蛋白质组分析ppt课件.ppt

第十三讲蛋白质组数据分析,1,本章内容,9.1二维凝胶电泳数据分析9.2蛋白质质谱数据分析9.3蛋白质互作生物信息学9.4分析细胞通路的生物信息学方法,2,3,4,Whyproteomics？,5,Proteomics,1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，其定义为在一种细胞内存在的全部蛋白质。“.theanalysisofcompletecomplementofproteins.Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.(StanleyFields,UniversityofWashington,Seattle,inScience,291,1221(2001),整体性、动态性和系统性,6,Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.,7,从整体的角度,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域,aeukaryoticCell,蛋白质组学(proteomics),8,9,10,11,Biology/Disease-drivenHPP,12,蛋白质组学研究范畴,蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定蛋白质结构分析蛋白质-蛋白质生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异蛋白质信息库,13,蛋白质组学应用举例,研究细胞结果功能和分子组成,发现新的药物靶位点,发现新型生物学活性的分子和药物,差异蛋白质组学,发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物,修饰蛋白质组学,遗传或药理学扰动的分子解剖,病理生理学研究,中药机理,相互作用蛋白质组学,研究药物作用方式和毒性机理,植物抗虫抗旱抗逆,遗传育种和分子育种,资源环境,海洋生物,14,15,16,寻找差异蛋白质,环孢素A处理前,环孢素A处理后,正常组织,肿瘤组织,细胞,组织,17,18,19,Initialgoalwastorapidlyidentifyalltheproteinsexpressedbyacellortissueagoalthathasyettobeachievedforanyspecies!,20,蛋白质组学比基因组学研究复杂,蛋白质数量大于基因数蛋白质是动态的蛋白质序列复杂，不能PCR扩增，不能自动化测序,21,GenomicDNA,mRNA,Biologicalsystem,Functionalprotein,Proteinproducts,technology,emerging,prototype,mature,sequencing,Expressionprofile,Structuraldetermination,Proteinlinkagemap(catalog),Quantitativeproteinprofile,Proteinlinkagemap(dynamic),Subcellularlocation,PosttranslationalModificationanalysis,Activityprofile,Systemsimulation,Dataintegration,currentstatusofproteomictechnologies,22,BasictechnologiesofProteomics,2-Delectrophoresisofcomplexproteinmixtures：ThecoretechnologyofproteomicsIdentificationandstructureanalysisofproteinswithmassspectrometrymethods（生物质谱：ESI-MS,MALDI-TOF-MS）酵母双杂交Bioinformatics,23,24,25,生物信息学在蛋白质组学中的应用,26,生物信息学在蛋白质组学中的应用,27,28,29,1二维凝胶电泳数据分析,30,小鼠肝脏蛋白提取物2D凝胶电泳,2-DelectrophoresisgelfromProf.Dr.A.Grg,TechnicalUniversityMunich,Germany,31,样品制备（Samplepreparation）固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）第一向等电聚焦（IEF）胶条的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGEelectrophresis）凝胶的染色及检测（Detection/Staining）PDQuest软件分析（Softwareanalysis）质谱鉴定（Proteinidentification）,双向电泳实验流程,32,细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量,差异分析,双向电泳第一向第二向,图像获取图谱分析,银染考染荧光,蛋白标记,样品制备,分离,染色,图谱分析,挖点酶解点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程,33,样品制备,细胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除核酸、脂类,34,差异分析,图像获取图谱分析,银染考染荧光,蛋白标记,染色,图谱分析,挖点酶解点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,Separation,双向电泳第一向第二向,细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量,样品制备,2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程,35,36,双向电泳：传统方法,sample,胶在SDS缓冲液中平衡,PrincipleaccordingtoP.H.OFarrellandJ.Klose(1975),pH10,pH10,pH3,pH3,垂直胶管中进行等电聚焦,urea,NP-40,一向:,二向:,SDS丙烯酰胺凝胶电泳,非连续梯度胶,按等电点分离（电荷）,按分子量分离（质量）,37,等电聚焦电泳原理,38,固相凝胶(支持膜上0.5mm厚凝胶),丙烯酰胺缓冲液:ImmobilineCH2=CH-CO-NH-R,R：羧基或叔胺基,固相pH梯度,39,平衡过程,40,41,2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程,差异分析,图像获取图谱分析,蛋白标记,图谱分析,挖点酶解点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,分离,细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量,样品制备,双向电泳第一向第二向,银染考染荧光,染色,42,ProteinDetectionMethods,43,CoomassieBlue-考马斯亮蓝染色,灵敏度，低至0.01mg(“胶体”考染)非特异性染色染料与蛋白成比例结合线性化好扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度纯度不够有限的动力学范围,44,胶体考马斯亮蓝染色,1mgE.colistrainBIPGphor24cmpH4-7ColloidalCBBG250staining,45,银染,灵敏度，低至0.2ng在凝胶基质中与蛋白交联自动催化反应染凝胶表面蛋白线性化程度比考染低一些大分子物质也被染色步骤多，某些步骤时间控制严格,46,SilverstainedgelofE.coliLysate,IPG4-7SilverstainedwithPlusOneKitwithoutglutaraldehydeandformaldehydeintheAgsol.,47,差异分析,蛋白标记,挖点酶解点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,分离,细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量,样品制备,双向电泳第一向第二向,图像获取图谱分析,银染考染荧光,染色,图谱分析,2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程,48,凝胶的图像处理分析,扫描，图像处理斑点检测和定量数据分析2-DE数据库建立,ImageScannerIII图像扫描系统,49,2-DE/MS蛋白质组学经典工作流程,差异分析,蛋白标记,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,分离,细胞裂解匀浆预分级除杂质浓缩定量,样品制备,双向电泳第一向第二向,图像获取图谱分析,银染考染荧光,染色,挖胶,图谱分析,50,51,自动斑点切取Spotpicker,切点针头,胶盘,52,2-DE的局限性,53,SWISS一2DPAGE数据库是由日内瓦大学附属医院临床化学中心实验室与瑞士生物信息协会合作创办的人类维凝胶蛋白数据库为在2D凝胶上预测蛋白质迁移提供了许多标化的凝胶图象和工具比较已知细胞类型或组织的凝胶和SWISS一2DPAGE的图象即可以帮助识别关键标志物,54,55,SWISS-2DPAGEstatistics,56,57,58,59,60,人类肝脏,61,？,？,？,？,？,？,62,63,64,65,2生物质谱技术,66,数据及供电系统进样系统离子源质量分析器检测接收器真空系统,质谱仪包含了五个主要的系统：1、进样系统(sampleintroduction)2、离子源系统(ionizationsource)3、质量分析仪(massanalyzer)4、离子探测器(detector)5、数据处理系统(datasystem),质谱仪的基本结构,67,离子源,电离：质谱进行分析时，首先要做的就是离子化，也就是将待测物处理过后产生气相的离子，并带有电荷。离子源:使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置,并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同,分为硬电离和软电离。,68,对离子源的贡献软电离方式,目前有两种做法能使得蛋白质转变为气态离子而不会改变其结构与形态。由JohnB.Fenn所发展的方法是运用一个很强的电场将样品喷洒出去(ESI)，而产生一个个带电荷并能自由飞翔的离子。运用一个强烈的激光脉冲，在适当的条件下(视能量，与样品的结构和化学环境而定)运作，样品可接受激光脉冲的能量而被释放成为自由的离子(MALDI)，由KoichiTanaka最先提出的技术。,69,诺贝尔奖的提示,70,ESI电离机制,71,电喷雾电离产生多电荷离子,72,多电荷离子的有关计算,对于蛋白质，产生的多电荷离子为：M+nHn+，系列离子假设某一质谱峰(m/z)1对应的离子为M+nHn+,另一相邻质谱峰(m/z)2对应的离子为M+(n+1)H(n+1)+,且两个峰均为同一蛋白质产生，则可通过建设联立方程组来得到M和n的具体数值:,解方程组得到M和n。可以编制程序将所有相关的峰进行计算并取平均值，则可得到较精确的分子量信息。这一过程称作解卷积(Deconvolution)。,73,肌红蛋白电喷雾质谱图带1030个电荷的系列分子离子,74,基质辅助激光解吸电离技术(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization，MALDI),试样溶解或悬浮于基质中，激光束辐射到基质和试样分子上。基质吸收激光束能量后汽化，部分试样分子伴随基质的汽化而解吸。基质吸收大部分激光能量，减少了试样分子被激光能量破坏及过度电离成碎片离子。,75,关于基质：极性化合物溶解样品芳环吸收激光易结晶均匀分散样品分子MALDI常用基质,76,质量分析器Massanalysis,质量分析器是质谱仪的核心,它将离子源产生的离子按其质荷比(m/z)的不同在空间的位置时间的先后或轨道的稳定与否进行分离,以便得到按m/z大小顺序排列而成的质谱图。