（病理学与病理生理学专业论文）雷公藤内酯醇对小胶质细胞no释放及inos表达的影响.pdf

1 ， | 番 ? ； j 目录 y1901498脚纱 中文摘要l 英文摘要3 英文缩写6 研究论文雷公藤内酯醇对小胶质细胞n o 释放及i n o s 表达的影响 亩f r 9 目u 舌 材料和方法1 l 结果2 l 附图2 4 讨论3 0 结论3 4 参考文献3 5 综述a p 与小胶质细胞在阿尔茨海默病中的作用研究进展3 9 致谢4 6 个人简历4 7 一 中文摘要 雷公藤内酯醇对小胶质细胞n o 释放及i n o s 表达的影响 摘要 背景和目的：中枢神经退行性疾病一直以来就是困扰着人类的一大类 疾病。其中，发病率最高的阿尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 幂n 帕 金森病( p a r k i n s o n sd i s e a s e ，p d ) 是危害中老年人身心健康的两种重要疾 病。近年来，随着全球人口老龄化的日益加剧，a d 的发病率呈逐年上升 的趋势，现己成为严重的社会问题。a d 的主要病理学改变有：大量神经 元纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，n f t s ) 、p 淀粉样蛋白( p - a m y l o i d p e p t i d e ，a d ) 沉积形成老年斑( s e n i l ep l a q u e s ，s p ) 以及弥漫性大脑萎缩。 患者出现认知功能减退和进行性记忆障碍。a d 的病因与发病机制目前尚 不清楚，近年来的研究表明中枢免疫功能异常与a d 发病密切相关。中枢 免疫异常主要表现为小胶质细胞过度活化，分泌大量的细胞毒性物质，如 细胞因子、氧自由基、一氧化氮、兴奋性氨基酸、花生四烯酸及其代谢产 物等，这些细胞毒性物质均参与了神经元的退变过程，因此能够抑制小胶 质细胞激活的药物有可能具有间接的神经保护作用。 雷公藤内酯醇( t f i p t o l i d e ，t 1 0 ) 是从中药雷公藤中提取的小分子单体 活性成分，具有免疫抑制和抗炎活性。有研究表明：t 1 0 对多巴胺能神经 元具有明显的保护作用，且t 1 0 的神经保护作用可能是通过抑制了小胶 质细胞激活所合成和释放的炎性物质来得以实现的。为探讨t 1 0 在a d 模 型上是否同样具有抗炎活性及神经保护作用，我们首先比较了不同浓度 a 1 3 1 - 4 2 作用不同时间后对小胶质细胞释放一氧化氮( n i t r o g e nm o n o x i d u m ， n o ) 的影响，以此为基础建立a d 炎症细胞模型，并在此模型上观察了 t 1 0 对小胶质细胞释放n o 及诱导型一氧化氮合酶( i n d u c i b l en i t r i co x i d e s y n t h a s e i n o s ) 蛋白表达的影响。另一方面，为进一步探讨t 1 0 对小胶 质细胞激活的抑制作用是否可以减轻a d 对神经元的损伤，我们用l o 。1 m l o mt 1 0 预处理小胶质细胞1 2 h ，然后加入1 0l x ma p l _ 4 2 共孵育1 2 h ， 将收获的条件培养基加入到海马神经元中，共同作用2 4 h ，观察t 1 0 预处 理的小胶质细胞条件培养基对原代海马神经元的存活率有何影响。 研究方法：用不同浓度a 1 3 ，_ 4 2 作用于小胶质细胞不同时间后，观察 中文摘要 a p l 抛对小胶质细胞释放n o 的影响，优化建立a d 炎症细胞模型。用 1 0 1 1 l o 堪mt 1 0 预孵育小胶质细胞1 2 h ，然后加入1 0g m a p l _ 4 2 共同作用 1 2 h ，观察t 1 0 对小胶质细胞释放n o ( g r i e s s 反应) 和i n o s 蛋白表达 ( w e s t e r nb l o t 法) 的影响。收获条件培养基，加入到原代培养的海马神 经元中，观察t 1 0 对海马神经元存活率( m t t 法) 的影响。 结果： 1a d 细胞模型的建立 用1 2 5 - ，2 0 9 ma p l - 4 2 作用于小胶质细胞0 2 4 h ，观察a p l _ 4 2 对小胶质 细胞合成和释放n o 的影响，发现： 1 1 低浓度( 1 2 5 - 一5 9 m ) 的a p l 4 2 对n o 的释放无明显影响；1 0 2 0 9 m a p l 4 2 可显著增加n o 的释放量。 1 21 0 9 ma p l - 4 2 处理细胞6 h 后，n o 的释放明显增加，呈时间依赖关系。 2t 1 0 拮抗a p l - 4 2 对小胶质细胞的激活 2 11 0 1 1 - 一1 0 培m 的t 1 0 均可抑制a p l 4 2 诱导小胶质细胞释放n o 。 2 21 0 。1 1 0 8 m 的t 1 0 均可抑制a p 卜4 2 诱导的小胶质细胞i n o s 表达增 加。 2 3 未经a p l 4 2 激活的小胶质细胞条件培养基不能引起海马神经元存活率 的下降，a p 。4 2 条件培养基可明显降低海马神经元的存活率，而t 1 0 预处 理小胶质细胞1 2 h ，可明显拮抗a p l 4 2 小胶质细胞条件培养基引起的海马 神经元存活率的降低。 结论： a p l - 4 2 在激活小胶质细胞介导a d 的炎症反应中起重要作用；t 1 0 可 通过抑制小胶质细胞n o 释放和i n o s 表达拮抗a p l 啦引起的海马神经元 存活率的降低，从而发挥其神经保护作用。 