（免疫学专业论文）dock2对中性粒细胞凋亡和表达tlr4的影响.pdf

一 d o c k 2 对中性粒细胞凋亡和表达t l r 4 的影响 摘要 目的：中性粒细胞( p o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i l s ，p m n s ) 是 机体最重要的炎症细胞，它在机体固有性免疫应答中具有重要作用， 其胞浆内富含的细胞毒性物质既可杀伤外来入侵的病原微生物，也可 造成自身组织细胞的损伤。研究表明，中性粒细胞粘附、活化及凋亡 的整个过程可受t o l l 样受体( t o l l 1 i k er e c e p t o r s ，t l r s ) 的调节，促 成炎症反应的无损伤性收敛，使机体维持内环境的稳态。其中，t l r 4 是人们最早发现的能够直接介导机体与病原体反应的t o l l 样受体。 最近，日本科学家发现一种与中性粒细胞的趋化有关的蛋白d o c k 2 ( d e d i c a t o ro fc y t o k i n e s i s2 ) t l ，其聚集到中性粒细胞内朝着感染源 的一侧，使中性粒细胞改变自身形态，更高效地向感染源移动。本课 题主要探讨d o c k 2 与中性粒细胞凋亡的相关性以及d o c k 2 与中 性粒细胞上表达的t l r 4 之间的联系。这为今后更深入研究中性粒细 胞抗感染能力的机制提供了潜在的依据，也为临床上治疗炎症性相关 疾病提供了新的靶点。方法：抽取健康成人外周静脉血，f i c o l l 密度 梯度法分离、纯化中性粒细胞，并利用台盼蓝拒染试验、怀特姬姆 萨混合染色法鉴定细胞活力与纯度均达9 6 以上，按实验需求构建不 同的实验模型：实验组( d o c k 2 刺激组) 、阳性对照组( i l 1 1 3 刺 激组、t n f 0 【刺激组) 、阴性对照组( 空白组) 。运用光学显微镜观 察不同培养状态下的细胞形态；用流式细胞术检测不同组中性粒细胞 的凋亡率：通过反转录聚合酶链反应( r t p c r ) 技术检测t l r 4 m r n a 在各组中的表达情况；免疫印迹( w e s t e r nb l o t t i n g ) 技术检测 各组中t l r 4 的表达情况。结果：1 运用流式细胞术检测d o c k 2 对 p m n s 凋亡是否有影响，结果显示：与空白组比较，d o c k 2 组p m n 凋亡率是下降的，具有明显的差异性( 尸 o 0 5 ) 。2 r t p c r 技术检 测p m n s 在不同药物刺激组中t l r 4m r n a 的表达情况。结果显 示：同空白组相比，d o c k 2 组t l r 4m r n a 的表达上调，且有明显 的差异性( 尸 o 0 1 ) 。3 培养6h 后，将各组模型组中的中性粒细胞 裂解，提取总蛋白进行s d s p a g e 并相互比较。结果显示：在不同 刺激物刺激下，中性粒细胞上t l r 4 蛋白质表达的性质和数量发生了 不同程度的改变。4 不同实验组刺激p m n6h 后，提取蛋白并用 w e s t e r nb l o t t i n g 检测t l r 4 蛋白的表达。结果显示：同空白组相比， d o c k 2 组t l r 4 蛋白的表达是上调的，有明显的差异性( p 9 6 o nt h ew r i g h t g i e m s as t a i n ，a s d e t e r m i n e db yt r y p a nb l u ed y ee x c l u s i o n t h e r ea r ef o u re x p e r i m e n t a l m o d e lb u i l d i n g sa c c o r d i n gt oe x p e r i m e n t a ln e e d s ：t h ee x p e r i m e n t a lg r o u p d o c k 2 ( 1m g m l ) ，p o s i t i v e c o n t r o lg r o u pi l - 11 3 ( 10 0n g m l ) a n d t n f a ( 2 0n g m l ) ，n e g a t i v ec o n t r o lg r o u p o b s e r v ec e l lm o r p h o l o g yo f d i f f e r e n tc u l t u r e dc o n d i t i o n sb yo p t i c a lm i c r o s c o p e a p o p t o s i s o f n e u t r o p h i lw a s d e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r i ca n a l y s i s d e t e c tt l r 4m r n a e x p r e s s i o n o fd i f f e r e n tg r o u p sb yr t - p c r a n