（蔬菜学专业论文）蛹虫草继代培养中表型多样性与产量的关系研究.pdf

沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本研究采用l o 株蛹虫草( c o 哟捌芦m 讲蛔妇，组织分离株在p d a 培养基上进行1 5 次继 代培养获得不同表型的菌落，通过对不同表型菌落生长速度的测定、产量的测定，无性 型产孢结构的观察、同工酶酶谱的研究，来探讨继代培养中菌落表型变化与子实体产量 的关系。旨在为蛹虫草生产提供理论和实践依据。主要结果如下： ( 1 ) 在继代培养中，蛹虫草菌落可产生角变现象，将角变区菌丝分离培养，依据菌落有 无角变、菌落颜色、菌丝气生性等性状，可将继代培养分离的菌落分为5 种类型。5 种菌 落类型在1 5 代继代培养中的分布规律是，i 、i i 型菌落在继代培养卜1 5 代都可出现，但 角变频率高、角交面积大的角变菌落主要分布在继代培养的3 7 代。、v 型分布 在继代的最前和最后几代。不同类型菌落的子实体产量不同，i 、i i 、型菌落可形成 子实体，其中i 型菌落子实体产量最高。、型次之。和v 型无子实体形成能力。 角变频率和角变面积与子实体形成的关系是，角变频率和角变面积较大的菌株子实体形 成能力强。出发菌株的菌落形态不同，出发菌株子实体产量亦有区别。菌落黄色、菌丝 气生性中等的茵落易形成子实体。菌落白色或黄色、菌丝气性强的菌落不能形成子实体。 出发菌株菌落形态决定角变类型及分布。菌落形态为白色菌丝强气生出发菌株，在继代 培养的前几代以型角变类型为主；而茵落形态为黄色菌丝气生性中的出发菌株，在继 代培养的前几代以i 型角变类型为主。 ( 2 ) 通过对出发菌株的生长速度测定表明，生长速度快的菌株产置较高。菌丝的生长速 度与菌丝气生性有定关系，但与菌落的颜色无关。不同类型菌落中，型生长速度最 快。菌丝生长速度与子实体产量没有明显关系。不同类型菌落菌丝干重测定结果表明， 、v 型菌落菌丝干重较高，而i 、i i 、型菌落菌丝千重较低。 ( 3 ) 对出发菌株和继代分离株的无性型产孢结构观察表明，出发菌株的无性型具有多型 性，其无性产孢结构主要为拟青霉型( p a e c i l o m y c e s t y p e ) 、头孢霉型 ( v e r t i c i l l i u t y p e ) 两种。在同一虫草菌株中均具有两种无性产孢结构，不同菌株间 虫草无性产孢结构差异不是很大；不同类型茵落的菌株间无性型无明显差异：不同世代 菌株间无性型差异主要表现为分生孢子数量的差异：子实体产量不同的菌株中，无性型 差异表现在两种产孢结构数量比的差异。子实体产量较高的菌株两种无性型比例相近， 无予实体产量形成的菌株两种无性型的比例相差较大。 ( 4 ) 对出发菌株和继代分离菌株酯酶同工酶酶谱研究表明，酯酶同工酶酶谱可以反映出 不同菌株间的差异，但对同一菌株的不同类型菌落闻差异反映更为明显。不同菌株间谱 带的迁移率存在差别，不同菌株间谱带的深浅不同，t 1 2 菌株各类型的菌株的谱带都较 深，而t 1 0 各菌株谱带相对均较浅。不同类型菌株间谱带差异在谱带数最与颜色深浅两 个方面均有差别。菌落形态相似，但产量有差异的菌株间谱带的差异不是很大，只表现 出谱带颜色深浅上的差异，如t l o 的有产量菌株与无产量菌株只在第l 条酶带的深浅上表 现出差异。 关键词：蛹虫草；继代培养：菌落类型；无性型产孢结构：同工酶；产量 摘要 ht h i sp a p e r ，t h er e l a l i o n i h i po f 加吼i o 咖i cd i v e d s t y 趾dy i e l dm d e rs u b c i l l t l l mo f ( 嚏弦e 田m 讲幻 ，w e s t i l d i e db yu 面1 9 s 缸l i i l s 丘d mt i s s u ei 1 a d o 珊t c nc b 咒叽掣 研m 椭i 1 a t e so fg d b c u m 时e do nt h ep d am e d i u mf o r 丘f t o e nt i m e sa se ) 【p 既血n t a i m a l e r i a l m c l u d i | 1 9 i y c e l i a lm t eo fg w i h ，鱼m - b o d yy i e l d ，a s e x u a lc o n i d i o g e n o l l s 蚰：m r e ， e s t e 讴i s o z y m e sa n d o n “m a yp r o v i d es c i e 觚f i c 阳dt h c 0 础c a lb a s i sf o ro 删办瑚筘 m 腑豇p m d l l c t i o l l ，m a i nr e s l l l t sw e r e 