,77,两组四极杆分别加上+(u+Vcont)和(u+Vcont)，其中u直流电压部分，Vcont为射频电压部分=2f,f为频率。,四极杆质量分析器(QuadrupoleMassAnalyser),在场的中心和两条对角线上的任何一点电位为零。,通过直流和射频电压的改变来控制不同荷质比的离子通过；可以允许单一荷质比的离子通过；也可以进行荷质比扫描,78,四级杆模式,79,飞行时间质量分析器(TimeOfFlightMassAnalyser,TOF),离子源中的离子经加速电压获得的速度为：其中ze为电荷，V为加速电压，m为质量。,飞行管长度L，到达检测器的时间为：质量越大，飞行时间越长，实现分离。,m1和m2两个离子：,用已知样品进行校正，得到未知离子的质量。,80,质谱鉴定蛋白的一般方法,Databaseofsequences(i.e.SwissProt),Spectrumoffragmentsgenerated,MATCH,Library,基于肽质量指纹谱（PMF）,81,现行的PMF软件工具,82,以相关的质谱实验数据从序列数据库中进行发掘的蛋白质,MSFit,83,质谱数据输入框,翻译后修饰种类的选择,可选的质谱仪,酶选择,可选的物种,可选的序列数据库,84,MOWSEscore:MOlecularWeightSearch,ScoringbasedonpeptidefrequencydistributionfromtheOWLnonredundantDatabase%cov:totalaacoverage%tic:fragmentscoverage,85,86,3蛋白质相互作用分析（proteinproteininteractions，PPIs),Itisbeyondanydoubtthatproteinsandtheirinteractionsplayanessentialroleinmostcomplexbiologicalprocesses.分析蛋白质间的相互作用及方式,认识与特定生理活动相关的蛋白质网络,绘制蛋白质相互作用图谱,Schizophrenia-associatedproteins,87,typesofproteinproteininteractions(PPIs),Homo-oligomersvs.hetero-oligomersStableinteractionsvs.transientinteractionsCovalentvs.non-covalentObligatevsnon-obligateproteincomplexFuzzyproteincomplexesPPIsinterfacesexhibitbothshapeandelectrostaticcomplementarity,88,3.1研究PPIs的实验方法,yeasttwo-hybridsystemsaffinitypurification/massspectrometry,89,建立的基础：,真核细胞的转录因子：DNA结合域：DNAbindingdomain,BD转录激活域：Activationdomain,AD当两者独立存在时,无转录激活功能,但两者只要相互接近,即可激活转录,3.1.1酵母双杂交技术yeasttwo-hybridsystem,90,酵母双杂交系统的组成,与BD融合的蛋白表达载体，表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)与AD融合的蛋白表达载体，表达的蛋白称靶蛋白(prey或target)带报告基因(reportgene)的宿主细胞,91,92,酵母双杂交技术的应用,筛选、鉴定蛋白质间的相互作用：验证预测的蛋白间相互作用、鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响、筛选蛋白的级联底物。筛选、鉴定小分子与蛋白质之间的相互作用：鉴定干扰相互作用的分子、筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响。,93,酵母双杂交技术的应用,94,酵母双杂交技术的特点,优点：不需要抗体胞内实验缺点：筛选工作需要构建基因文库对于不能进入核内的蛋白质(如分泌蛋白、膜蛋白)和存在比较复杂的翻译后修饰作用的高等生物蛋白质,该技术尚不适用假阳性结果比例较高,95,双报告基因,96,3.1.2Affinitypurificationcoupledtomassspectrometry,97,Co-IP:Co-immunoprecipitation,Westernblot鉴定,PAGE,质谱,鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合，结合位点分析；筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档,98,3.2PPIsprediction,Effortstoexperimentallydeterminetheinteractomeofnumerousspeciesareongoing,andanumberofcomputationalmethodsforinteractionpredictionhavebeendevelopedinrecentyears.,99,3.2.1Textmining-basedPPIsprediction,text-miningbasedcomputationalmethodologies,aimingtoextractinformationforproteinsandtheirinteractionsfrompublicrepositoriessuchasliteratureandvariousbiologicaldatabases.,100,Left:SumofGoogle-Scholarcitationsforthetext-miningtools.Right:Google-Scholarcitationtrendsforeachtextminingtoolindividually.,101,3.2.2ThemethodofphylogeneticprofilesbasedpredictionThismethodisbasedonthehypothesisthatpotentiallyinteractingproteinsshouldco-evolveandshouldhaveorthologsincloselyrelatedspecies.Asimilarmethodcanbeappliedtoproteindomains,whereprofilesareconstructedfordomainstodetermineiftherearedomaininteractions.,102,一个基因组中不同的蛋白质编码基因，在另外一个基因组中，却融合成了一个基因，这表明基因融合或分裂事件的发生。