（生物化学与分子生物学专业论文）重组葡激酶的蛋白质工程研究.pdf

重组葡激酶的蛋白质工程研究摘要重组葡激酶( r _ s a k ) 是一种正在临床试用中的新型奎垒盟f 具有纤维蛋白专一性强、溶栓效率高、价格便宜等优点，但是s a k 在体外易自发聚合、抗原性较强。此外，目前主要的溶栓剂均为注射用药，不能干预血栓病的复发或预防此类疾病r g d 肽已被证明能够显著抑制血小板的聚集，而如何在适当位置引入s a k 尚无报道r 。本文运用x 射线晶体衍射、计算机辅助分子模拟等方法建立了s a k 、s a k m p l g 、s a k 二聚体的空间结构模型，结合功能信息合理设计新型s a k 分子，并利用基因工程和蛋白质工程方法得到各种s a k 突变体，高度纯化后用于各种埋化和生物学性质研究，最终在保持s a k 溶栓活性的前提下，得到了聚合能力弱、免疫原性低、分子量小的新型s a k 突变体，并且能够显著抑制血小板聚集，具有溶栓抗栓双重功能在已获得的新型重组葡激酶组合突变体y s a k 高效表达菌的基础上，初步建立快速、简便、高效的中试工艺f 采用低密度发酵，表达水平在5 0 p x上。经稀释复性、二步纯化即可获得纯度为9 5 以上的半成品，比活性9 1 0 4 h u r n g ，产率l l o m g l 培液l c m s 测定分子量为1 3 8 0 6 ，n 端1 5 个氨基酸序列测定与预期一致制成的口服制荆在猴动物模型中能缓释吸收，6 h后纤溶活性达到高峰人微小纤溶酶原m p l g 仅包含p i g 的丝氨酸蛋白酶区，分子量较小，便于操作，且保留了p l g 的活性区及与s a k 的结合区，因】 峨们选择m p l g 为简化的研究对象我们应用毕赤酵母表达系统表达人微小纤溶酶原及其活性中心丝氨酸突变体，摇瓶表达水平可达3 0 0 m g l ，培液中m p l g 的纤溶活性3 4 天后达到高峰，而m m p l g 未显示纤溶活性，经s e p h a d e xg 5 0 、q s e p h a r o s ef f两步纯化即得纯度为9 5 的产物此工作为制备s a k - m p l g 复合物的晶体及以m p l g 为靶的噬菌体肽库筛选的研究提供了条件j 一j 一?f关犍词：葡激舔_ 人微小纤溶酶屑结构。x 胃功能v ，蛋白质工程i中试分类号：q 7 8 9p r o t e i ne n g i n e e r i n go fr e c o m b i n a n ts t a p h y l o k i n a s er e c o m b i n a n ts t a p h y l o k i n a s e ( s a k ) i sap r o m i s i n gt h r o m b o l y t i ca g e n tw h i c hh a sb e e nu n d e rc l i n i c a lt r i a l s a ki sf i b r i n s e l e c t i v e ，h i g h l ye f f i c a c i o u sa n di n e x p e n s i v eb u te a s yt op o l y m e r i z ea n di m m u n o g e n i c f u r t h e r m o r e ，a l lc u r r e n tt h r o m b o l y t i ca g e n t sa p p r o v e df o rc l i n i c a lu s ea r ea d m i n i s t e r e db yc o n t i n u o u si n f u s i o no rb o l u si n j e c t i o n ，u n s u i t a b l ef o rp r e c a u t i o na g a i n s tt h r o m b o t i cd i s e a s e s m o r e o v e r ，m a n ys t u d i e sh a v er e v e a l e dt h a tr g dp e p t i d ec o u l di n h i b i tp l a t e l e ta g g r e g a t i o nw h i l et h e r ew a sn or e p o r t sa b o u th o wt og r a f tr g ds e q u e n c eo n t os a k 3 一ds t r u c t u r e so fs a k ，s a k m p l ga n ds a kd i m e rw e r ed e t e r m i n e dv i ax - r a yc r y s t a l l o g r a p h ya n dc o m p u t e rm o d e l i n g t h e nn o v e lv a r i a n t so fs a kw e r er a t i o n a l l yd e s i g n e du s i n gs t r u c t u r e f t m c t i o ni n f o r m a t i o n