骶f o l l o w s ： 1 f i v ec o l o n i a lt y p e sw e r ec l 鹊s e db ys e c t o r ，c o l o n i a lc o l o ra n dc l l 暑瞄吼盯o fa e r i a l h 舛 h 驰b yb y p h a ei ns e c t o d a la 豫aw e r ei s o l 删趾dc u l t i l r e d t h ed i s 砸b u t i o nr e 刚a t i o no f 矗v et y p ec 0 1 0 n i e so n6 f t e e ng e n e 瑚畦o sw a st h a tt y p eia n di io c c l m 他di n t o t a l 鲫e 枷o n s b mt h ec o l o i l i e st h o s eh a dl l i 曲盯曲叫e i a l 丘e q u e n c i e s 姐db i g g e rs c c 蜘a l v a r i a t i o na r e ao a l r r e di n3 7 留e 硪丘o n t ) c i 、v 0 c c u r r e di nt h e d i e s tg 豇l e 枷o m a n dl 咖s tg e n 啪矗。璐研ei ，弛d 帆a b l et o 如m 自妇t - b o d y t y p eih a dt l l e h i 星加s ty i e l dt h a n 也a to f f o l l o w e dt y p ei i 趾d i 1 1 y p e a n dv w e 此n o ta _ b l et o 蠡姗 6 面t - b o d y t h ei e l a 矗o n s l l i p 诵t h 舶i t 怕d yw 鸹吐mi s o l a 6 0 璐h a dh i 丑l e ra b i l i d e so f 自l i t b d d yw h e i lt h e yh a ds e m o 北i a lv a r i a l j o nf k q u e n c i e s 蛆ds e 咖r i a lv a r i a t i o na 吼 p r o t 0 岛，p es t r a i n sm o r p h o l o g yd e c i d e d 踺c t o r e i a lt y p e s 舡i dt h e i rd i s 缸b m i o n c d ，吗 c 印s 小订m f 捃d i 雠n tc o l 伽如sm 唧b o i o g y 肿t o t y p e 曲 a i n sh a dd i 丘b 删cy i e l d 2 t h e 却w i n gr a t eo f p 托哺o t ) cs t 瑾l i i 塔w a sa n a l y z e d nw a ss l l 。帅恤tf a s t e fm y c e l i a i g r o w i l l 曲f a i mh a dh i 曲e ry i d d m y c e l i a lg r 0 谢l 培豫t ew 器r e i a t e d 谢t h 曲【趾a m e ro fa e r i a l b 巾h 舱b 眦n o t b er e l a ：t e d 诚hc 匹o n yc o l o r t y p e c 0 1 0 n i e sg r o w e d t h e 向s t e s ta n d 劬p e vc o l 砌髂哪w e d 也es l a w e s t 锄o n gf i v e 母p cc o l o n i e s m y c d i a l 掣州v i n g 阳钯卸d 觚i t - b o d yy i e l dw e mn o tc o r 托l a 廿v e d i f f e r e m 母p ec o e sm w d i a ln e tw e i 窑mw a s a n a l 础i t 删灿w n m 砒孵、v1 1 a dh i g h e r c m 删i a l n nw e i g h t 脚研i 、 i h a dl o w e r 埘l y c e l i a ln e tw e i 室灿 3 w | 0 i 悄h g p r o t o 咖e 蚰面n s 卸dd i 删r 曲 a i 璐i s d b c l l l t l l r e ，嬲e x l l a lc o 血d i o 黜璐 s t n l c ：t 1 1 r e r a so b s a v e d i ti sg h o w n l a ts l 靠i i i l sw h i 6 hi s o l 蚰o n 