然植物，对人畜安全，不污染环境，对天敌昆虫安全，不易 引致害虫产生抗药性，符合环境保护和农业可持续发展战略对有害生物综合治理的技 术要求。 苍耳为一年生有毒草本，抗逆性和适应性强，而且在我国，尤其在北方分布很广， 资源丰富，据估计，甘肃省在农田外的自然产量要在万吨以上，陕西约二万吨以上【7 j 。 苍耳作为中草药，在医药方面的应用研究已经比较深入，在农药应用方面也显示出广 阔的开发前景。迄今为止，张兴、姜克元、冯俊涛、李玉平等相继对其抑菌活性进行 了初步测定，发现在离体条件下苍耳提取物对部分重要农作物病原菌如：小麦赤霉病 菌( f u s a r i u mg r a m i n e a r u m ) 、辣椒疫霉病菌( p h y t o p h t h o r ac a p s i c il e o n i a n ) 、苹果炭 疽病菌( g l o m e r e l l ac i n g u l a t a ) 及玉米大斑病菌( e x s e r o h i l u mt u r c i c u m ) 等【2 一j 均有较 强的活性。 本论文的前期研究是郭东艳1 1 、杨顺义【2 1 、何静【3 1 等对苍耳提取物中抑菌成分的 初步分离与鉴定、苍耳活性成分及抑菌机理进行了研究。苍耳素i i 是采用柱层析的方 法从苍耳中分离纯化出的抑菌活性物质。本论文通过对苍耳素i i 活性物质进一步进行 分离、纯化和鉴定，获得活性成分的化学结构式，筛选适宜的助剂和配方比例，将苍 耳素i i 加工成乳油和水乳剂等剂型，并按照国家标准进行质量检验和药效评价，为新 型植物源杀菌剂开发与应用奠定理论基础。 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 植物源农药研究的目的意义 早在化学合成农药面世之前，世界上许多国家就已大量开发和应用植物性农药。 早在1 7 世纪欧洲就开始用烟草提取尼吉丁来防治蔬菜、果树害虫。在1 9 世纪末日本 就大量种植除虫菊防治作物害虫。我国利用植物农药的历史更加悠久。据周礼记 载，早在3 0 0 0 多年前就已经有用襄荷( z i n - g i b e r ) 和毒八角( i e i c i u m ) 来防除人体 和仓库害虫的历史。其它史料也有以百部防治果树蛀虫( 1 4 0 1 ) 、苦楝防治蚤虱( 1 5 7 8 ) 、 烟茎插入稻田防治螟虫( 1 8 2 1 ) 等的记载【4 】。2 0 世纪4 0 年代以来，化学合成农药占 领了农药市场，使植物性农药的研究陷入低谷。但是，由于高效、高毒、残效期长的 化学农药大量不合理使用而产生的环境污染、人畜中毒、杀伤天敌、破坏生态平衡以 及“3r ( r e s i d u e ，r e s i s t a n c e ，r e s u r g e n c e ) 等严重问题，引起了生态学领域以至全 社会的普遍关注，生态农业、持续农业、持续植保和绿色食品等概念也应用而生，并 很快被人们所接受，化学合成农药的大量生产和使用受到了严重的挑战，同时化学合 成农药带来的诸多的负面影响，尤其是化学农药对非靶标生物的杀伤及对环境质量的 降低引起了世界的广泛关注，正是在这一背景下，生物农药逐渐发展起来。生物农药 包括微生物农药( 病毒、细菌和真菌) ；昆虫病原线虫；植物源农药( 植物提取物) ； 微生物的次生代谢产物( 抗生素) ；昆虫信息素：转移到植物中可表达抗虫抗病及耐 受除草剂的基因垆j 。 随着“可持续植物保护”观点的发展和i p m 植保方针的推行，开发和应用高效、 低毒、低残留、与环境相容的新型农药已成为农药业发展的必然趋势和方向。形势迫 使人们又回过头，用新的目光重新审视植物性农药的价值，植物性农药以其低毒、低 残留、对人畜安全、对环境友好、不易产生抗药性等优点而成为农药开发的热点，不 仅可以得到大量新的农药品种，同时也可以挖掘出新的农业生产增长点，还可以优化 农业生产结构、促进农业生产产业化进程，有力地推动农业生产向无公害、有机化和 农产品的生态化方向发展，但大多数植物源农药也存在着作用缓慢，在遇到有害生物 大量发生、迅速蔓延时往往不能及时控制危害的缺点。 