dd e t e c te x p r e s s i o no f t l r 4b yw e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t s ：1 f l o wc y t o m e t r ys u g g e s t e dt h a t a p o p t o s i s o fn e u t r o p h i lc u l t u r e dw i t hd o c k 2i sd o w n - r e g u l a t e d ， c o m p a r e dw i t ht h e c o n t r o l s 2 r t - p c ri m p l i e dt h a td o c k 2m a y b e u p r e g u l a t ee x p r e s s i o no f t l r 4m r n a ，c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l s ( 尸 o o1 ) 3 w e s t e r nb l o t t i n gs h o w e dt h a tt l r 4p r o t e i ne x p r e s s i o n i s p o s s i b l yu p r e g u l a t e db yd o c k 2 ，c o m p a r e d w i t ht h ec o n t r o l s ( 户 6 3 0n m ) 。 2 3 r t - p c r 检测t l r 4m r n a 的表达 2 3 1总r n a 的提取 在预定时间收获l 1 0 6 个中性粒细胞，1 , 5 0 0r p m 5r a i n 离心， 弃上清，各组加入lm l 裂解液r z ；4 。c1 2 ，0 0 0r p m 5m i n 离心，取 上清，转入新的无r n a s e 的离心管中；加入2 0 0g l 氯仿，盖好管盖， 剧烈振荡15s ，室温放置3m i n ；4 。c1 2 ，0 0 0r p m 10m i n 离心，样品 l l 分成3 层( r n a 在水相层) ，把水相转入新管中；缓慢加入o 5 倍体 积无水乙醇并混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱c r 3 中，4 1 2 ，0 0 0r p m 3 0s 离心，弃掉收集管中的废液；向吸附柱c r 3 中加入 5 0 0u l 去蛋白液，4 1 2 ，0 0 0r p m 3 0s 离心弃废液；向吸附柱c r 3 中加入7 0 0 “l 漂沈液，室温静置2m i n ，4 c1 2 ，0 0 0r p m 3 0s 弃废液； 向吸附柱c r 3 中加入5 0 0 “l 漂沈液，室温静置2m i n ，4 。c1 2 ，0 0 0r p m 3 0s 离心去除残余液体；将吸附柱放入2m l 收集管中，4 。c1 2 ，0 0 0 r p m 2m i n 离心，去除残余液体；将吸附柱c r 3 转入一个新的离心 管中，加5 0 “lr n a s e f r e ed d h 2 0 ，室温放置2 分钟，4 1 2 ，0 0 0r p m 2m i n 离心。取5 “ir n a 溶液，以双蒸水为空白对照，在紫外凝胶 成像分析仪上测定2 6 0n i l ( a 2 6 0 ) 和2 8 0h i 1 ( a 2 8 0 ) 的吸光度值， 进行r n a 含量测定和a 2 6 0 a 2 8 0 的比值分析。样品中r n a 的浓度 和纯度的计算如下：r n a 浓度( i t g m 1 ) = 4 0 a 2 6 0 稀释倍数； r n a 纯度= a 2 6 0 a 2 8 0 2 1 0 0 ，比值在1 8 2 0 之间方可用。并 用琼脂糖凝胶检测r n a 完整性或立即反转录。 2 3 2 反转录反应 以从不同状态培养的中性粒细胞中提取的总r n a 为模板，在 p c r 仪上进行反转录。在2 0 扯l 的反应体系中含有：m g c l 2 4 山，1 0 r tb u f f e r2 “l ，r n a s ef r e eh 2 07 5 p l ，d n t pm i x t u r e2 “l ，r n a s e i n h i b i t o ro 5 肛l ，a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e ，r a n d o m9m e r s 各1p i ， 样本r n a2 肛l 。r t 反应条件为：3 0 1 0m i n i 4 2 。c2 0m i n ：9 9 5m i n i 5 5m i n 。 2 3 3 引物的设计 。 t l r 4 和g a p d h 的引物均来源于n c b i 数据库，运用p r i m e r 5 0 软件二级结构评分参数检查引物是否符合条件。引物序列如下： 。