丘o mn a l ：u r a l 丘1 l i t b o d i e sh a d p l e o m o f p h i s m t h e i ra s e x u a lc 耐d i o g e n o u ss t 九l c t i l r cc o l l l dh a dt w ot y p e 0 n eo f c o n i d i o 既1 0 u ss t n | c t m w 硒曲峙p a e c f 如彤m 麓卜t y p e ，髓o t h 盱孵a r e dt ob 朗rt y p i c a l c o i l i d i o 掣m o u ss t m 耽u 糟so f 砼r 疗c i 玎妇m 蛳t h es 撇es t r a i nh a dt w ok 矾c 砌d i o 嚣：n o l l s s 打u c t 啪陀s d i 丘b r 髓ts 蛐l l a d ts i 毋1 i f i c e n td i s 6 n g u s b a b l ei 1 1c o n i d i o g e n o u ss t r u c t 珊f e o n e 曲r a i n 证d i 丘b 黜tg e n e 枷o n s 雄 p e a r e dt oc o i l i d i u i nq u a i l 缸t yd i 鲥n g i l s b a b i e d i 丘b r e n ty i e l d 曲i i i l sh a dc c 向| m o g e n o u s 硼船sp i _ 0 p o r t i o nv a 衄 4 d i 丘宅r e n t 衄p es 拄a i n sa n dm 插妇ts 昀i n s 、v e r ea l l a l y s e db yu s i i 培o r t h o g o n a ls l a b p o l y r y l 锄i d eg e le l e t r o p h o 他s i s t h er e s u k ss h c 悄司t l l a te s t e m 辩i s o 蜀啦eb a n dc o m d r e v e a l et h ed i s t m 粤蜘l eo fs t 媳i n s 鼬ds t 隐i n 姆p 船b u ti tw 踞r e m 缸k i b kf o rd i 珏宅嗽l tt n ) e c 0 1 0 t l i e s d i f f e 糟n t 蚰r a i m 耻p 唿r e dt o 鞠t eo fm i 掣a 血培w 勰d i s 血】g u s ha _ b l e d i f f 色n t 蛐匠n s a p i e 删t oq l l 蛐晒t y 缸dc o l o ro fe s t c m s ei s o 巧m eb a n 凼b u t “w a sn o tt h eb a l l dc h a n g e d s i 卿f i c 姐u yb c 帆帅e nt h ef o m i n g 蛐f b o d y 曲面n sa n d 曲f b r m i n g 丘i l i tb o d ys 乜曲够 k e yw o r d s ：凸呻嘲”栅胁恼；s u b 咖i t n ；c o l 0 yt y p e ；缸旺u a ic o n i d i o g 哪o u s s t m c t l i n ；i s o 巧m e ；f n m b 0 | yy i e 埘 2 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名 导师签名： 一1 蔹 彳酉菊莉 时间：1 一年月卸日 时间：，l 占年衫月膨日 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 、 研究生签名： 砂j l 导师签名： 佰劾 时间： m 年月如日 赋同：渊锌6 玛 争b 磊 和 沈阳农业大学硕士学位论文 一、刖茜 1 1 目的与意义 蛹虫草( o 畸c e 筇历珊捃f ，( 、柚1 1 ) f r ) 是一种虫生药用真菌，我国名贵的中药材之一， 具有很高的药用价值和营养价值( 贡成良，2 0 0 0 ) 。随着野生冬虫夏草资源的减少，而人 们对其需要的增大，经近年来的研究表明，人工培养的蛹虫草具有与野生冬虫夏草相似 的功效，所以用人工培养的蛹虫草来替代野生的冬虫夏草是解决这一矛盾可行方法。蛹 虫革的人工栽培及规模生产技术己有报道，但产量和质量不稳定。菌种常发生变异，出 现菌落局部颜色的改变、菌丝见光后不转色、菌丝生长瘠薄、气生菌丝徒长、分生孢子 数量减少、子实体产量下降、不出子实体等现象。筛选出的优良菌株都不甚稳定，转管 一定代数后就可能发生变异，这意味着该菌生产性状退化。球孢白僵菌是一种寄生在虫 体的子囊菌，用于生物防治。