关键词：雷公藤内酯醇( t 1 0 ) ；神经保护；阿尔茨海默病( a d ) ；小 胶质细胞；诱导型一氧化氮合酶( i n o s ) ；一氧化氮( n o ) p e o p l e t h ei n c e p t i o nr a t eo fa d r i s e sy e a rb yy e a rw i t ht h ea g i n gl e v e lo f g l o b a lp o p u l a t i o ni n t e n s if y i n g a dh a sb e c o m eas e v e r es o c i a lp r o b l e m t h em a i np a t h o l o g i c a lc h a n g e so fa di n c l u d ep r o f o u n db r a i na t r o p h y , e x t r a c e l l u l a ra m y l o i dp l a q u e sa n di n t r a c e l l u l a rn e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s t h e m a i nc l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n so fa da r em e m o r yd e c l i n ea n dc o g n i t i v e i m p a i r m e n t t h ee t i o l o g y a n dp a t h o g e n e s i so fa di ss t i l lu n k n o w n h o w e v e r , r e c e n tr e s e a r c h e si n d i c a t et h a ta b n o r m a li m m u n ef u n c t i o no f c e n t e rh a sc l o s er e l a t i o n s h i pw i t ha d e x c e s s i v ea c t i v a t i o no fm i c r o g l i ai s t h em a i nd i s p l a yo fc e n t r a li m m u n ed i s f u c t i o n u p o na c t i v a t i o n ，m i c r o g l i a c a l lp r o d u c ead e v i lo fc y t o t o x i cm e d i a t o r s ，i n c l u d i n gp r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s ，r e a c t i v eo x y g e ni n t e r m e d i a t e s ，n i t r o g e nm o n o x i d u m ，e x c i t a t o r y a m i n oa c i d ，a n da r a c h i d o n i ca c i dd e r i v a t i v e s t h e s ec y t o t o x i c i t ym e d i a t o r s p a r t i c i p a t et h ed e g e n e r a t i o no fn e u r o n s t h e r e f o r e ，t h em e d i c i n et h a tc a r l i n h i b i tt h ea c t i v a t i o no fm i c r o g l i ah a st h ei n d i r e c tn e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t t h ee x t r a c to ft h ec h i n e s eh e r bt r i p t e r y g i u mw i l f o r d i ih o o kf ( t w h f ) h a sb e e nr e p o r t e dt ob ee f f e c t i v ei nt h et r e a t m e n to fav a r i e t yo f i n f l a m m a t o r ya n da u t o i m m u n ed i s e a s e s am a j o ra c t i v ec o m p o n e n to f t w h fi st h ed i t e r p e n o i dt r i e p o x i d en a m e dt r i p t o l i d e ( tio ) i tw a sr e p o r t e d t h a tt r i p t o l i d ei n h i b i t e di n f l a m m a t o r ys u b s t a n c e sr e l e a s ea n dp r o t e c t e d d o p a m i n e r g i c n e u r o n sf r o mt h e c y t o t o x i c i t ym e d i a t o r sp r o d u c e db y 英文摘要 m i c r o g l i a h o w e v e r , w h e t h e rt 10h a sa n t i - i n f l a m m a t o r yp o t e n t i a la n d n e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t si na d a r ep o o