i l r 4 ： 上游：a g a g t tt c ct g c a a t g g a t c a a g ： 下游：t t a t c t g a a g g t g t t g c a c a t t c c ； 目的扩增产物长度：8 2b p g a p d h ： 上游：a t g c t g g c g c t g a g t a c g t c ； 下游：g g t c a t g a g t c c t t c c a c g a t a ； 目的扩增产物长度：2 6 3b p 2 3 4p c r 扩增 以反转录生成的c d n a 为模板，以人工合成的寡核苷酸为引物， 在p c r 仪上进行p c r 扩增。在5 0p l 的反应体系中含有：5 p c r b u f f e r1 0 t l ，灭菌蒸馏水2 8 7 5g l ，t a k a r ae x t a qh so 2 5l a l ，上下游 引物各o 5 l ，模板c d n a1 0g l 。p c r 反应条件为：轻轻混匀后，4 1 , 5 0 0r p m 1 5s 离心，将管壁液体收到管底。将e p 管置于p c r 仪内， 关盖，启动p c r 仪，设置相应程序如下：预变性9 5 ，4m i n ；变性 9 4 ，3 0s ：引物退火：5 5 4 ，3 0s ；延伸7 2 ，3 0s ；循环次数 4 0 次；最终延伸步骤7 2 ，5m i n ；保存温度为4 。c 。 2 3 5r n a 琼脂糖凝胶电泳及图像分析 用t b e 电泳缓冲液灌注电泳槽，制胶( 浓度为3 ) ，插上样品 梳，冷凝后将其拔出。将制好的胶置入电泳槽内对应位置，l o 肚l 样 品+ 2p l 电泳上样缓冲液混匀( 6 ) 分别点样于凝胶孔中，以5 0 0b p l a d d e r 核酸分子m a r k e r 进行对照。接通电源，启动电泳仪，恒压 1 0 0v ，电泳3 0m i n 后结束。琼脂糖凝胶于紫外凝胶成像仪上观察， 照相。采用凝胶定量软件q u a n t i t y - o n e ( b i o - r a d ) 分析系统检测 r t - p c r 扩增产物电泳条带的吸光度值。所有吸光度值均在相同光学 条件下完成。 2 3 6 统计学处理 所有结果均取自一次代表性实验，并被3 次独立实验所证实。 结果以x4 - s 来表示，两个样本均数比较采用f 检验，多个样本比较 用方差分析，p o 0 1 被认为具有统计学意义，统计软件为s p s s1 7 0 f o rw i n d o w s 。 2 4 蛋白印迹实验检测蛋白t l r 4 的表达差异 2 4 1 抽提中性粒细胞总蛋白 按预定时间，离心收集分组培养的中性粒细胞( 1x1 0 6 j ：l ) 。加 入m p e r 细胞裂解液裂解细胞获得总蛋白溶液( 按说明手册进行) 。 加入m p e r 细胞裂解液( 1m l 1 0 0m g 细胞) 及蛋白酶抑制剂p m s f ( 2 0 0 “l m l ) 。冰盒置摇床上裂解3 0m i n ( 并且间隔十分钟震动一 次) ，1 4 ，0 0 0r p mx1 5m i n 离心，去除细胞碎片。收集上清，用b r a d f o r d 法测定蛋白含量，并加l o a d d i n gb u f f e r ( 5 ：1 ) 沸水煮沸3 5m i n ， - 8 0 保存或2 0 保存或进一步分析。 2 4 2s d s p a g e 电泳 组装电泳模具，配制8 分离胶，迅速灌注，留出灌注浓缩胶 的空间，水封，室温放置3 0m i n 待胶凝固；倾出水，用滤纸小心擦 干；配制5 浓缩胶，上层直接灌注浓缩胶；立即在胶中插入梳子， 室温放置4 0m i n i 待胶凝固后，小心移出梳子，立即用电泳缓冲液洗 涤加样孔，电泳槽中加入电泳缓冲液；按预定顺序加样，每样品加 5 0 肛g 蛋白孔；对照孔加蛋白质分子量m a r k e r ；将电泳装置与电源相 接，所加电压为1 2 0v ，当染料前沿进入分离胶后，电压调为1 5 0v ， 继续电泳至目的条带和内参条带分离清楚，关闭电源；倾去电泳缓冲 液，卸下玻璃板，取出凝胶；分别转膜或考马斯亮蓝染色，凝胶拍照。 2 4 3半干转膜及免疫反应 制作转膜三明治，半干式电转移法将蛋白转移至p v d f 膜；室温 下5 脱脂奶粉封闭p v d f 膜lh ：再将目的蛋白部分与内参部分的 膜剪开分别操作：目的蛋白膜：1 ：1 0 0 0 稀释鼠抗人t l r 4 单克隆抗体 室温下孵育4 。c 冰箱过夜，t b s t 缓冲液洗膜7m i n 3 次；内参膜： l ：1 0 0 0h i 冲标记的1 3 - a c t i n 单克隆抗体育膜1h ，t b s t 缓冲液洗膜7 m i n 3 次；再分别用1 ：1 0 0 0 稀释山羊抗小鼠二抗室温下孵育lh ， t b s t 缓冲液沈膜7m i n 3 次：以上育膜过程均摇床振荡。 ， 2 4 。4 化学发光及条带分析 于暗室内新鲜配置化学发光底物反应液( a 液和b 液各5 0 0l a l 混匀) ，将p v d f 膜置于反应液中反应5m i n ；取出膜，吸去多余液体， 置于洁净小塑料袋中：于荧光化学发光图像分析仪中进行曝光，分别 曝光3 0s 、1m i n 、5m i n 、1 0m i n 。采用q u a n t i t y o n e 分析系统检测蛋 白条带的平均密度值，将目的条带与内参条带的灰度比值作为参考依 据，分析目的蛋白相对表达量。所有密度值均在相同条件下检测完成。 2 4 5 统计学处理 所有结果均取自一次代表性实验，结果被3 次独立实验所证实， 中性粒细胞来源于不同的健康志愿者。计量资料以均数4 - 标准差表示， 两个样本均数比较采用f 检验，多个样本比较用方差分析，p o 0 5 有统计学意义，统计软件为s p s s1 7 0f o rw i n d o w s 。 l s 实验流程图( e x p e r i m e n t a lp r o t o c 0 1 ) 台盼兰拒染试验、怀特姬姆萨混合 染色法鉴定中性粒细胞活力与纯度 结果 1新鲜分离中性粒细胞活性纯度鉴定 f i c o l l 法新鲜分离的中性粒细胞接种于2 4 孔板中，直接倒置光学 显微镜下观察，细胞透明，有立体感和遮光感，活性好( 图1 a ) ； w r i g h t g i e m s a 混合染色后可见细胞绝大多数为3 4 页核的中性粒 细胞，纯度高( 图1 b ) 。符合后续研究对细胞质量的要求。 b 山厶 0 n 一一p 。 一一6 一 譬o - 。 口 厶 夺 图1 光镜下观察新鲜分离的中性粒细胞 f i g 1 o b s e r v a t i o no ff r e s hn e u t r o p h i l sb yl i g h tm i c r o s c o p e n o t e ：a 雠s hp m nw i t h o u td y e i n g , 4 0 0 ；b f r e s hp m n + w r i g h t - g i e m s ad y e i n g , 1 , 0 0 0 2 流式细胞术检测中性粒细胞凋亡率 应用流式细胞术对d o c k 2 ( 1m g m l ) 组、i l - 1 1 3 ( 1 0 0n g m l ) 组、 n 盯仅( 2 0n g m l ) 组和空白对照组对中性粒细胞( 2 1 0 6 ) 的凋亡进 行比较。结果显示：加d o c k 2 、i l 1 p 、，n 盯a 和空白组培养中性粒 细胞6h 后，空白组即中性粒细胞自发性凋亡率为9 5 7 ( 图2 a ) ，与 空白组相比，d o c k 2 组和i l 一1 1 3 组中性粒细胞的凋亡率降低的 ( 6 8 6 ，图2 b 、7 3 8 ，图2 c ) ，t n f q 组中性粒细胞的凋亡率升高 的( 3 5 2 ，图2 d ) ，提示d o c k 2 可能延迟人中性粒细胞的生命周期。 图2流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡率 f i g 2 a p o p t o s i s o fp m n b yf l o wc y t o m e t r y n o t e ：a m e d i u ma l o n e ，b d o c k 2 ，c m - l p ，d t n f a p o 0 5c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l s 3 琼脂糖电泳检测r n a 完整性 加d o c k 2 、i l l p 、t n f a 和空白组培养中性粒细胞6h 后，用总 r n a 提取试剂盒提取中性粒细胞总r n a 。琼脂糖凝胶电泳结果可见到 2 8s 和1 8s 亚基清晰显示，2 8s 与1 8s 的带宽比在1 8 2 0 之间， 说明r n a 完整性良好，满足后续实验要求。( 图3 ) l234 图3 中性粒细胞总r n a 琼脂糖凝胶电泳图谱 f i g 3a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i so fr n af r a g m e n t n o t e ：1 m e d i u ma l o n e ，2 d o c k 2 ，3 几一1 p ，4 t n f - 屯t 4r t - p c r 检测t l r 4 基因表达 空白组和d o c k 2 ( 1m g m l ) 、i l 一1 1 3 ( 1 0 0n g m l ) 、t n f q ( 2 0 n g m l ) 分别刺激中性粒细胞( 2 1 0 6 m l ) 6h 后，提取总r n a 用r t - p c r 检测t l r 4m r n a ( 8 2b p ) 的表达，以t l r 4m r n a 与内参g a p d h 的灰度值反映t l r 4m r n a 的表达量。结果显示：同空白组相比， d o c k 2 组和i l 1 p 组t l r 4m r n a 的表达增加；t n f a 组t l r 4 m r n a 的表达则明显降低( 尸 0 0 1 ) 。提示d o c k 2 可能对人中性粒 细胞上t l r 4m r n a 的表达有上调作用。