唐晓庆等( 1 9 9 8 ) 研究了球孢白僵菌在继代培养中的菌落角 变现象，认为菌种退化与菌落角变有着直接关系。本研究以此为依据，研究蛹虫草在继 代培养中产生的角变现象，研究经角变形成菌落形态的多样性与子实体产量的关系，目 的是为蛹虫草生产提供理论依据。 1 。2 分类与药用价值 蛹虫草分类学隶属于真菌门饵脚y c o 忸) ，予囊菌亚门( a s c 衄1 y c o t h l a ) ，核菌纲 m 砌y c e t e s ) 球壳目( s p h r i a l 豁) ，麦角菌科( c l a v i c 印i 切c e 趾) ，虫草属( c o r d ) r c 印s ) ( 邵力 平，1 9 8 4 ) 。虫草菌是麦角菌科最大的属，广布于全世界。全世界共报道虫草菌有4 0 0 余 种，我国报道近1 2 0 ，约占世界总数的四分之一。蛹虫草是虫草属的模式种。 虫草属的寄主种类绝大多数是昆虫病原菌，能侵染鳞翅目、膜翅目、半翅目、双翅 日、鞘翅目的成虫、幼虫和蛹，以鳞翅目和膜翅目和昆虫最易受感染，除膜翅目多为成 虫外，其他各目郡寄生于幼虫，有少数种对两个不同虫期都能寄生。蛹虫草是这个属中 专化性不强的种类，能侵染鳞翅目，鞘翅目等1 3 种昆虫的成虫和蛹，以蛹上为常见， 如生于洋槐天蛾( c f 8 n 括如“c 口z f n 仍啪昆虫的幼虫，舟蛾科( n o t o d o 嘶d 神) 昆虫的蛹， 天蛾科( s 幽g i d ) 昆虫的蛹，扁刺蛾( 砌d 卵口如呦口坳d 功) 昆虫的茧，鳞翅目 ( l 肋i d o p t e m ) 、蝶类( l e p i d o p t e m ) 昆虫予蛹( 裸蛹和被蛹) 的节间，或者生于幼虫的头部。 蛹虫草分布在河北、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江、安徽、福建、山东、湖北等地。 真菌直接作为药材是我国真菌学的一大发明。传统中医药认为，冬虫夏草有秘精益 气，补肺益肾补鹣髓，专朴命门。止血化痰已劳嗽之功，补虚损强壮丽兼收敛镇静韵作 用。野生蛹虫草具有多种药用价值，滋补功能，可以人参、鹿茸相媲美。全草入药，性 平，味甘。蛹虫草和冬虫夏草在成分、药理作用等方面具有很多相同之处。虫革中含有 虫草素、虫草酸、虫草多糖、多种人体必需氨基酸、有益微量元素和维生素等。其主要 成分之一的虫草素，是一种具有抗生作用和抑制细胞分裂作用的物质，能抑制癌细胞的 增生，而且含量远远高于冬虫夏草，除此之外还分离得到b 一谷甾酵、d 甘露醇、腺嘌 前言 呤、腺苷、s 0 d 等成分。国外用同位素检测技术对冬虫夏草研究证实，虫草中的虫草素 和虫草酸不仅具有补肾壮阳、益精定喘的作用，而且能明显地对抗细胞衰老。g u n n i n g h 柚 等( 1 9 5 1 ) 在蛹虫草中发现了虫草菌素( c o r d y c e p i n ) ，不但熊干扰r n a 和蜊a 的合成，抑 制细胞的分裂，还能作为区别细胞中不同的r n a 聚合酶的工具在这些方面的研究已经是 硕果累累，而且作为开发冬虫夏草替代品，蛹虫草的成分、医疗作用等方面被研究得越 来越透彻。采用大鼠、小鼠、兔子等动物试验表明：蚕蛹草具有抗疲劳、提高机体免疫 力、杀死癌细胞，能补肺益肾，具有扶虚损、益精气治血、化痰、镇静等功效。 1 3 子囊菌的遗传学特点 丝状子囊菌由有隔菌丝组成，隔膜上有一个小孔道，小孔的宽度可使细胞核通过 ( o r e ，1 9 6 5 ) 。这可使菌丝内含有几个核，这些核的差异可以通过突变产生，或者通过 不同遗传型菌丝之间的联合，随之进行细胞核的转移而引起。菌丝细胞内如含有一种以 上的遗传型细胞核，称为异核体伪昧们d a r y o n ) 。异核体的特点是细胞由不同的核所组成， 但仍是单倍体，因为这不同的核共存于一个细胞中并未融合。 异核体形成的意义在于( 1 ) 异核现象的存在增加了菌丝对生存环境的适应能力，不 同类型的核在一个异核体内出现的比率在菌落生长期间可以发生变异，这可能是与培养 基内所含的养分发生变化有关。如圆弧青霉在纯培养中，同核体的生长比异核体的生长 要差，这显示出异核体的适应性要比同核体强。( 2 ) 遗传变异性一个菌丝体含有不同遗 传型的细胞核是代表遗传物质的贮存，这与双倍体生物的杂合情况相似。( 3 ) 异核体的 破裂，一个异核体可以产生单核的或同核的分生孢子，或者产生同核的菌丝顶部。无性 繁殖在稳定的环境中个有优越性，但是当有性生殖缺乏时，产生异核现象，发生准性生 殖，从而提供了除有性生殖外的遗传灵活性。异核现象是无性繁殖过程中，在缺乏性细 胞的参与的情况下而进行的体细胞重组过程。异核体形成是异宗配合真菌有性生殖过程 前提。只有异双核体菌丝体，在各种内、外因素都能满足结实的要求时，双核菌丝体才 会分化发育成具有特殊产孢结构的子实体。 表型多样化是异核体的另一特征。