a l lm u t a n t sw e r eo b t a i n e dw i t hg e n e t i ce n g i n e e r i n ga n dp r o t e i ne n g i n e e r i n g f u r t h e rc h a r a c t e r i z a t i o no fh i g h l yp u r i f i e dp r o d u c t sp r o v e dt h a tn o v e lv a r i a n t so fs a kw e r ed e v e l o p e dw i t hr e d u c e dp o l y m e r i z a t i o np r o p e r t y , t e s si m m u n o g e n i c i t y , l o wm o l e c u l a rw e i 【g h ta n di n h i b i t o r ya c t i v i t yo f p l a t e l e ta g g r e g a t i o n ar a p i d ，e f f e c t i v ea n ds i m p l es t r a t e g yf o rp i l o tp r o d u c t i o no fy i - s a k ，an o v e lv a r i a n to fr e c o m b i n a n ts t a p h y l o k i n a s e ，w a se s t a b l i s h e du s i n gs e l e c t e ds t r a i nw i t hh i g he x p r e s s i o nl e v e l o v e r5 0 e x p r e s s i o nl e v e lw a sa c h i e v e dw i t hl o w - d e n s i t yf e r m e n t a t i o np r o c e d u r e y - s a kr e f o l d e dw i mr a p i dd i l u t i o np r o t o c o la n dw a sp u r i f i e db yg e lf i l t r a t i o na n di o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw i t hap u r i t yo fo v e r9 5 t h es p e c i f i ca c t i v i t yo fy - s a kw a s9 10 4 h u m ga n dt h eo u t p u tw a s110 m g l t h em o l e c u l a rw e i g h to fy j - s a kw a s13 8 0 6 ，d e t e r m i n e db yl c - m s t h ea u t h e n t i c i t yo f1 -15n h z - t e r m i n a la m i n oa c i d sw a sc o n f i r m e db yp e p t i d es e q u e n c i n g i nm o n k e ym o d e l s ，t h ef i b r i n o l y t i ca c t i v i t yr e a c h e dp e a ki n6 ha f t e ro r a ld e l i v e r yo fs p e c i a lp r e p a r a t i o no fy i - s a k h u m a nm i c r o p l a s m i n o g e n ( m p l g ) ，at r u n c a t e df o r mo f p l a s m i n o g e n ，c o n s i s t so n l yo ft h ep r o e n z y m ed o m a i n m p l gr e t a i n e dt h ec h a r a c t e r i s t i co ft h en a t i v ep l a s m i n o g e na sr e g a r d sc o m p l e xf o r m a t i o na n da c t i v a t i o nb ys t a p h y l o k i n a s e ，a n da m i d o l y t i ca c t i v i t yo ft h ec o g n a t ee n z y m em i c r o p l a s m i n ( m p l m ) b u t 谢ml o wm o l e c u l a rw e i g h t t h u sm p l gw a sc h o s e na st h es i m p l i f i e dm o d e lt op e r f o r mo u ri n v e s t i g a t i o n s m p l ga n ds