( 注：d o c k 2 组与空白组、 一一一 一 一 一 8 8 5 ， 1 i l 1 p 组及n 旺a 组分别运用s p s s 软件进行统计分析，结果尸值均为 0 0 0 0 ) 。( 图4 ) ml2345678 a 5 s d s p a g e 检测中性粒细胞内t l r 4 蛋白表达 d o c k 2 ( 1 m m l ) 、t n f 一仅( 2 0n g m l ) 、i l 一1 8 ( 1 0 0n g m l ) 分 别刺激中性粒细胞( 2 1 0 6 m l ) 6h 后，通过8 s d s p a g e 观察各 组蛋白质的表达情况。结果显示：同空白组相比，各刺激组蛋白谱均发 生不同程度的改变，进一步说明d o c k 2 作用于中性粒细胞后t l r 4 蛋 白的性质和数量产生了变化。( 图6 ) 9 5 k d 5 5 l 4 3 k d m1234 ，_ 簟_93l(d p q 一42kd h 一_ i 一 图6p m n 在不同药物刺激下蛋白表达的s d s - p a g e f i g 6 s d s - p a g ea n a l y s i so fn e u t r o p h i l s n o t e ：1 m e d i u ma l o n e ，2 d o c k 2 ，3 ，l b ，4 t n f a m m a r k e r 6w e s t e r nb l o t t i n g 检测中性粒细胞内t l r 4 蛋白的表达 d o c k 2 ( 1 m g m l ) 、t n v a ( 2 0n g m l ) 、i l 一1 p ( 1 0 0n g m l ) 分 别刺激中性粒细胞( 2 1 0 6 m l ) 6h 后，提取蛋白用w e s t e r nb l o t t i n g 检测t l r 4 蛋白( 9 3k d ) 的表达，以t l r 4 与内参1 3 - a c t i n 的灰度值 反映t l r 4 的表达量。结果显示：同空白组相比，d o c k 2 组和i l 1 d 组t l r 4 的表达增加；t n f a 组t l r 4 的表达明显降低( p o 0 1 ) 。 进一步说明d o c k 2 对中性粒细胞上t l r 4 的表达具有上调作用。 ( 注：d o c k 2 组与空白组、i l 1 p 组及n 盯a 组分别运用s p s s 软件 进行统计分析，结果尸值均为0 0 0 0 ) 。( 图7 ) l234 i $ - a c t i n 一- 一i 譬f 。一- 一 0 8 0 7 0 6 0 5 t l r 4 - 棚 a i 厕 t i v e 讨论 本研究从中性粒细胞光镜形态学、流式细胞术分析中性粒细胞的 凋亡、r t - p c r 分析中性粒细胞上t l r 4m r n a 的表达、w e s t e r n b l o t t i n g 分析中性粒细胞上t l r 4 蛋白的表达等方面探讨d o c k 2 与 中性粒细胞凋亡的相关性以及d o c k 2 与中性粒细胞上表达的t l r 4 之间的联系。 凋亡是基因控制下的细胞程序化死亡，其病理学特征表现为核固 缩、胞质空泡、胞膜皱折和d n a 片断化，它的发生是基因调控、细 胞识别和信号传递的综合结果，是一种主动性的细胞自杀过程。这一 过程同胚胎发育、肿瘤、免疫应答和炎症的发生、发展及转化有着密 切的关系1 7 】。中性粒细胞是终末分化细胞，一旦分化成熟便启动其自 发性程序凋亡，之后被巨噬细胞所吞噬，这是聚集在组织中的中性粒 细胞消除的主要途径。中性粒细胞除了自发性凋亡外，还可在多种外 界冈素的作用下，发生凋亡的加速或延迟。本实验以分离提纯的中性 粒细胞为标本，d o c k 2 作用于中性粒细胞6h 后，运用流式细胞仪 a n n e x i nv f i t c p i 双参数法检测中性粒细胞的凋亡率，并同时以 i l 1 p 组和t n f 仅组作为阳性对照，空白组作为阴性对照。结果显 示：未经处理的中性粒细胞自发性凋亡率为9 5 7 ，同对照组相比， d o c k 2 是抑制中性粒凋亡的，两者之间比较有明显差异性( 尸 0 0 5 ) 。i l 1p 和t n f q 分别是抑制与促进中性粒细胞的凋亡，与 国外文献报道的研究结果相吻合1 1 8 1 。 f u k a t a 等研究发现，中性粒细胞的激活、活化和趋化整个过程可 受t l r s 的调控1 1 9 】。其中，t l i 是深受人们高度关注的一个成员， 已经研究表明t l r 4 与诸多疾病关系密切1 9 l 。我们将d o c k 2 作用于 中性粒细胞后运用r t - p c r 来检测中性粒细胞上t l r 4m r n a 的表 达。结果显示：同对照组相比，d o c k 2 可以上调t l r 4m r n a 的表 达，两组之间比较有明显的差异性( 户 0 0 1 ) ，i l 1 b 组和t n f 0 【 组对t l r 4 的作用分别是上调和下调的，这与其他人员研究结果相符 厶1 2 0 2 1 1 口 。 在上述基因水平研究的基础上，我们再从蛋白水平运用w e s t e r n b l o t t i n g 技术检测d o c k 2 对t l r 4 蛋白的表达是否影响。