r l yu n d e r s t o o d i no u rs t u d y , u s i n gr a t m i c r o g l i ac u l t u r e s ，w ec o m p a r e dt h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o na n d a c t i o nt i m eo fa p l 4 2o nm i c r o g l i a ，e s t a b l i s h e da p a c t i v a t e dm i c r o g l i a lc e l l m o d e l b a s e do nt h i sm o d e l ，w ei n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t s o ft ioo n e x p r e s s i o no f i n o sa n dp r o d u c t i o no fn of r o mm i c r o g l i ac e l l s i na d d i t i o n ， w ee x p l o r e dw h e t h e rt h ei n h i b i t i o no ft 10t ot h ea c t i v em i c r o g l i ac o u l d l e s s e nt h ed i r e c t i n j u r yo fn e u r o n si n d u c e db ya p w ep r e i n c u b a t e d h i p p o c a m p u s n e u r o n sw i t ht10 一t r e a t e dm i c r o g l i ac o n d i t i o n e dm e d i u m ，a n d t h e na d d e da pl - 4 2 ，o b s e r v e d t h ee f f e c t so ft10 - t r e a t e d m i c r o g l i a c o n d i t i o n e dm e d i u mo nt h es u r v i v a lr a t eo fh i p p o c a m p u sn e u r o n s m e t h o d s ：u s i n gr a tm i c r o g l i ac u l t u r e s ，w ec o m p a r e dt h ee f f e c t so f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o na n da c t i o nt i m eo fa pl - 4 2o np r o d u c t i o no fn of r o m m i c r o g l i ac e l l s ，e s t a b l i s h e d a 1 3 一a c t i v a t e dm i c r o g l i a l c e l lm o d e l w e p r e i n c u b a t e dm i c r o g l i ac e l l sw i t h10 。lo 瑙m t10f o r12h o u r s ，t h e n a d d e d101 t ma 1 3l - 4 2i n c u b a t i n gf o r12h o u r st o g e t h e r , i n v e s t i g a t e dt h e e f f e c t so ft10o nt h ep r o d u c t i o no fn o ( g r i e s s r e a c t i o n ) a n de x p r e s s i o n o fi n o s( w e s t e r nb l o t ) f r o mm i c r o g l i a i na d d i t i o n ，w ec o l l e c t e d t10 t r e a t e dm i c r o g l i ac o n d i t i o n e dm e d i u ma n dj o i ni ti nt h eh i p p o c a m p u s n e u r o n sf o r2 4h o u r s ，d e t e c t e dt h ee f f e c t so ft 10o nt h es u r v i v a lr a t e ( m t t ) o f h i p p o c a m p u s n e u r o n s r e s u l t s ： 1e s t a b l i s h m e n to fa 1 l _ 4 2 - a e t i v a t e dm i c r o g l i ac e l lm o d e l r a tm i c r o g l i ac u l t u r e sw e r et r e a t e dw i t h1 2 5 一- 2 0 1 x ma j 1 - 4 2f o ro 2 4 h ，t h ee f f e c t so f a l 3 1 _ 4 2o nr e l e a s eo f n ow e r ed e t e c t e d 1 11 2 5 5 州a p l - 4 2t r e a t m e n td i dn o ta l t e rt h ep r o d u c t i o no fn of r o m m i c r o g l i ac e l l s ，10 - - - 2 0 p ma 1 3 l - 4 2c o u l do b v i o u s l yi n c r e a s et h ep r o d u c t i o n o fn of r o mm i c r o g l i a 4 英文摘要 1 2a f t e rt r e a t m e n tw i t h1 0 0 ma 1 3 1 - 4 2f o r6 h ，t h ep r o d u c t i o no fn of r o m m i c r o g l i at i m ed e p e n d e n ti n c r e a s e d 1 3t h ec e l lb o d i e so fm i c r o g l i ao nt h eq u i e s c e n tc o n d i t i o nw e r es m a l la n d g l o b u l a r a f t e rt r e a t m e n tw i t hlo l a ma p14 2f o r12 h ，t h ec e l lb o d i e so f m i c r o g l i ab e c a m eb i g g e r , a n ds t r e t c h e do u tm a n yp s e u d o p o d i al i k e a m o e b a 2i n h i b i t i o no ftlot ot h ea c t i v a t e dm i c r o g l i ac e l l s 2 110 。11 1o 8 mtiop r e t r e a t m e n ts i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h ep r o d u c t i o no f n of r o ma p 14 2 - i n d u c e dm i c r o g l i ac e l l s 2 210 1 1 - - - 10 8 mt 10p r e t r e a t m e n ts i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h ee x p r e s s i o no f i n o sf r o ma p i - 4 2 一i n d u c e dm i c r o g l i ac e l l s 2 3m i c r o g l i ac o n d i t i o n e dm e d i u mw i t h o u ta 1 3 1 4 2d i dn o ta l t e rt h es u r v i v a l r a t eo fh i p p o c a m p u s n e u r o n s a p l 4 2 一a c t i v a t e dm i c r o g l i ac o n d i t i o n e d m e d i u mo b v i o u s l yc u td o w nt h es u r v i v a lr a t eo fh i p p o c a m p u sn e u r o n s p r e t r e a t m e n to ft10f o r12h o u r sc o u l di n h i b i tt h ed e p r e s s i o no ft h e s u r v i v a lr a t eo f h i p p o c a m p u sn e u r o n si n d u c e db ya 1 314 2 一a c t i v a t e dm i c r o g l i a c o n d i t i o n e dm e d i u m c o n c l u s s i o n s ： t h ea b o v er e s u l t ss u g g e s tt h a ta 1 3 一i n d u c e dm i c r o g l i ac e l la c t i v a t i o n p l a y s f i n i m p o r t a n tr o l e i n m e d i a t i n gn e u r o i n f l a m m a t i o ni na d t 10 s i g n i f i c a n t l yi n h i b i tt h ed e p r e s s i o no ft h es u r v i v a lr a t eo fh i p p o c a m p u s n e u r o n si n d u c e db ya 1 3 1 4 2b yi n h i b i t i n gt h er e l e a s eo fn oa n dt h e e x p r e s s i o n o fi n o sf r o m m i c r o g l i a c e l l s t h u st10 m a y h a v e n e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t s k e yw o r d s ：t r i p t o l i d e ( tio ) ， m i c r o g l i ac e l l ，i n d u c i b l e n i t r i c m o n o x i d u mf n o ) n e u r o p r o t e c t i o n ，a l z h e i m e r sd i s e a s e ， o x i d e s y n t h a s e ( i n o