e r i n em u t a n to f m p l ga ta c t i v es i t ew e r ec l o n e da n de x p r e s s e di np i c h i a p a s t o r i s ，r e s p e c t i v e l y t h ef i n a le x p r e s s i o nl e v e lo fm p l gc o u l db ea b o u t3 0 0 m g la ts h a k i n gn a s k m p l ga c t i v i t yi nt h ec u l t u r er e a c h e dm a x i m u mi n3 - 4d a y sw h e r e a 8n of i b r i n o l y t i ca c t i v i t ya p p e a r e df o rm m p l g i tw a sp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yw i t hs e p h a d e xg - 5 0a n dq - s e p h a r o s ef fc o l u m n si ns e q u e n c ew i t hap u r i t yo fm o r et h a n9 5 o u rr e s e a r c hs h e dal i g h to ng e t t i n ge n o u g hp r o t e i n sf o rt h es t u d yo fs a k 。m p l gc r y s t a la n ds e l e c t i o no f m i n i m i z e ds a kw i t hp h a g ed i s p l a ys y s t e m s k e yw o r d s ：s t a p h y l o k i n a s e m i c r o p l a s m i n o g e n ，s t r u c t u r ea n df u n c t i o n ，p r o t e i ne n g i n e e r i n g ，p i l o ts t u d y2前言急性心肌梗塞、缺血性脑梗塞等血栓栓塞性疾病的致残率和致死率位居各病症之首，严重威胁人类生命和健康溶栓治疗是目前治疗此类疾病的主要手段。1 9 9 9 年，全世界有超过7 5 万的患者接受溶栓治疗，各类溶栓剂的销售额超过1 0 亿美元，而且随着溶栓疗法的日益成熟和临床医生对溶栓疗法的熟悉，溶栓剂的用量逐步扩大溶血栓药物通过激活无活性的血浆纤溶酶原( p l a s m i n o g e n ，p i g ) 。形成有活性的纤溶酶( p l a s m i n ，p l m ) ，后者催化血栓主要基质纤维蛋白水解，使血栓溶解，血管再通，从而特效抢救急性c 2 v t , 梗塞和脑梗塞患者，显著地降低病死率，提高患者病后的生活质量国内外已正式批准临床使用的主要溶栓药物有：链激酶( s t r e p t o k i n a s e s k ) 、尿激酶( u r o k i n a s e - t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r , u - p a ) 、重组组织型纤溶酶原激活卉 1 ( r e c o m b i n a n tt i s s u e - t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r , r t - p a ) 、对一甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活荆复合物( a n i s o y l a t e dp l a s m i n o g e ns t r e p t o k i n a s ea c t i v a t o rc o m p l e x ，a p s a c ) 、重组链激酶( r e c o m b i n a n ts t r e p t o k i n a s e ，卜s k ) 和新型t p ：a 突变体r e t e p l a s e ( r - p a ) 。经三次多中心大范围1 0 万余病例临床研究，证明s k 、r t p a 和a p s a c 三种溶栓药物对急性心肌梗塞( a c u t em y o c a r d i a li n f a r c t i o n a m i ) 的疗效和不良反应无显著差别临床医生认为，抢救a m i 病人选择哪一种溶栓药物并不十分重要，最重要的是争取时间，及早进行溶栓治疗1 现有溶栓药物疗效肯定，明显降低了a m i 患者的死亡率和致残率，但还存在许多缺陷，如初始再灌注延迟或失败，出血等不良反应、以及再梗塞等问题针对上述缺陷，研究人员试图研制高效、快速、防止再栓塞及减低出血等不良反应的新型溶栓药物随着分子生物学技术的飞速发展，以及结构生物学的兴起，对现有蛋白质多肽类溶栓药物的编码基因及其蛋白质的结构与功能有了比较深入的了解，在此基础上，通过蛋白质工程研制了多种突变体、嵌合体和多功能溶栓药物，一些新型溶栓药物已在临床试验中显示了明显优于传统溶栓药物的效果1 2 , 3 1天然葡激酶( s t a p h y l o k i n a s e ，s a k ) 是金黄色葡萄球菌分泌的一种蛋白水解酶，由1 3 6 个氨基酸组成迄今为止，从不同种属的金黄色葡萄球菌中克隆了4 种s a k 基因，分别编码了4 种s a k 变体，这些变体在物理化学性质、溶栓特性等方面基本没有差异“。