结果表明， t l r 4 蛋白的变化趋势与t l rm r n a 的变化趋势相一致，且与对照 组相比，具有明显差异性( 尸 o 0 1 ) 。 通过上述基因和蛋白不同水平的检测，我们可以推测，d o c k 2 可能上调人中性粒细胞上t l r 4 的表达。然而，至于结果的可靠性本 实验还未能确定。首先，d o c k 2 可能会延迟p m n 的凋亡。但在此 基础上，因p m n 本身的数量增加，会间接导致t l r 4 的表达上调。 其次，t l r 不仅可以识别病原微生物，还可识别非微生物和一些 “非己成分 。因此，有可能是d o c k 2 作用于中性粒细胞后，因p m n 发生趋化运动被t l r 4 识别而激活上调t l r 4 。再次，d o c k 2 可能 会延迟p m n 的凋亡，也可能上调t l r 4 的表达。前文已述，p m n 的 粘附、活化、趋化的整个过程可受t l r 的调节【7 1 。那么我们可以推 测，t l r 4 对p m n 的凋亡起抑制作用。最后，d o c k 2 可能抑制 p m n 的凋亡，同时可能引起t l r 4 表达的上调。但前者下降和后者 上调之间是否存在一定的量的关系，本实验还无法确定，有待下一步 进行探讨。 综上所述，p m n s 和t l r s 都如同双刃剑，只有适度激活才能在 有效抵御外界病原微生物的同时避免自身组织的损伤。但如何使其适 度激活仍是一个难题。中性粒细胞、t l r s 与d o c k 2 之间有可能如 同信号转导通路一样构成复杂的网络，互相影响互相制约并共同维持 机体的平衡。但其具体的途径与机制如何，还需进一步深入探讨。下 一步我们将d o c k 2 作用于中性粒细胞，运用电镜、激光共聚焦显 微镜从观察中性粒细胞吞噬、趋化运动的整个过程入手，观察p m 漪。一 具体发生什么变化：运用实时定量p c r 技术检测d o c k 2 引起 p m n 凋亡抑制与t l r 4 表达上调之间是否存在着一定的量的关系： 同时结合信号转导通路的抑制剂，检测转导通路上下游分子的表达是 否发生改变，并借助二向电泳和质谱分析筛选出差异表达蛋白，探索 影响中性粒细胞凋亡和t l r s 表达的关键点所在；而且我们要采取 不同的时间段对上述内容进行探讨，可能随着中性粒细胞自然凋亡时 间的推移，对目前尚未清楚的内容会有更好的解释，或者会有新的发 现。 上述问题的解决，不仅为重新认识中性粒细胞凋亡和t l r s 的激 活开拓了新思路，而且为临床上治疗和预防炎症相关性疾病、自身免 疫性疾病、移植排斥反应以及肿瘤等疾病提供实验室依据和理论学基 石出。 结论 1 d o c k 2 可能对p m n 的凋亡有延迟作用。 2 d o c k 2 可能对t l i 的表达有上调作用。 3 t l r 4 可能抑制p m n 的凋亡。 4 d o c k 2 延迟p m n 凋亡的同时上调t l r 4 的表达。但也可能前 者引起后者，或者后者引起前者。并且，二者变化的量之间可能 存在一定的关系。 参考文献 1k u n i s a k izn i s h i k i m ia ，t a n a k a 髟e ta l 。d o c k 2i sar a ca c t i v a t o r t h a tr e g u l a t e sm o t i l i t ya n dp o l a r i t yd u r i n gn e u t r o p h i lc h e m o t a x i s 【j 】j c e l lb i o l ，2 0 0 6 ，1 7 4 ( 5 ) ：6 4 7 - 6 5 2 2e l b i mc ，e s t a q u i e rj c y t o k i n e sm o d u l a t en e u t r o p h i ld e a t h 【j 】e u r c y t o k i n en e t w , 2 0 1 0 ，2 l ( 1 ) ：1 - 6 3k o r o b o w i c z a b i o l o g y o ft u m o rn e c r o s i sf a c t o r t y p ea l p h a ( t n f a l p h a ) 【j 】p o lm e r k u rl e k a r s k i ，2 0 0 6 ，2 1 ( 1 2 4 ) ：3 5 8 - 3 6 1 4f o xs ，l e i t c ha e ，d u f f i nr ，e ta 1 r o s s ia g n e u t r o p h i la p o p t o s i s ： r e l e v a n c et ot h ei n n a t ei m m u n er e s p o n s ea n di n f l a m m a t o r yd i s e a s e j ji n n a t ei m m u n ，2 010 ，2 ( 3 ) ：216 - 2 2 7 5 e 1 - d