粮食、蔬菜和水果是人类重要的生活物资，而为了控制植物病虫害( 包括贮藏和 保鲜) 大量地使用农药，严重地影响了粮食、蔬菜和水果的质量和经济价值。化学农 2 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 药广泛使用严重危害人体健康，污染环境。为了我们自己和后代，必须研究开发低毒 高效的植物源农药，包括植物源杀菌和植物源杀虫剂【6 】。 1 2 植物源农药国内外研究进展 1 2 i 国外植物源农药研究历史与发展 国外在植物源农药方面已经取得了许多成果：日本从菠菜叶中分离出一种化合物 对烟草花叶病有很强的抑制作用【7 1 。n o u y e nv a nc h u y e n 等【8 】从k u m a z a 分离到醋酸、 丙炔酸、苯甲酸、苯乙酸、水杨酸、3 羟基苯甲酸、苯酚、邻甲氧基苯酚和4 乙基苯 酚等抗菌成分。v i n c e n t 等【9 】用硫酸小蘖碱处理大麦种子减轻了大麦网纹花叶病毒病 的危害。e b e r h a r d 等【1 0 】用小蘖碱防治马铃薯晚疫病取得成功并获得专利。b e l l l l e r 【1 1 】 从毛蒿植物中分离出的毛蒿素、从南欧丹参中分离出的硬尾醇、存在于苜蓿根部的苜 蓿酸以及海红叶中的紫檀素等均表现出很强的抗菌活性。r a t u a y a k e 1 2 】从e u p a t o r i c u m r i p a r i c u m 中分离出具有抗菌活性的色烯。n y c h a s 1 3 】综述了植物源抗菌剂实际使用的 可能性。k o u s h i ks e e t h a r a m a n 等【1 4 】从禾本科植物高粱属中分离的抗真菌蛋白质 ( a f p ) 能抑制f u s a r i u mm o n i l i f o r m e 等真菌孢子的萌发。 由于国外资金雄厚，大批资金投入植物活性成分的提取上，进入2 0 世纪后，随 着提取、分离分析技术的不断发展和一系列先进的结构鉴定手段的广泛采用，特别是 现代分子生物学技术的飞速发展，使得天然产物活性成分的研究开发成为现代医药与 农药开发的热点，并从仿生学角度去研究天然产物的新的先导结构，以作为探索新靶 标的探针，进而开发新农药。 1 2 2 国内植物源农药研究历史与发展 植物源农药由于其原材料取于天然植物，具有无代谢物、无衍生物、无残留、无 公害、不易产生抗药性等优点，被国家发展计划委员会和科技部列为2 1 世纪优先发 展产业，是世界上所公认的绿色农药，可广泛用于农作物病虫害的防治。我国是利用 植物资源防治害虫最早的国家。早在公元前若干世纪的周礼秋官中就有用芥草熏 杀蠹物的记载。后魏时代( 公元5 3 0 - 5 5 0 年) 贾思勰所著的齐民要术中记载可 用藜芦根煮水洗治羊疥。明万历2 4 年( 1 5 9 6 年) 李时珍所著的本草纲目记录了 不少可以利用杀虫的植物。如百部、苦参、川楝、巴豆等。但植物源农药商品化生产 则始于新中国成立初期，其标志性产品是除虫菊素制剂、鱼藤酮制剂及烟碱制剂。随 着现代合成杀虫剂的飞速发展，在相当长的一个时期，植物源农药的产业化研究与开 发处于停滞状态。直到2 0 世纪8 0 年代末期，由于不合理地使用化学农药而带来的农 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 药残毒、环境污染等负面影响引起了政府和公众的重视和关注，随着一些高毒化学农 药逐步退出市场，才使植物源农药的生产与应用获得了广阔的发展空间。