1 s a k 本身并不是酶，它在人血浆中与p i g形成l ：l 复合物，该复合物被血块表面痕量的p l m 激活为s a k p l m ，s a k p l m中p l m 的底物特异性发生改变，形成高效的纤溶酶原激活剂，激活游离的p i g形成p l m ，p l m 催化血栓主要基质纤维蛋白降解，从而溶解血栓由于s a k激活p l g 具有纤维蛋白专一性，而且对陈旧性血栓和富舍血小板血栓的溶解作用比其他溶栓药物更强，因此s a k 是一种高效特异的溶栓剂1 9 9 7 年，比利时c o l l e n 等在i i 期临床试验时治疗1 0 2 例急性心肌梗塞病人，冠脉造影显示6 8 的病例在9 0 分钟内冠脉完全再通，血浆中的纤维蛋白原和o 【：m a p 水平无明显改变。r - s a k 作为溶栓药物，具有良好的应用前景 4 1本室于1 9 9 4 年自行构建了s a k 基因，实现了在大肠杆菌中的高效表达“l ，并完成了中试研究n l ，已申报临床试用，重组葡激酶( r e c o m b i n a n ts t a p h y l o k i n a s e r s a k ) 即将试用于治疗急性脑梗塞但是，s a k 是异体蛋白，用于人体有较强的抗原性，虽然临床试用中还未发现有严重过敏反应，然而大部分病人用药二周后，出现高滴度的中和抗体，阻碍了s a k 的重复使用n 1 ；同时，我们在研究过程中发现，重组葡激酶易形成二聚体、甚至多聚体，聚合体仍有纤溶活性聚合体的形成很可能导致s a k 免疫原性的增强防止葡激酶自身聚合，降低葡激酶的免疫原性，将有助于发挥葡激酶防治血栓性疾病的效用和安全性。在利用溶栓药物进行溶栓治疗的同时，通常联合应用肝素、阿斯匹林、g p l i b l l l a 单克隆抗体等抗凝血酶。抗血小板聚集的药物，以促进溶栓，并防止血栓再次形成和发生再梗塞近年来，溶栓辅助药的研究引人注目a r g g l y a s p ( r g d ) 或l y s - g l y - a s p ( k g d ) 序列是对抗血小板聚集的功能序列，可竞争结合与血小板凝聚有关的膜受体i i b i l i a ，从而阻止纤维蛋白原与受体结合，阻断血栓再形成 9 , 1 0 1 因此，在一定构象限制下，将r g d k g d 序列导入溶栓药物，如t p ac d n a 的一定部位，其表达产物具有溶栓、防栓的双重功能1 ”基于r g d 瓜g d 序列，还发展了许多化学模拟物，如t i r o f i b a n ，l a m i f i b a n ，l e f r a d a f i b a n o r b o f i b a n , x e m i l o f i b a n , i n t e g r i l i n 等，亦可封闭i i b i i i a 受体，与溶栓药物合用，再梗塞发生率显著降低1 2 1在葡激酶的合适位置引入r g d k g d 序列，可望发展兼具溶检、防栓功能的新型溶栓剂现有主要溶栓剂t - p a 、s k 、u k 、a p s a c 、s a k 、r p a 等均是注射用药，其剂型不能用于血栓病的复发或预防，研究干预血栓病复发或预防血栓病的新药很有必要目前，口服溶栓药物主要有蚓激酶胶囊，已广泛应用于临床。其主要成分e - p a 由分子量分别为2 6 k d 和1 8 k d 的双亚基组成m “i 经标记口服后，血浆及组织内可测到标记物，而且血浆中纤维蛋白原、血粘度、全血比粘度以及血栓干重都有下降，临床应用后，栓塞症状改变r - s a k 分子量更小( 1 5 5 k d ) ，纤溶活性高，对富舍血小板的陈旧性血栓的溶化效果明显强于其他溶栓药本室r s a k 做成特殊口服制剂后，吸收快，血浆纤溶活性增高2 3 倍，可望取得比蚓激酶更好的溶栓防栓效果1 1 5 1 r s a k 与其他溶栓药物比较，具有分子量小、特异性高、疗效安全等显著优点。同时，r s a k 蛋白质结构特殊、同源结构罕见，x 射线晶体衍射1 1 6 j 7 1及n m r 溶液构象测定”1 表明，r s a k 是一个椭球状分子，活性区集中位于球状分子的一侧，是利用蛋白质工程进行构效关系研究、定向改造和药物分子设计研究的理想模型基于以上认识，利用蛋白质工程技术对野生型卜s a l ( 进行合理改造，可望开发低免疫原性新型双功能r s a k 、低分子量新型口服r s a k ，用于血栓病的急救与预防s a l 【新型分子的合理设计必须建立在精确了解s a k 、s a k p i g 、s a kd i m e r等相关分子的三维结构的基础上x 射线晶体学方法是迄今为止研究蛋白质结构最有效的方法，所能达到的精度是任何其它方法所不能比拟的，其缺点是蛋白质的晶体难培养，晶体结构测定的周期较长近年来发展起来的多维核磁共振方法可以直接测定蛋白质在溶液中的构象，但样品需要量大，纯度要求高、被测定的蛋白质分子量一般不能超过3 