s ) ，n i t r o g e n 5 英文缩写 英文缩写 英文缩写英文全名 a d p d n f t s a 1 3 s p t 1 0 n 0 i n o s m t t t w h f a p c d m e m p v d f p b s f c s d m s o p f a s d s a p s a l z h e i m e r sd i s e a s e p a r k i n s o n sd i s e a s e n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s p - a m y l o i dp e p t i d e s e n i l ep l a q u e s t r i p t o l i d e n i t r o g e nm o n o x i d u m i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e 3 - ( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z o l - 2 一y 1 ) - 2 ，5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e t r i p t e r y g i u mw i l f o r d i ih o o k f a m e r i c a np e p t i d ec o m p a n y d u l b e c c o 7 sm o d i f i e de a g l em e d i u m p o l y v i n y l i d e n ef l u o r i d e p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e f e t a lc a l fs e r u m d i m e t h y ls u l f o x i d e p o l y - f o r m a l d e h y d e s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e a m m o n i u m p e r s u l f a t e 中文名称 阿尔茨海默病 帕金森病 神经元纤维缠结 p 淀粉样蛋白 老年斑 雷公藤内酯醇 一氧化氮 诱导型一氧化氮合酶 四甲基偶氮唑兰 雷公藤田。厶，罚亭 美国多肽公司 培养基 聚偏二氟乙烯膜 磷酸盐缓冲液 胎牛血清 二甲基亚砜 多聚甲醛 十二烷基硫酸钠 过硫酸铵 6 t e m e d p m s f e d t a o d s e m a p p t n f i l r o s t b s t c n s 英文缩写 t e t r am e t h y le t h y l e n ed i a m i n en ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 p h e n y lm e t h a n es u l f o n y lf l u o r i d e 苯甲基磺酰胺 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 o p t i cd e n s i t y s t a n d a r de r r o r a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n t u m o rn e c r o s i sf a c t o r i n t e r l e u k i n r e a c t i v eo x i d es p e c i e s 嘶s b u f f e r e ds a l i n e c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m 光密度 标准误 淀粉样前体蛋白 肿瘤坏死因子 白细胞介素 活性氧自由基； ir i s 缓冲盐溶液 中枢神经系统 n m d a n m e t h y l d a s p a r t i ca c i dr e c e p t o r n 一甲基一d 一天冬氨酸受体 s p e r k p k n g f s e n i l ep l a q u e老年斑 e x t r a c e l l u l a rs i g n a l r e s p o n s ek i n a s e细胞外信号调节激酶 p r o t e i nk i n a s e n e r v eg r o w t hf a c t o r 蛋白激酶 神经生长因子 o n 0 0 。p e r o x y n i t r i t e ， 过氧化亚硝基 s a p p l t p l t d c g m p c a m p s o l u b i l i t ya m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n 可溶性淀粉样前体蛋白 l o n gt e r mp o t e n t i a t i o n l o n gt e r md e p r e s s i o n c y c l i cg u a n o s i n em o n o p h o s p h a t e c y c l i ca d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e m a p k m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e d a g l u d o p a m i n e g l u t a m a t e 长时程增强 长时程抑制 环磷酸鸟苷 环磷酸腺苷 有丝分裂原激活的蛋白激 酶 多巴胺 谷氨酸 7 英文缩写 8 研究论文 雷公藤内酯醇对小胶质细胞n 0 释放及in o s 表达的影响 j - 刖吾 中枢神经退行性疾病一直以来就是困扰着人类的一大类疾病。