从功能的角度看，基因的融合可能导致它们具有相关的生物学功能，例如它们可能在同一个蛋白质复合物（complex）、通路（pathway）或过程（process）中发挥功能。这种方法还可以预测可能存在的蛋白质-蛋白质相互作用,3.2.3ThedomainfusionorRosettaStonemethodforPPIsprediction,103,3.2.4Inferenceofinteractionsfromhomologousstructures,ChenXW,LiuM(2005)Predictionofproteinproteininteractionsusingrandomdecisionforestframework.Bioinformatics21:43944400.AloyP.,andR.B.Russell.(2003)InterPreTS:proteinInteractionPredictionthroughTertiaryStructure.Bioinformatics,19(1),161-162.Fukuhara,Naoshi,andTakeshiKawabata.(2008)HOMCOS:aservertopredictinteractingproteinpairsandinteractingsitesbyhomologymodelingofcomplexstructuresNucleicAcidsResearch,36(S2):185-.KittichotiratW,MGuerquin,REBumgarner,andRSamudrala(2009)ProtinfoPPC:awebserverforatomiclevelpredictionofproteincomplexesNucleicAcidsResearch,37(WebServerissue):519-25.ShoemakerBA,ZhangD,ThanguduRR,TyagiM,FongJH,Marchler-BauerA,BryantSH,MadejT,PanchenkoAR(2010)InferredBiomolecularInteractionServer-awebservertoanalyzeandpredictproteininteractingpartnersandbindingsites.NucleicAcidsRes.2010Jan;38(Databaseissue):D518-24.url:/pubmed/19843613EsmaielbeikiR,NebelJ-C(2014)Scoringdockingconformationsusingpredictedproteininterfaces.BMCBioinformatics,15:171.,104,Inferenceofinteractionsfromhomologousstructures,employingasequencebasedmethod(e.g.Interolog)tosearchforproteincomplexstructuresthatarehomologoustothequerysequencesTheseknowncomplexstructuresarethenusedastemplatestostructurallymodeltheinteractionbetweenquerysequencestheadvantage：inferringproteininteractions;suggestsmodelsofinteractstructurallyBut,limitednumberofknownproteincomplexstructures,105,Interologbasedprediction,Aninterologisaconservedinteractionbetweenapairofproteinswhichhaveinteractinghomologsinanotherorganism.SupposethatAandBaretwodifferentinteractinghumanproteins,andAandBaretwodifferentinteractingdogproteins.ThentheinteractionbetweenAandBisaninterologoftheinteractionbetweenAandBifthefollowingconditionsallhold:AisahomologofABisahomologofBAandBinteractAandBinteract,106,Interologbasedprediction,InterPreTS:proteinInteractionPredictionthroughTertiaryStructure,DBID:homologuesinadatabaseofinteractingdomains,107,Interologbasedprediction,HOMCOS(HomologyModelingofComplexStructure,http:/biunit.naist.jp/homcos):aservertopredictinteractingproteinpairsandinteractingsitesbyhomologymodelingofcomplexstructures,108,3.2.5IdentificationofstructuralpatternsforPPIspredication,109,Identificationofstruc