迄今为止， 我国已有烟碱、除虫菊素、鱼藤酮、印楝素、苦皮藤素、川楝素、藜芦碱、苦参碱、 辣椒碱、木烟碱、茴蒿素、对叶百部碱、马钱子碱、异羊角拗苷、茶皂素、蛇床子素、 莨菪烷类生物碱等18 种植物源杀虫剂及苦参碱、黄芩苷及黄芩素、小蘖碱、丁香酚、 柠檬醛5 种植物源杀菌剂完成了登记或临时登记并进行过批量生产，生产厂家4 8 裂1 5 】。 尤其在直接食用的经济作物如蔬菜、果树、茶叶上使用更显其优势，不仅能生产 出放心菜、放心果、放心茶等绿色食品，而且还能改善农产品品质，提高口感，是绿 色农产品基地的理想用药。自1 9 8 5 年4 月中国专利局开始受理专利申请以来，植物 源农药技术领域申请的专利有3 0 3 件，占整个农药领域专利申请量的6 9 ，其中国 内申请2 8 8 件，占植物源农药专利总件数的9 5 ，国外申请1 5 件，仅占5 。植物 性农药专利尽管只占整个农药领域专利申请量很少的一部分，但申请量呈逐年上升的 趋势。短短十来年，申请量成倍增长，由最初每年的三、四件增至19 9 6 年的近5 0 件，其增加幅度在1 9 9 2 1 9 9 3 年间明显增长，1 9 9 3 年的申请量是1 9 9 1 年的一倍多。 另外据统计，目前已登记注册的植物源农药品种达2 6 个( 其中杀虫剂最多) ，产品 7 3 个，生产厂家有1 0 2 个。品种包括烟碱、苦参碱、鱼藤酮、茴蒿素、藜芦碱、苦 皮藤素、川楝素、毒藜碱、茶皂素、乙蒜素等【1 6 1 。可见，植物性农药已成为我国农药 的重要组成部分，对促进农业生产、保持生态环境将发挥重要作用。 1 3 植物源农药活性成分提取方法研究进展 天然产物的提取方法较多【l7 1 ，常用的溶剂提取法包括浸渍法、渗漉法、煎煮法、 蒸馏法( 加水蒸馏法、水蒸气蒸馏法) 、回流提取法、连续提取法、升华法和超临界 萃取法等。近年来又出现了破碎提取法、微波提取法、超声波提取法等新方法。提取 方法不同，提取效果也存在差异。同一种提取方法，不同溶剂的提取效果也存在差异， 一般采用系统溶剂进行活性成分的提取，包括溶剂连续提取和溶剂平行提取。前者可 以避免活性成分的漏筛，后者能确定最佳的提取溶剂。林捷【l8 】等在室温下分别用乙醇、 乙酸乙酯、丙酮、石油醚、乙醚浸提柚皮，结果表明用乙酸乙酯的提取物抑菌力最强。 王维华1 1 9 】等通过用水、9 5 乙醇和丙酮提取连翘中抗菌成分，证明9 5 乙醇的提取物 抑菌活性最强。提取过程中加入酸、碱、表面活性剂和纤维素酶等提取辅助剂，可以 提高有效成分的溶解度，增强有效成分在提取过程中的稳定性，同时又可以除去或减 少某些杂质，从而提高提取效能。n h u y e nv a nc h u y e n 2 0 】等从k u m a z a 中提取活性物 质时加入了一定量的纤维素酶，结果使提取物的抗菌活性增强。张牢牢【2 1 l 等用酸萃取 4 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 法提取苦参生物碱时，研究了温度、时间、酸浓度对萃取效能的影响。结果表明，酸 萃取温度为8 0 9 0 、萃取时间5 h 、盐酸浓度为0 5 时萃取率较高。 目前，植物粗提物成分的分离通常采用柱层析、薄层层析( t l c ) 、高效液相色 谱( h p l c ) 。但是薄层层析对天然产物提取物的分离效果较差，不宜用于粗提物的分 离，一般应在经多次柱层析后，样品所含组分较少时使用。柱层析、薄层层析常用的 吸附剂为硅胶，多选用合适的溶剂( 一般二元或多元溶剂) 并配成系列极性后，进行 梯度淋洗和展开【6 】。此外，常用的还有反相硅胶层析、凝胶层析、液滴逆流层析、大 孔树脂层析等分离方法。分离后的成分可以通过气相色谱质谱( g c m s ) 、高效液相 色谱质谱( h p l c m s ) 、气相色谱红外光谱( g c i r ) 、液相色谱紫外光谱( l c u v ) 和液相色谱一核磁共振( l c - n m r ) 等技术研究活性成分的结构及构效关系。 