5 0 0 0 计算机辅助的蛋白质结构预测是一种不依赖于晶体培养，能迅速、简便易行地确定蛋白质结构的方法，虽然由于蛋白质结构异常复杂，目前还不能从理论上完全解决结构预测的问题，但是其发展十分迅速，地位日益重要由于p i g 分子量很大且非常柔韧，难以获得完整晶体，故其精确结构的确定受到限制，影响了结构和功能的深入研究，而研究p i g 和s a k 相互作用的困难更大人m p l g 是p i 9 5 3 1 - 7 9 1 位间的由2 6 1 个氨基酸组成的肽链，有6 对二硫键，不包括p i g 的n t p 、k l k 区，但保留了p i g 的活性区及与s a k 的结合区，被激活后，形成m p l m ，具有p l m 的纤溶活性m p l g 分子量较小，较易操作，因此我们选择m p l g 为研究对象i 1 9 1 近五年来，生物大分子模拟肽研究成为国际上研究的热点基于结构的合理设计与基于功能的筛选是目前进行生物大分子模拟肽研究的主要手段啪1 最著名的例子是美国加州a f r y m a x 研究所d o w e r 领导的小组应用随机p h a g ed i s p l a y 肽库和亲和筛选的方法，成功地将e p o ( 分子量3 4 k d ，1 6 6 a a ) 缩小为2 0 个残基的环肽，仍具有e p o 的活性 2 1 1由于s a k 本身并不是酶，它是通过改变p l m 的底物特异性而发挥作用的，而且实验中还发现一些在大肠杆菌中表达时形成包涵体的s a k 突变体，经强变性剂如6 m 盐酸胍或8 m 尿素溶解后，即有一定的纤溶活性显示，因此，我们推测，s a k 相当于一种辅因子( c o f a c t o r ) ，其发挥纤溶活性对结构的要求并不十分严格，很可能只需要s a k 分子中维持一定构象的肽段或模拟肽，即可发挥s a k 的功能以m p l g 为靶分子，应用构象自由和构象约束的随机p h a g ed i s p l a y 库进行s a k 模拟肽的筛选，有望发展多肽类溶栓剂。因此，本课题的研究目标是在本室基因工程葡激酶研究的基础上，利用x射线晶体学、计算机辅助的蛋白质结构预测建立r - s a k 、卜s a k 二聚体、r s a k r m p l g 复合物的空间结构，并利用能量优化和分子动力学研究对结构进行优化( 残基替换和分子剪裁) ，在保持活性中心功能域和构象稳定的前提下，设计具有分子量小、聚合能力弱、免疫原性低、溶栓抗栓双功能等优越性的r - s a k突变体，通过d n a 重组技术制备，研究激活p i g 的机制，研制r - s a k 突变体的口服制剂，以便预防血栓性疾病；在此基础上准备采用自由和构象约束的随机p h a g ed i s p l a y 库筛选r - s a k 的模拟肽，为进一步通过a l a n i n es c a n n i n g 、突变p h a g ed i s p l a y 库优化和开发小分子肽类溶栓药物奠定基础参考文献1 t h eg u s t oi n v e s t i g a t o r s a ni n t e r n a t i o n a lr a n d o m i z e dt r i a lc o m p a r i n gf o u rt h r o m b o l y t i cs t r a t e g i e sf o ra c u t em y o c a r d i a li n f a r c t i o n ne n g ljm e d ，19 9 3 ，3 2 9 ：6 7 3 6 8 22 r o s sam n e wp l a s m i n o g e na c t i v a t o r s ：ac l i n i c a lr e v i e w c l i nc a r d i o l ，1 9 9 9 ，2 2 ：1 6 5 1 7 13 v e r s t r a e t em t h i r d g e n e r a t i o nt h r o m b o l y t i cd r u g s a mjm e d ，2 0 0 0 ，1 0 9 ( 1 ) ：5 2 5 84 c o l l e nd s t a p h y l o k i n a s e ：ap o t e n t ，u n i q u e l yf i b r i n s e l e c t i v et h r o m b o l y t i ca g e n t n a t u r em e d ，l9 9 8 ，4 ( 3 ) ：2 7 9 - 2 8 45 k i msh ，c h u nhs ，s u kk ，e ta 1 an o v e lv a r i a n to fs t a p h y l o k i n a s eg e n ef r o ms 诅p h y l o c o c c u sa u r e l l sa t c c2 9 2 1 3 t h r o m br e s ，1 9 9 7 ，8 7 ( 4 ) ：3 8 7 3 9 56 汤其群，任军，宋后燕等重组葡激酶的分离、纯化和结晶药物生物技术，1 9 9 7 4 ：1 47 