e i r yw s t a r g e t i n gm u t a n tp 53s h o w sp r o m i s ef o rs u n s c r e e n sa n d s k i nc a n c e r j 】jc l i ni n v e s t ，2 0 0 7 ，117 ( 1 2 ) ：3 6 5 8 3 6 6 0 6n e t e am gs i m o na ，v a nd ev e e r d o n kf e ta 1 i l - lb e t ap r o c e s s i n gi n h o s td e f e n s e ：b e y o n dt h ei n f l a m m a s o m e s 【j 】p l o sp a t h o g ，2 010 ， 6 ( 2 ) ：e l0 0 0 6 6 1 7j a n s s e n s s ，b e y a e r tr r o l eo ft o l l l i k er e c e p t o r s i n p a t h o g e n r e c o g n i t i o n j c l i nm i c r o b i o lr e v , 2 0 0 3 ，16 ( 4 ) ：6 3 7 6 4 6 8m i t r o u l i s i ，k o u r t z e l i si ，k a m b a sk ，e ta 1 r e g u l a t i o no ft h e a u t o p h a g i cm a c h i n e r yi nh u m a nn e u t r o p h i l s j 】e u rji m m u n o l ，2 0 10 f e b16 e p u ba h e a do fp r i n t 】 9c o u t i n h oa ，p o l t o r a c ka i n n a t ei m m u n i t y ：f r o ml y m p h o c y t em i t o g e n t t ot o l l l i k e r e c e p t o r s a n db a c k j 】c u r ro p i ni m m u n o l ，2 0 0 3 ， 15 ( 6 ) ：5 9 9 6 0 2 10v a n d e w a l l ea t o l l - l i k er e c e p t o r sa n dr e n a lb a c t e r i a li n f e c t i o n s j 】 c h a n gg u n gm e dj ，2 0 0 8 ，31 ( 6 ) ：5 2 5 5 3 7 11l o i a r r om ，r u g g i e r ova n ds e t t ec t a r g e t i n gt l r i l 一1rs i g n a l l i n g i nh u m a nd i s e a s e s 【j 】m e d i a t o r si n f l a m m ，2 0 1 0 ，2 0 1 0 ：6 7 4 3 6 3 e p u b 2 0 10a p r8 12v a nb r u g g e nr ，d r e w n i a ka ，t o o la t , e ta 1 t o l l l i k er e c e p t o r r e s p o n s e si ni r a k 一4 一d e f i c i e n tn e u t r o p h i l s 【j 】ji n n a t ei m m u n ，2 0 10 ， 2 ( 3 ) ：2 8 0 2 8 7 e p u b2 0 0 9d e c16 13p o l t o r a ka ，x i a l o n gh ，s m i m o v o li ，e ta 1 d e f e c t i v el p ss i g n a l i n gi n c 3h h e ja n dc 5 7 b l 10 s c c rm i c e ：m u t a t i o n si nt l r sg e n e j 】 s c i e n c e ，1 9 9 8 ，2 8 2 ( 5 3 9 6 ) ：2 0 8 5 2 0 8 8 14t s a nm f , g a ob h e a ts h o c kp r o t e i n sa n di m m u n es y s t e m 【j 】j l e u k o cb i o l ，2 0 0 9 ，8 5 ( 6 ) ：9 0 5 9l0 15b a n e r j e ep b i s w a saa n db i s w a st p o r i n - i n c o r p o r a t e dl i p o s o m e i n d u c e st o l l 1 i k er e c e p t o r s2 - a n d6 - d e p e n d e n tm a