异核体的表型是由核型与细胞质的相互作用而决 定的，在异核体中，一个特定的核型携带的等位基因的概率很高，如果这一等位基因控 制一个特定的表型，那么这一表型也表现出相对广泛的变化范围，这相对核数目的变化 使它比典型的二倍体生物更具有表型的多样化。在表型上异核体菌丝可能同它的亲本很 不相同，这是由于它含有不同来源的细胞质和细胞核。在异核体内，两个遗传性状不同 的细胞核偶尔能融合成一个二倍体的杂合核，叫杂合二倍体，但自发形成杂合二倍体 的频率非常低，为l o 。5 1 0 一。杂全二倍体常基于孢子颜色不同而与异核体相区别。产生 分生孢子是真菌最常见的无性繁殖方式。不同类型的核在一个异核体内出现的概率在菌 落生长期间可以发生变异，这可能是与生长的基物内营养成分发生变化有关，如圆弧青 霉能在自然状态下产生一种异核，而在纯培养中，这种异核体产生两种不同的同核体( 表 现为个别分生孢子是单核的) 。异核体在形成分生孢子时，并非全部能得到异核体的孢 2 沈阳农业大学硕士学位论文 子，可以产生同核体的分生孢子，也可以产生异核体的分生孢子。 交配习性异宗配合的遗传基础，典型的是一个基因具有两个等位基因，a 和a ，由于 这两个等位基因在形成子囊孢子前的减数分裂过程中分离开来了，一个子囊内的8 个子 囊孢子将包括两种交配型，各为4 个孢子。只有当两个不同交配型的菌丝之间有可能形 成异核体时，才能发生交配。真菌从表型上发生可遗传的变化的另外一个原因是发生了 基因的突变。突变可以分为两种类型一选择性突变和非选择性的突变。选择性突变是在 一定的环境条件下使突变型具在某种优势，从而使突变细胞后代能旺盛地生长，从而取 代它们的亲代。而非选择性突变的突变型没有选择优势。真菌的任何特征都能通过突变 而改变。所有表型的变化最终都和酶或其他蛋白质的变化有联系。突变型的外部形态特 征会发生改变，如菌落的表型性。失去形成孢子和分生孢子的突变型很普遍。在真菌中， 因为菌落的颜色绝大部分都是分生孢子赋予的，所以一般可以通过观察它们是否缺乏色 素来识别这类突变型的菌落。 环境变化是突变产生的重要原因，此外，有些情况下的遗传变化与突然的突变不同， 如，细胞代谢机构的任何方面都可能发生变化。在培养中还会发生趋异性演变。连续的 传代可导致发生变异，即使使用相同的培养基也会出现这种情况。真菌之所以能比真核 生物易产生变化的原因是，( 1 ) 一个动物或植物的体细胞突变不能传给下一代，而真菌 细胞的突变都可以传给下一代。( 2 ) 大多数的菌丝是单倍体，它意味着突交一经产生就 能立即得到表遗这和双倍体生物大不相同。( 3 ) 真菌可获得高密度群体，因而存在很 大的突变机率。( 4 ) 真菌生长速度速率普遍比高等生物快得多，使得突变类型的选择和 发展也快。 1 4 研究进展 1 4 1 虫生真菌形态变异研究 菌落角变( s e c t o r ) 是某些真菌菌落形态发生变化的形式之一。菌落角变现象是指在 菌落中分散地呈现各种形态和颜色不同于亲本菌落的生长。许多植物病原真菌均被发现 具此现象( 唐晓庆，樊美珍等1 9 9 6 ) 。唐晓庆等在研究球孢白僵菌时发现，球孢白僵菌继 代培养的2 个多孢株和8 个单孢株中，除1 个单孢外，都发生了菌落角变现象，即菌落 产生了扇形的变区，形成各种形态和颜色各异的分离子，多表现为菌苔瘠薄或气生菌丝 长，肉眼可见产孢量减少：尤其是单孢株菌落局变产生的分离子往往伴随着棕黄色或红 棕色色素的分泌，不同于母株的镶嵌菌落。分离子在6 一l o 代后稳定。蛹虫草具有角变 现象。梁宗琦( 1 9 9 0 ) 观察到野生蛹虫草菌株的角变现象，在野生菌株p d a 平板的菌落上 发现一菌丝致密、颜色略淡带白色的扇形角变，用菌落外缘菌丝分离获得角变分离株。 经分离培养后，野生株菌落淡荣莉黄色，分离株菌落中部近白色，其外有一条黄色产孢 轮带。粱宗琦( 1 9 9 8 ) 在萨氏琼脂和p d a 上，发现蛹虫草无性型，蛹草拟青霉的一些单 孢子株可自发产生突变，形成的菌落角变，角变区菌落形态与亲本不同。在察氏琼脂上， 单孢子株c m 7 1 菌落白色，致密绒状，可产生的角变菌落星淡黄色，平展，蛛网状，具 3 前盲 黄色浓密轮层。除单孢子株间在形态特征上有相当的差别外，个别单孢子株尚可从第一 次形成的角变上产生二次角变( 次生角交) 。第一次角变为土黄色，粉质而它们形成的 次生角变则为白色，轻度粉质。 除角变之外，一些真菌还会产生其它形态变异。g r i b a ( 1 9 8 5 ) 报导，虫生丝孢菌类 真菌阳8 f a r 拓i “ma n 话印“粥) 在培养中菌落会发生变化，分生孢子颜色发生变化。野生型 分生孢子为绿色，而变异的菌株会发现产生黄色分生孢子和白色分生孢子。其中白色型 为硫胺素营养缺陷型，黄色型为精氨酸营养缺陷型。 1 4 - 2 虫草菌无性型多型现象研究 虫草菌生活史具有无性和有性阶段。无性型通常是指具有复性生活的丝状真菌生活 前段一无性孢子阶段的菌体形态。