于敏，张小璇，宋后燕等重组葡激酶的中试研究高技术通讯，1 9 9 8 ，8 ( 1 ) ：4 8 5 148 d e c l e r c kpj ，v a n d e r s c h u e r e ns ，c o l l e nd ，e ta 1 p r e v a l e n c ea n di n d u c t i o no fc i r c u l a t i n ga n t i b o d i e sa g a i n s tr e c o m b i n a n ts t a p h y l o k i n a s e t h r o m bh a e m o s t ，19 9 4 ，7 1 ：1 2 9 - 1 3 39 f r i s h m a nwh ，b u m sb ，l e r r i e kk ，e ta 1 n o v e la n t i p l a t e l e tt h e r a p i e sf o rt r e a t m e n to fp a t i e n t s 、i t l li s c h e m i ch e a r td i s e a s e ：i n h i b i t o r so ft h ep l a t e l e tg l y c o p r o t e i ni ib i i l ai n t e g r i nr e c e p t o na mh e a r tj ，1 9 9 5 ，1 3 0 ：8 7 7 8 9 21 0 g u l b adc ，h a b e rk ，d i e t zk ，e ta 1 p l a t e l e ti n h i b i t i n gn e wa g e n t s ，n e ws t r a t e g i e s ，n e w t r i a l s f i b r i n o l y s i sp r o t e o l y s i s ，1 9 9 8 ，1 2 ( s u p p l2 ) ：1 3 2 31 1 s m i t hjw ：t a c h i a sk a t h y , m a d i s o nel p r o t e i nl o o pg r a f t i n gt oc o n s t r u c tav a r i a n to f t i s s u e t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o rt h a tb i n d sp l a t e l e ti n t e g r i na d jb i o lc h e m ，1 9 9 5 ，2 7 0 ( 5 1 ) ：3 0 4 8 6 - 3 0 4 9 01 2 v e r s t r a e t em 。z o l d h e l y ip n o v e la n t i t h r o m b o t i cd r u g si nd e v e l o p m e n t d r u g s ，1 9 9 5 ，4 9 ：8 5 6 - 8 8 41 3 杨嘉树，李令媛，茹炳根蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂( e - p a ) 的分离纯化中国生物化学与分子生物学学报，1 9 9 8 ，1 4 ( 2 ) ：1 5 6 1 6 31 4 扬嘉树，李令媛，茹炳根蚯蚓体内一种纤溶酶原激活荆( 争p a ) 的部分性质研究中国生物化学与分子生物学学报，1 9 9 8 ，1 4 ( 2 ) ：1 6 4 1 6 91 5 黄阳滨重组葡激酶( r - s a k ) 口服制剂的研制：硕士学位论文上海：上海医科大学，2 0 0 0 1 6 z h a nch ，l i a n gdc ，s o n ghy ，e ta 1 c r y s t a l l y z a t i o na n dp r e l i m i n a r yx r a yd i f f r a c t i o ns t u d i e so f r e c o m b i n a n ts t a p h y l o k i n a s e a c t ac r y s t ，1 9 9 6 ，5 2 ：5 6 4 5 6 517 r a b j n sa ，d eb o n d thl ，d er a n t e rc t h r e e d i m e n s i o n a l - s t r u c t u r eo fs t a p h y l o k i n a s e ，ap l a s m i n o g e na c t i v a t o rw i t ht h e r a p e u t i c a lp o t e n t i a l n a ts t r u c tb i o l ，l9 9 7 ，4 ：3 5 7 3 6 018 o h l e n s c h l a g e rd ，r a m a c h a n d r a nr ，b r o w nlr n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c es o l u t i o ns t r