t u r a t i o na n dt y p e1 r e s p o n s eo f d e n d r i t i cc e l l j 】i n ti m m u n o l ，2 0 0 8 ，2 0 ( 1 2 ) ：1 5 5 1 - 1 5 6 3 16k a w a it ，a k i r as t h er o l eo fp a t t e r n r e c o g n i t i o nr e c e p t o r si ni n n a t e i m m u n i t y ：u p d a t e o nt o l l - l i k er e c e p t o r s j 】n a ti m m u n o l ，2 010 ， 11 ( 5 ) ：3 7 3 - 3 8 4 1 7 刘佳佳，羊建，何浩，等一种中性粒细胞新型死亡形式的探索 j 】中 国药物与临床，2 0 0 5 ，5 ( 3 ) ：1 6 5 1 6 7 18a l l e n b a c h c ，z u f f e r e yc ，p e r e zc ，e t a 1 t a c c h i n i c o t t i e r f m a c r o p h a g e si n d u c en e u t r o p h i la p o p t o s i st h r o u g hm e m b r a n et n fa p r o c e s sa m p l i f i e db yl e i s h m a n i am a j o r j 】ji m m u n o l ，2 0 0 6 ， 17 6 ( 11 ) ：6 6 5 6 6 6 6 4 19f u k a t am ，v a m a d e v a na sa n da b r e um t t o l l - l i k er e c e p t o r s ( t l r s ) a n dn o d - l i k er e c e p t o r s ( n l r s ) i ni n f l a m m a t o r yd i s o r d e r s j s e m i n i m m u n o l ，2 0 0 9 ，21 ( 4 ) ：2 4 2 - 2 5 3 2 0k l e i nk l o u w e n b e r gp ，t a nl ，w e r k m a nw ：e ta 1 t h er o l eo ft o l l - l i k e r e c e p t o r s i n m g u l a t i n gt h ei m m u n er e s p o n s ea g a i ns t r e s p i r a t o r y s y n c y t i a lv i r u s j 】c r i tr e v l m m u n o l ，2 0 0 9 ，2 9 ( 6 ) ：5 3l - 5 5 0 21m a r o s om ，b a l o s s os ，r a v i z z at e ta 1 t o l l - l i k er e c e p t o r4a n d h i g h - m o b i li t yg r o u pb o x - 1a r ei n v o l v e di n i c t o g e n e s i sa n dc a nb e t a r g e t e dt or e d u c es e i z u r e s j 】n a tm e d ，2 0 10 ，16 ( 4 ) ：413 - 419 英文缩写 p m n t l r p r r p a m p i l 1 r l p s t n f 0 【 d o c k 2 t i r 英汉缩略词对照表 英文全称 p o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i l s t o l l - l i k er e c e p t o r p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r 中文译名 中性粒细胞 t o l l 样受体 模式识别受体 p a t h o g e n a s s o c i a t e d m o l e c u l a r 病原体相关分子模式 p a t t e r n s ，p a m p i l 一1r e c e p t o r l i p o p o l y s a c c h a r i d e 自细胞介素1 受体 脂多糖 t u m o rn e c r o s i sf a c t o ra l p h a0 【型肿瘤坏死因子 d e d i c a t o ro fc y t o k i n e s i s2 t l r i l rl h o m o l o g o u sr e g i o n t i r 结构区 c h a 逆转录一聚合酶链式 反应 c r y l 十二烷基硫酸钠聚丙 烯酰胺凝胶电泳 苯甲基磺