因两个菌丝阶段各具独立性和不同的产孢结构，生活 周期长，影响因素多，因而实现无性阶段与后期有性阶段的一一对应关系是困难的。 理论上，验证真菌有性和无性真实关系的可靠方法，是在纯培养条件下，用分离的 纯培养物或孢子使其达到分生孢子阶段与予囊孢阶段的互变，并且这两种孢子与自然状 态下形成的完全一样。然而，实现这种验证是困难的。因而可用确定无性型的间接方法， 该方法是通过分别观察培养虫草有性型子座、子囊孢子或菌丝体来比较是否形成具有相 关性的无性产孢结构。间接方法主要包括( 1 ) 用虫体、子座和菌索作组织分离并纯化， 多批次多途径分离培养后相互验证为同一种真菌；( 2 ) 成熟的子座发射子囊孢子，反复 洗净后挑取萌发的单孢进行纯化培养；( 3 ) 同时进行组织分离和子囊孢子分离，培养物 相互验证。迄今据资料统计，有近5 0 种虫草已报道了其相关的无性型。现有研究表明存 在如下问题：( 1 ) 蛹虫草( c c 帆c 瞄f m 础衙话) 无性型具有几个异名( 阳e c i j d 帕i c 舒 m 豇妇廊) ，( 眙腑册删m 砌梆) 和( 嘶蜢胁即一堋m 妇n 付) ，( 2 ) 一种虫草，如冬 虫夏草( c 。埘如e 阳s 加e ，妇) ，具有多种无性型；( 3 ) 两种虫草共一种无性型，如蛾蛹虫 ( c o r 加g 筇p 蜘玎张f ) 和高雄山虫草( c d ，咖铜粥翻勋d m 鲫劬研) 的无性型都有报道 是细脚拟青霉( a 碓c 如 粥甜船万咖郴) 。产生上述问题的原因可能是：( 1 ) 多数虫革无性 型的确定是基于间接的根据，因而不可能排除混合感染、次生感染、重寄生及腐生菌存 在的可能；( 2 ) 共无性型的存在，如根柄虫草就具有由两种真菌组成的共无性型( b a l a z y ， 1 9 8 4 ) ；( 3 ) 双型现象( d i m o r p h i s m ) 或多型现象( p l e o m o r p h i s ) 的存在等。 多型现象是指一种真菌同时具有有性型和无性型的两种繁殖方式，能产生一种以上 类型孢子的现象。狭义的多型现象则是指含有两种或两种以上无性繁殖体的无性型多型 性，这类多型性通常归纳为三神类型：( 1 含两种以上形态不同但个体发育方式相同的 分生孢子，如大孢子和小孢子；( 2 ) 具两种以上不同发育方式的分生孢子。如匹茨林克 被毛孢除具透明、光滑、薄壁、分隔，倒拟卵形或倒梨形的分生孢子外，同时形成大而 厚壁的、具离壁隔膜的狭棒形多隔孢子；( 3 ) 具多型产孢体。虫生真菌中的细脚拟青霉 及束梗被毛孢，可同时在孢梗束和菌丝上形成分生孢子梗和产孢细胞。 虫草的多型现象主要指具多型产孢体。梁宗琦( 1 9 9 8 ) 发现，试验用同一菌株的7 4 个 4 沈阳农业大学硕士学位论文 单孢子株依据菌落形态特征可分为3 种：( 1 ) 野生型菌株特征，菌落一般不自发产生角交； ( 2 ) 菌落白色，扁平，笠状，易产生亮褐至橙黄色的角变；( 3 ) 菌丝生长纤细，蛛网状。 3 种菌落类型的无性产孢结构不同：( 1 ) 野生型产孢细胞拟青霉型( p a e c i l o m y c 髓_ 咖e ) 为 主，分生孢子多聚集成瓦状长链。产孢细胞单生或簇生于营养菌丝或孢子梗上分生孢子 两型，在孢子链顶部的分生孢子柱状，一端稍尖，链的其余孢予近球形，或拟卵形，通 常分生孢子常连成迭瓦状链，亦可见疏散的孢子头。( 2 ) 角变典型产孢结构是瓶梗轮生， 分生孢子常聚集成头状的轮枝孢型( v c n i c i l l i u m 切e ) 产孢结构。( 3 ) 产孢结构轮枝孢型。 1 4 3 虫生真菌致病力及子实体形成研究 予囊菌中植物致病菌和虫生真菌研究较多，试验表明，菌株间存在差异，同一菌株 经多代培养后致病下降。胡锦江等( 1 9 9 3 ) 研究表明白僵菌慨钿船切瓣) 不同菌株间以及同 一菌株的不同世代毒力存在着差异。唐晓庆等( 1 9 9 6 ) 研究认为，球孢白僵菌的菌落角变 现象与生产中发生变异白僵菌的菌种常出现菌丝徒长、产孢量减少、杀虫毒力下降等退 化现象有直接的关系，角变分离菌株对寄主的侵染能力明显减弱。成国英等( 1 9 9 8 ) 报导， 水稻白叶枯病菌保存菌株致病力的变异是经常发生的。冰箱中保存的该菌株，致病力发 生变异的比例约为5 0 左右。阿地力( 2 0 0 0 ) 试验证明，粉拟青霉( p 口o f 如删细打梆淞， 在人工培养基上多代培养致病力明显下降。连续培养3 代后致病力仅为第一代的2 8 。体 表接种各代之间的致病力差异极显著。第l 代致病力最高，比第5 代高1 倍左右。粉拟青霉 经4 ，5 代培养后，其致病力会显著下降，因而用该菌进行防治时，连续培养以不超过3 代 为宜，3 代以后应重新复壮。 蛹虫草菌株间子实体形成能力存在差异。菌株的菌落形态与子实体形成能力有关。 梁宗琦( 1 9 9 0 ) 在研究中观察到，在r p s 培养基上，野生型和野生型与变异株的混合两 种处理皆能产生北虫草子实体。