1 4 植物源农药制剂开发利用进展 植物源农药的开发利用可分为两方面：一是直接利用，即对植物中的活性物质进 行粗提取后，直接加工成可利用的制剂。这种利用方式的主要优点是能够发挥粗提物 中各种成分的协同作用，而且投资少，开发周期短。目前，我国在这方面做的工作较 多，已开发出楝素乳油、苦皮藤乳油、鱼藤酮乳油、双素碱水剂、油酸烟碱等多种商 品化制剂【2 2 1 。二是间接利用，即研究活性物质的结构、作用机制、结构与活性间的关 系，进而人工模拟合成筛选，从中开发新型植物源农药制剂【2 3 1 。间接利用是当前国外 植物源农药研究开发的重点，也是我国植物源农药研究发展的方向。近年来，我国植 物源农药的研究与开发虽已取得了较大进展，但是从整体上看，还存在许多问题。主 要表现在【2 4 】：( 1 ) 直接利用多，间接利用少。目前，大多植物源农药还停留在粗提物 或复配阶段，对植物中活性物质及其作用机制缺乏深入研究。( 2 ) 成本较高，作用缓 慢，田间持效期短，往往要重复用药或与其他合成农药混用才能达到预期防治目的。 ( 3 ) 药物稳定性差。一些植物源农药制剂的防治效果在生产实际应用上稳定性不高， 易受环境因素影响。( 4 ) 植物源农药品种和类型不多，其中主要是植物源杀虫剂类。 为了最大限度地发挥植物源农药的优点，开发出在实践中具有推广价值的植物源农药 制剂，我们尚需在以下几个方面开展研究工作【2 5 】：( 1 ) 植物中活性成分结构、作用机 制及构效关系的研究；( 2 ) 发现先导化合物进而人工合成；( 3 ) 植物源农药剂型加工工 艺与合理使用技术的研究。总而言之，我国植物资源丰富，发展植物源农药的条件得 天独厚，随着生物、信息、分离鉴定和仪器分析等技术的发展，我国植物源农药的研 究将不断取得新的突破。 目前，国内的植物源农药剂型开发利用的品种不多，以最新研究进展的苦皮藤加 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 工制剂只有0 2 苦皮藤素乳油，0 1 5 苦皮藤素微乳剂，0 1 苦皮藤素微粉剂或其与 其他药品的混用；以银杏中生物活性物质为制剂加工品种主要有1 0 银果乳油，2 0 银果可湿性粉剂，2 0 银果微乳剂及仿生银杏农用杀菌剂银泰，也是2 0 银泰乳油， 2 0 银泰微乳剂等少数几种剂型。而早期的有鱼藤酮、烟碱、川楝素等都为乳油、粉 剂通用剂型。截止2 0 0 4 年，共有1 5 个植物源农药单剂登记，为血根碱( 1 ) 、丁子香 酚( 1 ) 、苦参碱( 3 2 ) 、苦皮藤素( 2 ) 、楝素( 2 ) 、藜芦碱( 4 ) 、蛇床子素( 1 ) 、松碱( 1 ) 、松脂 酸钠( 6 ) 、氧化苦参碱( 2 ) 、烟碱( 5 ) 、印楝素( 3 ) 、鱼藤酮( 3 ) 、闹羊花素( 1 ) 、茴蒿素( 1 ) 等( 括号内数字为登记厂家数) 引，加工剂型以乳油、水剂为主，还有可溶性液剂、水 乳剂、微乳剂、可湿性粉剂等：防治对象为蔬菜、果树、茶叶、棉花等经济作物上的 虫螨害，及少量的病( 毒) 害。 1 5 植物源农药有效抑菌成分研究进展 目前植物源杀菌剂的研究相对于植物源杀虫剂而言要少得多。但是从植物中寻找 抑菌活性物质仍然是近几年来开发研制新型杀菌剂的热点之一。w i i l l ( i n s 【2 6 】等报道有 1 3 9 8 种植物有可能作为杀菌剂。植物中的抗毒素、类黄酮、罹病相关的蛋白质有机 酸和酚类化合物等均有杀菌或抗菌活性。到目前为止研究人员已经在植物中发现很多 种物质对某个或某些病菌有一定的抑制或杀灭作用。例如，a r u z z e l l a h e b a l t e r 对多种 香精油杀菌活性系统的测试发现，多种植物香精油能抑制真菌的生长【2 7 】。