u c t u r eo ft h ep l a s m i n o g e n a c t i v a t o rp r o t e i ns t a p h y l o k i n a s e b i o c h e m i s t r y , 1 9 9 8 ，3 7 ：1 0 6 3 5 1 0 6 4 219 p o n t i n gcp m a r s h a l ljm ，c e d e r h o l m - w i l l i a m ssa p l a s m i n o g e n ：as t r u c t u r a lr e v i e w b l o o dc o a g u lf i b r i n o l y s i s ，1 9 9 2 ，3 ：6 0 5 6 1 42 0 c u n n i n g h a mbc ，w e l l sja m i n i m i z e dp r o t e i n s c u r ro p i ns t r u c tb i o l ，19 9 7 ，7 ( 3 ) ：4 5 7 4 6 22 1 w r i g h t o nnc ，f a r r e l lfx ，d o w e rwj ，e ta 1 s m a l lp e p t i d e sa sp o t e n tm i m e t i c so ft h ep r o t e i nh o r m o n ee r y t h r o p o i e t i n s c i e n c e ，1 9 9 6 ，2 7 3 ：4 5 8 - 4 6 35第一部分葡激酶结构与功能的关系及新型葡激酶斯生物的研制阐明葡激酶结构与功能的关系是研制新型葡激酶衍生物的基础，因此s a k三维结构的解析首先引起人们关注。我室先与梁栋材院士( 中科院生物物理所)合作，在国际上首先获得了葡激酶的结晶1 1 ，然后与饶子和教授( 清华大学)合作通过x 射线晶体衍射解析了本室s a k 的三维结构比利时的r a b j i n 小组率先报导了另一种葡激酶天然变体的x 射线晶体衍射结构n 1 两种葡激酶天然变体的结构大体上相似，但是，由于氨基酸的差异，在局部仍有结构上的不同。s a k 是一椭球状分子，从第2 1 个残基起，五条d 折叠股构成的d 折叠片包裹在一个由1 2 个残基构成的a 螺旋上，而n 端2 0 个氨基酸暴露在外，非常柔韧由于s a k 与p i g 形成复合物是s a k 发挥溶栓功能的首要条件，所以精确了解s a k 与p i g 复合物的结构是设计新型s a k 分子的关键我们在研究中还发现s a k 有较强的自身聚合倾向，聚合体的形成很可能导致s a k 免疫原性的增强，因此有必要去除s a i ( 的聚合性能在本部分中，我们首先针对不同的问题建立相关分子的空间结构模型，然后合理设计、制备相应的突变体，通过性质研究获得性能更为优越的突变体，最后综合各突变位点，设计、构建、表达和纯化组合突变体，最终得到了聚合能力显著下降、免疫原性低、分子量小的新型双功能s a k 衍生物，同时也更深入地阐明了葡激酶结构与功能的关系第一节低分子量新型重姐葡激酶衍生物的研制现有主要溶栓剂剂型单一，均为注射荆，显然不能日常多次用药开发其他剂型，如口服或透皮制剂，将有利于发展预防型溶栓剂由于蛋白质类药物，分子量较大( m w 1 0 k d ) 、易被蛋白酶水解、粘膜穿透性差，一般不稳定，因而目前已经临床使用的分子量最大的口服多肽药物一胰岛素( m w6k d ) 的分子量仍小于所有溶栓剂然而，生物大分子非静脉给药已成为制剂研究的热点，发展很快，如干扰素0 t 2 b ( m w1 8k d ) 、生长激素( m w 2 1 5k d )g c s f ( m w1 9k d ) 等均已制成口服制剂1 3 - 5 |正在进行临床前试验葡激酶分子量为1 5 5k d ，是目前最小的溶栓剂，如进一步降低分子量，无疑有助于非静脉制剂的研究s a k 与p i g 复合物的结构还未被解析，而m p l g 保留了与s a k 的结合区及p i g的丝氨酸蛋白酶活性区6 1 ，因此我们在预测s a k 与m p l g 复合物的结构基础上设计s a k 的突变体首先通过同源模建的方法预测m p l g 的三维结构，并利用s a k 的结构数据，通过计算机分子对接确定了s a k 与m p l g 的结合区，然后结合我们已有的实验证据，设计了n 端缺失1 5 个氨基酸的突变体，实现了在大肠杆菌中的高效表达及高度纯化性质比较表明，突变体a n s a k 与野生型s a k 的纤溶活性相似，n 端1 5 个氨基酸对葡激酶表现纤溶活性影响很小，建立的复合物结构模型基本合理1 材料和方法1 1 晶体结构与程序与清华大学饶子和教授合作，利用x 射线晶体衍射方法测定了本室研制的卜s a k 的晶体结构。