但单一的变异菌株在同一时间则不能形成子实体。梁宗 琦( 1 9 9 8 ) 试验证明，7 4 个单孢株的3 种菌落类型寿命及子实体形成能力存在差异：野生 型( 1 ) 菌株的寿命较长，8 1 5 可存活5 个月以上，人工培养易产生具成熟子囊壳的子 实体；而野生型变异株( 2 ) 和( 3 ) 菌株在查氏琼脂上的质地和颜色与野生株基本相同，但 生长较慢，在相同条件下全部死亡，且不形成子实体。 子实体的形成与其无性型菌株的遗传特性有着十分密切的内在联系。吴畏等( 2 0 0 0 ) 用野生北虫草经组织分离获得的菌株进行无性型结构观察，认为( 1 ) 产孢结构呈迭瓦状 孢子链的拟青霉为主，在同一根菌丝上同时存在聚集成头状的轮枝孢霉，同时具有这两 种产孢结构的菌株，具有较强子实体形成能力，且遗传相对稳定。( 2 ) 分别只具有的野 生型一拟青霉或变异型一头孢型都难形成子实体。( 3 ) 具有两型产孢结构，但不着生在 同一根菌丝上可形成子实体，但不稳定。( 4 ) 单孢子几乎不能形成子实体经配对后可形 成予实体能力。 1 4 4 同工酶方法在真菌变异鉴定应用研究 边银丙等( 1 9 9 6 ) 松色二孢菌菌株酯酶同工酶的测定结果表明，松色二孢菌在脂类 前言 分枝代谢途径上存在分化。这种分化与它们在形态特征、产孢条件及致病力等方面存在 显著差异的表现是一致的。杨立红( 2 0 0 4 ) 和姜性坚证实，酯酶同工酶可鉴别出经辐射 处理白平菇和金针菇菌株间的差异。姜性坚试验表明，金针菇不同菌株间酯酶同工酶谱 有明显差异。辜运富等对1 5 个具有一定的遗传差异的双孢蘑菇菌株进行酯酶同工酶和 可溶性蛋白电泳。证明酯酶同工酶酶谱的区分效果最好，既具有较高的多态性以反映不 同类群的差异，又具有清晰易变的特点，建议在实验研究中应优先选用。罗葆兴( 1 9 9 9 ) 酯酶同工酶生化水平的变异与形态特性的变异不同步。同一小生境不同样本的酯酶同工 酶类型发生变化不一定或不足以引起形态特性的明显变异，人的感官不易察觉，而同工 酶的种类很多，酯酶同工酶只是其中的一种。所以，同一小生境采集的样本，其形态特 性基本相同，但同工酶的酶谱不同，通常形态特性的变异可能是由多种代谢途径或环节 变化。在对马铃薯不同品种的酯酶同工酶分析也证明了这一点( 刘卫平，1 9 9 6 ) 。 胡锦江等( 1 9 9 3 ) 报导，白僵菌( 占施i ，n 口m ) 各世代胞外蛋白酶的产酶水平进行了 分析。各世代在5 d 的培养过程中产酶情况，结果表明，各世代在明胶液体培养基中培养 2 4 h 后开始活跃地产生胞外蛋白酶。l 代的产酶量始终最大。其它各代则随继代移殖次数 的增加依次减弱，但各代间差异不明显，l 代和5 代间最大差距仅为3 个酶活性单位( p u ) 。 k u c e r a 和s t l e g e r 等人在对绿僵菌( 脚细纰批蚺妇) 的研究中指出，菌株的蛋白 酶活力与其毒力密切相关；m i c h 8 e l 等在研，阳b s 泗w 对蚱蜢妇m 口妇叫h 咖s ) 的毒力时得出了同样的结论。 1 4 5 子囊菌变异机制研究 梁宗琦( 1 9 9 8 ) 报导，蛹虫草的无性阶段是一种异核菌丝体。蛹草拟青霉不仅是一种 异核体，而且也是一种在细胞质内存在不同细胞微粒的异质体。蛹草拟青霉的不同角变 株，不仅在分生孢子聚集方式上存在头状的轮枝孢型和链状拟青霉型两种产孢方式。菌 落局变现象的出现意味着菌株发生了遗传变异，其变异机制主要与异核现象有关。白僵 菌在自然界多以异核体形式存在，在菌丝和单核分生孢子梗产生单核分生孢子时就使异 核体离异，防碍了异核现象的保持。因此在白僵菌生活史里异核体是暂时的研究z y 0 5 菌 株呈现出频繁多态的局变。表明该野生型菌株很可能为一异核体。单核的单孢株在继代 培养中也同样表现出菌落局变现象，暗示白僵菌变异不仅仅是由于异核现象。白僵菌单 核的单孢株发生变异是由于核外遗传物质的改变，还是由于异核体核融合以致发生准性 生殖所致还需研究。 变异是以突变的形式对外界环境的一种适应性反应。梁宗琦推论：在人工培养条件 下，蛹虫草等虫草无性型为适应生存条件的改变，一方面通过某些营寄生性基因的丢失 或钝化，另一方面也可通过孢子自身菌丝问的原生质、细胞颗粒( 如线料体和病毒颗粒 等) 和核的交换和或重组而得到调整。真菌的多型性是这类丢失、钝化、交换或重组过 程的形态表现。孙狄( 1 9 9 0 ) 认为，粗糙脉孢苗和鹅粪柄孢壳菌伴随着棕褐色色素韵老化 现象可能是由于核外遗传物质线粒体d n a 发生了改变。唐晓庆( 1 9 9 8 ) 认为，营养贫瘠的 6 沈阳农业大学硕士学位论文 培养基较营养丰富的培养基易发生突变。除营养因素外，环境条件也影响变异的发生。 高温、高湿、全光照引起的变异频率最高。而低温、低湿、全光照引起的变异频率最低。 而发生色素角变的分离子毒力往往较低，表明色素的分泌与退化有关。 