在多种植物 中普遍存在的小孽碱能有效地防治马铃薯晚疫病【2 8 】；吴恭谦发现白头翁提取物对 小麦赤霉病菌有较强的抑制作用：李重九( 3 0 】等从韭菜中分离出多种具有萘酚结构骨架 的抑菌活性化合物：刘晓波p l 】等研究了印楝素对烟草码绢金龟生物活性的影响。结果 表明，印楝素对码绢金龟的成虫具有较强的忌避作用和拒食作用。通过点滴试验还表 明，印楝素对码绢金龟幼虫处理后1 4 天的生长抑制率为5 2 - - - 5 4 。 我国目前已经登记的植物源有效成分目前有1 6 1 8 种，由此而延伸的制剂有1 0 0 余种。我国已经登记的有效成分包括：烟碱、鱼藤酮、藜芦碱、茶皂素、川楝素、印 楝素、茴蒿素、百部碱、苦皮藤素、苦参碱、松脂合剂、钱子碱、异羊角扭甙、乌头 碱、莨菪烷碱、芸苔素内酯、蓖麻、油酸、骨酯素：正在研究和登记的有效成分有： 砂地柏、蜕皮素a 、毛莨碱、螟蜕素、2 一蒎烯、蜕皮酮、香茅油、雷公滕碱! 银杏黄 酮甙、夹竹桃甙、儿醇、莰酮等【2 2 3 2 3 3 1 。 1 6 植物源农药在农业生产中的应用研究 植物病虫害生物防治成了控制病虫害的重要手段，利用植物源农药控制植物病虫 6 甘肃农业大学20 0 8 届硕士学位论文 害是一种重要的生物防治方式，自然界中可开发利用防治病虫害的植物种类较多，目 前各国科学家正在对多种抗虫植物进行筛选和研究，取得不少成果。我国也对植物资 源进行了较全面的调查研究【l 】，初步筛选出一批可供开发的抗虫植物，如卫矛科雷公 藤、苦皮藤等，防治病害的植物也很多，如苦豆子、石榴、大花金挖耳、芥菜、苍耳、 孜然、大蒜和穿心莲等。 植物源农药的应用已有相当长的历史，经过多年的研究开发，已经有一些产品用 于生产实际，取得了良好的社会经济效益，保护了生态环境，而且植物源农药活性成 分复杂，具有多靶点，多作用位点，效果明显，它的使用难以产生抗药性，延长了植 物源农药的使用寿命。 例如，孟昭礼等【3 4 】从银杏中分离出了对植物病原菌有较高活性的化合物，人工模 拟合成并开发出绿帝、银泰农用杀菌剂系列产品。拟银杏杀菌剂绿帝对人畜低毒，大 白鼠经口l d s o 为6 8 1 m g k g ，大白鼠经皮l d 5 0 2 1 5 0m g k g ；a m e s 试验、细胞微粒核 试验和染色体畸变试验，结果均为阴性。即无致癌、致畸和致突变作用。制剂为1 0 的乳油，外观淡黄色，油状液体，性质稳定，高效、低毒、低残留，对作物和天敌安 全，对各种蔬菜、果树和大田作物真菌病害有突出的防治效果。银泰( 有效成分：4 丁酰基苯酚) 【3 5 】是以银杏中具有生物活性化学物质的结构为先导化合物，采用人工模 拟技术合成的一种农用杀菌剂，室内生测结果表明，银泰对苹果腐烂病菌、苹果干腐 病菌、葡萄黑豆病菌、番茄灰霉病菌、小麦纹枯病菌及玉米大斑病均具有显著的抑制 作用。田间对5 种植物病害的药效试验也证明：对苹果腐烂病、苹果轮纹病、番茄灰 霉病、玉米大斑病及小麦纹枯病均具有良好的防治效果，且优于常用的杀菌剂。 蛇床子素一蛇床子素是从伞形科植物蛇床干燥成熟的果实蛇床子中提取得到的 有效成分，制剂为o 4 蛇床子素乳油。它以触杀作用为主，胃毒作用为辅，对十字 花科蔬菜菜青虫和茶树茶尺蠖有较好的防效p 6 1 。 苦皮藤素苦皮藤素是从卫矛科野生灌木植物苦皮藤根皮和种子中提取得到 的有效成分，制剂为l 苦皮藤素乳油。该药具有较强的胃毒、拒食、驱避、触杀作 用，对十字花科蔬菜菜青虫有较好的防划3 6 】。 血根碱一血根碱为罂粟科植物博落回的提取物博落回生物总碱中的主要有效成 分之一，制剂为1 血根碱可湿性粉剂( 5 博落回生物总碱可湿性粉剂) 。该药对十 字花科蔬菜菜青虫、菜豆蚜虫、苹果黄蚜和二斑叶螨、梨树梨木虱有一定的防效p 引。 桉叶素一桉叶素是桉叶油的主要成分，制剂为5 桉叶素可溶液剂，该药对十字 花科蔬菜蚜虫有较好的防效【3 6 】。 