其中， 发病率最高的是a d 和p d ，严重危害中老年人的身心健康。近年来，随 着全球人口老龄化的日益加剧，a d 的发病率呈逐年上升的趋势，已成为 严重的社会问题。a d 的主要病理学改变有：大量n f t s 、a p 沉积形成s p 以及弥漫性大脑萎缩。患者出现认知功能减退和进行性记忆障碍。目前， a d 的病因与发病机制尚不清楚，临床上缺乏有效的治疗手段。近年的研 究表明中枢免疫功能异常与a d 的发病密切相关。在中枢神经系统退行性 疾病中，免疫异常主要表现为小胶质细胞的激活。小胶质细胞是中枢神经 系统中重要的免疫活性细胞，具有与外周巨噬细胞类似的吞噬功能，正常 时约占脑内细胞总数的1 0 左右。尸检证据显示，a d 病人大脑中除了有 神经元的变性坏死外，还存在大量激活的小胶质细胞以及表达上调的促炎 因子。小胶质细胞在损伤因素的刺激下过度活化，分泌大量的细胞毒性物 质，如细胞因子、氧自由基、一氧化氮、兴奋性氨基酸、花生四烯酸及其 代谢产物等，这些细胞毒性物质均参与了神经元的退变过程，因此能够抑 s u , j , 胶质细胞激活的药物有可能具有间接的神经保护作用。 雷公藤在我国已有上千年的药用历史，主要的药理活性为抗炎和免疫 抑制。雷公藤多甙是雷公藤抗炎、免疫抑制的有效成分，在治疗系统性红 斑狼疮、类风湿性关节炎等炎性、自身免疫性疾病方面已经取得了肯定疗 效。雷公藤内酯醇( t 1 0 ) 是从雷公藤中提取的小分子单体活性成分，其 主要药理活性为抗炎和免疫抑制，是雷公藤的主要抗炎成分之一，可通过 血脑屏障，并且脑是t 1 0 代谢的富集部位之一。因此t 1 0 在中枢神经系 统中也可能具有类似的抗炎活性。雷公藤对多巴胺能神经元具有明显的神 经保护作用，而且其神经保护作用可能是通过抑制脑内小胶质细胞异常活 化、减少炎性物质的释放得以实现的。其在a d 炎症细胞模型上是否同样 具有抗炎活性和神经保护作用，未见报道。 在本研究中，我们比较了1 2 5 - - - - 2 0 9 ma p l 4 2 作用0 - - 一2 4 h 后对小胶质 细胞释放n o 的影响，优化建立a d 炎症细胞模型，并在此模型上观察了 9 研究论文 t 1 0 对小胶质细胞释放n o 及i n o s 蛋白表达的影响。另一方面，我们用 1 0 。1m 1 0 嗡mt 1 0 预处理小胶质细胞1 2 h ，然后加入1 0g m a p l - 4 2 共孵 育1 2 h ，将收获的条件培养基加入到海马神经元中，共同作用2 4 h ，观察 t 1 0 预处理的小胶质细胞条件培养基对原代海马神经元存活率的影响，旨 在探讨t 1 0 对小胶质细胞激活的抑制作用是否可以减轻a p 对海马神经元 的损伤。 研究论文 材料和方法 1 材料： 1 1 实验动物： s d 孕鼠，s d 乳鼠( 2 4 h ) ，由承德医学院实验动物中心提供。 1 2 药物： a p l _ 4 2 ：美国多肽公司( a m e r i c a np e p t i d ec o m p a n y , a p c ) 产品。 雷公藤内酯醇( t 1 0 ) 结构( 见图1 ) ，由北京大学药学院屠鹏飞教授 提取，首都医科大学王晓民教授馈赠。 1 3 细胞培养用品： d m e m f 1 2 ( d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m ) 培养基、胎牛血清 ( f c s ) 、多聚赖氨酸( p o l y - d 1 y s i n e ) 、胰蛋白酶( t r y p s i n ) 、牛血清白蛋 白为s i g m a 公司产品；b 2 7 为g i b c o 公司产品；青霉素、链霉素为华 北制药厂产品。 1 4 生化指标检测所需试剂： 硫酸镍铵为f l u k a 公司产品；b c a 蛋白定量试剂盒、e c l 化学发 光试剂盒为美国p i e r c e 公司产品； 一抗：c d l l b 抗体( 滴度：1 ：4 0 0 ) 、m a p 2 抗体( 滴度：1 ：5 0 0 ) 均为 c h e m i c o n 公司产品； 一抗：i n o s 抗体( 滴度：l ：4 0 0 ) 、p - a c t i n 抗体( 滴度：1 ：2 0 0 0 ) 均 为s i g m a 公司产品； 二抗：h r p 标记的羊抗兔i g g 抗体( 滴度1 ：1 0 0 0 ) 购白中山公司； 免疫化学试剂盒：s p 9 0 0 1 ( 生物素标记羊抗兔i g g ) ，z y m e d 公司进 口分装，购自北京中山生物技术有限公司。 5 x l o a d i n gb u f f e r 为碧云天公司产品； m t t 、d a b 、t r i t o n x10 0 、过硫酸铵( a m m o n i u mp e r s u l f a t e ，a p s ) 、 t r i t o n x 1 0 0 e g t a 、甘氨酸、t w e e n 2 0 、n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺( t e t r a m e t h y le t h y l e n ed i a m i n e ，t e m e d ) 、n ，n 亚甲双丙烯酰胺、t r i s b a s e 、十 二烷基硫酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，s d s ) 、丙烯酰胺、苯甲基磺酰胺 ( p h e n y l m e t h y ls u l f o n y lf u l r i d e ，p m s f ) 、蛋白酶抑制剂的鸡尾酒配方 ( p r o t e a s ei n h i b i t o rc o c k t a i l ) 、蛋白m a r k e r 、二甲基亚砜( d m s o ) 为s i g m a 研究论文 公司产品； 显影液，定影液为天津市亨达公司感光材料厂产品； 乙醇、哈瑞氏苏木精染液、伊红染液( 0 5 ) 、二甲苯、多聚甲醛 ( p a r a f o r m a l d e h y d e ，p f a ) 、n a h c 0 3 、c a c l 2 、k h 2 p 0 4 、n a c l 、k c l 、 m g s 0 4 7 h 2 0 、n a 2 h p 0 4 h 2 0 、k h 2 p 0 4 、异丙醇、甘油等均为国产分析纯 ( a r ) ，购自北京化学试剂公司。 、 1 5 主要试剂的配制 1 5 1 细胞培养基及相关试剂的配制 d m e m f 1 2 培养液： d m e m f 1 2 干粉1 0 4 9 、n a h c 0 3 3 7 9 、超纯水8 0 0 m l ，用1 nh c l 或 1 nn a o h 调p h 为7 o 7 2 之间，定容至1 0 0 0m l ，0 2 2 9 m 微孔滤膜过 滤除菌，分装，2 0 保存备用。 f c s ： 5 6 c 水浴灭活补体3 0 m i n ，分装保存于2 0 备用。 5 6 n a h c 0 3 ： 称取n a h c 0 3 5 6 9 ，溶于l o o m l 超纯水中，0 2 2 9 m 微孔滤膜过滤除 菌，4 保存备用。 解剖液： k c l o 4 9 ， n a c l6 8 9 ，n a 2 h p 0 4 h 2 00 0 6 9 ，k h 2 p 0 40 0 6 9 ，蔗糖 7 5 9 ，葡萄糖3 0 9 ，h e p e s2 3 4 6 4 9 ，依次溶于1 0 0 0 m l 超纯水中。0 2 2 9 m 微孔滤膜过滤除菌，分装4 保存备用。 小胶质细胞培养液： d m e m f 一1 2 ( 1 ：1 ) ，1 0 胎牛血清，青霉素( 1 0 0 u m 1 ) 、链霉素( 1 0 0 9 9 m 1 ) 各1 。0 2 2 9 m 微孔滤膜过滤除菌，分装于4 保存备用。 h a n k s 液：1 0 倍原液配制法 原液a 液：称量n a c l8 0 0 9 ，k c l4 0 9 ，c a c l 21 4 9 ，m g s 0 4 7 h 2 02 o g ， 溶于4 5 0 m l 超纯水中，完全溶解后，定容至5 0 0 m l 。 原液b 液：称量n a 2 h p 0 4 h 2 00 6 0 9 ，k h 2 p 0 4o 6 0 9 ，葡萄糖 1 0 0 0 9 ，溶于4 5 0 m l 超纯水中，充分溶解后定容至5 0 0 m l 。 应用液：使用时取原液a 、b 各一份，超纯水稀释l o 倍，用5 6 n a h c 0 3 调p h 至7 0 一- 7 2 ，0 2 2 1 a m 微孔滤膜过滤除菌，分装于4 c 保存 1 2 研究论文 备用。 神经元细胞培养接种液： d m e m f 1 2 ，2 b 2 7 ，0 5 m ml 谷氨酰胺，2 5 州l 。谷氨酸，2 5 i t m2 巯基乙醇，l m m 丙酮酸钠，1 0 0 u m l 青霉素，1 0 0 u m l 链霉素。 神经元细胞培养饲养液： d m e m f 1 2 ，2 b 2 7 ，0 5 m ml 谷氨酰胺，2 5 i - t m2 巯基乙醇，l m m 丙酮酸钠，1 0 0 u m l 青霉素，1 0 0 u m l 链霉素。 多聚赖氨酸( p o l y d 1 y s i n e ) - 将p o l y d 1 y s i n e 液体用无菌超纯水稀释至终浓度为1 2 5 1 t g , m l ，分装 保存于2 0 备用。 0 0 2 e d t a 消化液： 称取0 0 2 9e d t a 于烧杯中，加入8 0 m l0 0 1 mp b s 中，充分溶解后定 容至1 0 0m l ，0 2 2 9 m 微孔滤膜过滤除菌，分装小瓶于2 0 冻存备用。 o 2 5 胰蛋白酶： 称取胰蛋白酶o 5 9 于烧杯中，用少许d h a n k s 液调成糊状，在补足 至5 0 m l ，搅拌均匀，置冰箱内过夜，并不时搅拌振荡，0 2 2 9 m 微孔滤膜 过滤除菌，分装小瓶于2 0 0 c 冻存备用。临用时将其用无菌d h a n k s 稀释 成1 ：4 ，即得到0 2 5 胰蛋白酶溶液。 p b s 缓冲液： 称取n a c l8 0 0 9 、k c l0 2 0 9 、n a 2 h p 0 4 h z o1 5 6 9 、k h 2 p 0 40 2 0 9 ， 依次溶于9 5 0 m l 超纯水中，然后用1 nh c l 或1 nn a o h 调p h 为7 0 - - 7 2 之间，定容至1 0 0 0 m l ，0 2 2 9 m 微孔滤膜过滤除菌，分装保存于4 。c 备 用。 1 0 。4 mt 1 0 的配制： 用天平精确称取t 1 00 0 0 18g ，缓缓加入5 0 0 p ld m s o 中，轻轻振荡 使t 1 0 充分溶解。加0 0 1 mp b s ，定容至5 0 m l ，即得1 0 4 mt 1 0 溶液， 用0 2 2 1 x m 微孔滤膜过滤除菌后，分装保存于2 0 。c 备用。 1 5 2 生化指标检测的相关试剂 0 0 1 mp b s ( p h 7 4 ) - 称取n a 2 h p 0 4 12 h 2 02 18 5 9 ，n a c l8 5 9 ，n a h 2