计算机模建所用人m p l g 为p i g 分子第5 4 4 脯氨酸到7 9 1位天冬酰胺之间的区域，共2 4 8 个氨基酸残基同源蛋白质模型构建的主要软件为b i o s y m 公司的h o m o l o g y 和m o d e l e r ，用f a s t a 方法搜索参考蛋白显示序列联百己的c l u s t a lx ( 1 6 4 6 ) * - j 由匿名访问( 郇：邱- i g b m c u s t r a s b g f r p u b ) 得到，分子对接软件是美国r o c k e f e l l e r 大学v a k s e r 开发的g r a m mv 1 0 3n j ，展示蛋白质相互作用区域的l i g p l o t 软件由英国r o m a nl a s l o w s k i提供“】，显示氢键作用的h b p l u s 部分由英国i a nm c d o n a l d 提供。显示疏水相互作用的n a c c e s s 部分由英国s i m o nh c c b b a n d 提供，结果评估软件p r o s a i l 由奥地利m a n f r e ds i p p l 研究组提供，p r o f i l e - 3 d 为b i o s y m 公司产品所有工作均在s g l0 2 图形工作站上进行1 2 茼种与质拉大肠杆菌j m l 0 9 、质粒p u c l 9 为本室保存大肠杆菌j f l l 2 5 、原核表迭载体p l y - 4 由中科院生物化学研究所刘新垣院士惠赠质粒p s t s a k 为本室构建1 3 试剂与仪器e x p a n d t mh i g hf i d e l i t yp c rs y s t e m 购自b m 公司，核酸工具酶购自b r l公司，q i a g e n 核酸纯化柱购自基因公司，丙烯酰胺、尿素购自s i g m a 公司，q s - s e p h a r o s ef f 、i m a g e m a s t e r 2v d s 购自p h a r m a c i a 公司5 l 发酵罐、蛋白质层析系统分别为美国n b s 、w a t e r s 公司产品其余试剂均为国产分析纯1 4 寡聚棱苷酸由美国j o h n sh o p k i n s 大学d n a 合成组制备1 5 n s a k 基因的克隆设计克隆引物：上游引物5 c g c g a a t t c a t g a g t t a t r r r g a a c c a a c 3 下游引物5 c g c g g a t c ct 1 a r r r c t t t t c 3 以质粒p s t s a k 为模板，用上、下游引物通过p c r 扩增突变体基因，扩增片段以琼脂糖凝胶电泳分析鉴定k l e n o w 酶补平扩增片段末端，e c o r i b a m h l 酶解后与p u c l 9 重组，筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实预计位置的突变，由基康生物技术公司在a b l 3 7 7 测序仪完成然后用e c o r i 、b a m h i水解阳性克隆的重组质粒，分离a n s a k 基因，与表达载体p l y 4 的相应位点重纽，转化大肠杆菌j f l l 2 5 ，限制性内切酶酶解筛选重组的阳性克隆。1 6a n s a k 基因的原棱表达挑取数个阳性克隆菌落，在l b 溶液中3 0 c 振荡培养过夜，然后以m 。c a培养基1 ：5 0 稀释，3 0 振荡培养至a 。值为0 6 时，升温至4 2 诱导表达3 h 。诱导结束后，离心收集细菌，用p b s ( p h7 4 ) 洗涤2 次，用s d s - - p a g e分析表达产物，筛选a n s a k 表达克隆s d s - - p a g e 按l a e m m l i 方法进行1 7 翻转酪蛋白板法活性鉴定s d s - - p a g e 后，凝胶一切为二，一半进行考马斯亮蓝染色，另一半以含2 5 t r i t o nx 一1 0 0 的p b s ( p h7 4 ) 、p b s ( p h7 4 ) 各洗涤3 次，然后将此凝胶覆盖在含人纤溶酶原的酪蛋白凝胶板上，3 7 c 湿盒保温，观察表迭产物的纤溶活性1 8 工程菌的诱导表达选取高表达茵株，用5 l 发酵罐进行低密度发酵，温度诱导表达后收集菌体，p b s 洗涤，一7 0 c 保存待用发酵参数：3 0 ( 2 ，p h6 8 ，溶氧6 0 ，搅拌速度随氧含量连动，至a 值升至2 0 时升温至4 2 ( 2 诱导湿茵用p b 缓冲液悬浮，以高压匀浆泵压榨，离心后，s d s p a g e 分析n s a k 在茵中的存在状态1 9q s e p h a r o s ef f 、s s e p h r o s ef f 柱屡析以1 0 倍柱体积0 0 5 m p b ( p h7 8 ) 缓冲液平衡，上清直接上q s e p h a r o s ef f柱，流出的目的蛋白峰调节至p h 6 8 后，再上s s e p h a r o s ef f 柱w a t e r s色谱仪控制流速和检测蛋白峰上样结束后，以0 0 5 mp b 缓冲液( p h6 8 ) 洗至基线，0 1 m n a c l 梯度洗脱，收集洗脱组分，s d s p a g e 分析，以b r a d f o r d法测定蛋白质浓度1 1 0 纯度鉴定及分子量测定样品进行1 5 s d s p a g e ，考马斯亮兰r 一2 5 0 染色后，i m a g e m a s t e r 8v d s 扫描测定纯度，根据标准分子量估测分子量1 1 1 生物擎活性潮定分别以酪蛋白凝