7 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论丈 1 7 苍耳的研究进展 1 7 1 苍耳的生物学特性及地理分布 苍耳( x a n t h i u ms i b i r i c u mp a t r e xw i d d ) ，属菊科( c o m p o s i t a e ) 、苍耳属( x a n t h i u m l ) 。 苍耳全草有毒，幼苗、嫩芽、种子的毒性最大【3 7 1 。苍耳适应性很强，常分布于 农田、荒野草地，田埂沟边苗圃。除广泛分布于我国外，在苏联、印度、朝鲜和日本 也有分布【2 1 。 1 7 2 苍耳的化学成分 苍耳全草含苍耳甙( x a n t h o s t r u m a r i n ) 、黄质宁( x a n t h i n i n ，即隐苍耳内酯) 、苍耳明 ( x a n t h u m i n ， 即苍耳内酯) ，苍耳亭( x a n t h a t i n ，异名苍耳素) 、8 ( 3 一异戊烯基) - 5 ，7 ， 3 ，4 四羟基黄酮以及咖啡酸和l ，4 二咖啡酰奎宁酸【3 8 ，3 9 1 。此外，尚含查耳酮衍生 物、水溶性甙、酒石酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、硝酸钾等【7 1 。苍耳子中除富含 脂肪油外，尚含挥发油及其它有效成分3 9 1 。文献记载【4 0 】，苍耳子中含脂肪油9 2 ， 其中亚油酸6 4 2 ，棕榈酸5 3 2 ，含苍耳子苷1 2 。 张玉岜【4 1 1 等应用g c m s 联用技术对苍耳草挥发油的化学成分进行了分析研究， 鉴定了8 种呋喃类烯类化合物。刘玉鹏吲等用气相色谱分析苍耳籽油中脂肪酸的成 分，其中以亚油酸为主，含量为6 5 9 ，油酸含量为2 0 8 ，而饱和脂肪酸含量较低。 郭冬艳等【1 1 采用柱层析分离、薄层板定位、生物测定跟踪相结合的方法，得到苍 耳提取物中活性较高的化合物口9 4 3 ，4 4 1 。它们有：4 甲氧基苯甲酸、反式z a 一环氧没 药烯、1 1 十六酸、( z ，z ) 9 ，1 2 十) k - - 烯酸、9 ，1 2 十) k - - 烯醛、邻苯二甲酸2 乙 基己酯、菜油甾醇芸苔甾醇、2 乙基氮葸、反式1 甲基4 ( 1 异丙基) 2 环己烯1 醇、 十八烷、4 ( 氧代辛基) 苯胺、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二丁酯、( z ) 一9 一十八酰 胺i 。 1 7 3 医药应用研究 苍耳作为药用植物历史悠久，据资料记载：全草入药，清热解毒、治。肾炎；茎叶 入药，治疥癣、湿疹、虫咬伤等；果实入药，为发汗利尿药，有镇静、镇痛作用，可 治肌肉神经麻痹、关节痛、梅毒、水肿等多种疾患【3 8 1 。苍耳油中的主要成分亚油酸药 用价值更高，是脉通、益寿宁、亚油酸乙酯等治疗心、脑血管疾病良药的主效成分h 5 1 。 姜克元等【删在细胞培养中测定不同浓度苍耳予提取液对单纯疱疹病毒的抑制作用。 1 7 4 农药应用研究 8 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 张兴等【4 7 】对我国西北五省( 区) 部分地区杀虫植物资源进行了初步调查。结果表 明，菊科的苍耳除可用来防虫外，对赤霉菌、洋麻炭疽菌以及黑根霉菌等重要农作物 致病菌也有明显抑制作用。王问学等【4 8 】测定了苍耳等植物的乙醇抽提物对卫茅尺蠖和 菜青虫的药效，结果表明幼虫在苍耳乙醇提取液处理的叶片上5 - 6 小时内不取食，四 处爬行不安。李云寿等【4 9 】对1 4 种菊科植物提取物对菜青虫的杀虫活性进行了研究， 结果表明苍耳的甲醇提取物处理菜青虫在2 4 h 后的死亡率达到5 0 。章玉苹等1 5 0 1 狈0 定了9 种菊科植物对3 种害虫的拒食活性，结果表明，苍耳的甲醇提取物对4 四龄菜 粉蝶幼虫、3 龄小菜蛾和3 龄斜纹夜蛾2 4 h 的拒食率分别为5