水稻白叶枯病菌自然群体是由不同致病型组成的混合群体。致病力的下降很可能是 因为母株中强毒性细菌群体所占比例下降所致。在反复的人工培养和冰箱保存的条件 下，弱毒细胞的繁殖率和存活力可能远较强毒细胞高，这样随着强弱毒细胞以不同的速 率生和死，导致保存株整体毒力结构的变异，从而表现出致病力的改变。孙恢鸿报道： 菌株致病力降低幅度的大小与菌株保存时间的长短成正相关。毒力组成结构永远只能是 相对稳定的，因此致病力的变异是绝对的，而不变是相对的。李美娜( 2 0 0 3 ) 等利用 p c r - r f l p 和r a p d 方法对人工栽培虫草及其退化菌种进行了基因水平的分析。结果表明 退化菌株较野生菌株在d n a 水平上发生上频率高的突变，在5 8 s + f r s 这个区段，正常 菌株与退化菌株至少有两个位点存在着差异，测序结果进一步明确了退化菌株碱基突变 发生的位点，在第2 7 9 和3 6 0 个碱基处发生了t 到c 的转换，致使施pi 在退化菌株上 没有酶切位点。这一结果，即限制性内切酶蚴i 酶切结果完全可以作为一种分子标记。 康冀川等对5 8 s ，的r l c n a 基因及i t s 2 间区d n a 序列的分析结果表明，蛹虫草的两类无 性型具有分子水平上的遗传趋异性。这些突变可能直接与导致菌种退化。 1 5 影响因素 1 5 1 继代培养 传代次数是加速退化的一个重要原因。试验证明，芽孢杆菌的黄嘌呤缺陷型菌种的 总的保存时间一定时，随着移植代数的增加回复突变率也增加，腺苷的产量逐步下降。 试验结果也证明，退化并不突然明显，而是当退化细胞在繁殖率上大于正常细胞时。每 移植一代，使退化细胞的优势更为显著，从面导致退化。基因突变是造成菌种退化变异 的主要原因。变异和不纯的菌株在接种传代中过程中发生不同成份比数变化，从而导致 退化。突变的比数愈大，产量愈低，说明基因型改变导致产量下降，突变比数并不决定 在斜面上保藏的时间多少，而决定接种传代的次数。因而接种传代是菌种退化的决定性 因素，胡锦江( 1 9 9 3 ) 对各世代对马尾松毛虫的毒力结果表明，不同世代对马尾松毛虫的 毒力存在着明显的差异，总的变化趋势是随着继代次数的增加毒力依次减弱。 1 5 2 营养条件 不适宜的培养条件是加速退化的另一个重要原因。培养条件对不同类型的细胞或细 胞核的数量产生影响。试验表明，米曲霉的异核体培养在含有酪蛋白的培养基上，异核 体中带有酪蛋白的基因的核，在数量上也会由劣势变为优势，而在水解酪蛋白培养基上， 就处于劣势。 1 6 研究方法 1 6 1 形态标记 有关菌种退化变异检测，通常是通过观察检测菌株在外部形态特征，包括菌落形态、 7 前言 无性产孢结构、菌丝生长速度、细胞的繁殖能力、分生孢子产量、代谢产物产量、子实 体产量、子实体质量等；也包括生理特性，如酶、致病力等有关的一些特性。此种形态 标记简单直观，长期以来作物种质资源鉴定及育种材料的选择通常都是根据形态标记来 进行的。如人们在食用菌栽培实践中总结出：菌落形态为气生型的，子实体质量好，但 产量低；菌落形态为匍匐型的，子实体质量差，但产量高；而菌落形态为半气生型的， 子实体则表现出高产优质。 詹才新( 1 9 9 7 ) 试验证明，菌落形态不同的菌株，其酯酶同工酶在菌丝体阶段存在较 大的差异，而在子实体阶段则完全相同；同时，这些菌落形态不同的菌丝子实体产质量 性状之间也存在较大差异；据此推测它们之间的差异可能是由菌丝体阶段酯酶同工酶的 差异所造成的。双孢蘑菇的菌落形态和子实体产质量之间存在一定的相关性，即菌落形 态相同的菌株间子实体产量无显著差异，而菌落形态不同的菌株间子实体产质量有显著 差异。王晓峰( 1 9 9 7 ) 菌丝生长速度是关系到菌丝尽快占领基质，抵抗杂菌污染的一个重 要性状，是高产、优质的保证。采用试管平面培养基测定菌丝生长速度，菌株间菌丝生 长速度差异极显著，试管平面培养基测定菌丝生长速度误差小，亲本单孢菌株与后代杂 交菌株菌丝生长速度问不相关。 1 6 2 生化标记 生化标记出现，为遗传多样性测定提供重要检测方法。生化标记主要包括同工酶、 等位酶和贮藏蛋白。同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指 由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同形式。同工酶作为一种直接的基因产 物，它具有其独特的优点：首先它受环境因素影响较小，表现出相对的稳定性；在变异 和进化的过程中，同工酶的种类和组成又会产生一定的变异，在生化代谢途径上出现多 样化，同工酶分析可在一定程度上反映出真菌菌株问变异与分化。 1 6 3 分子标记 近年来，分子标记的研究与应用得到了迅速的发展。因为生物各种性状的差异主要 是遗传物质d n a 的差异造成，通过d n a 分子标记可以直接检测基因组的遗传变异，它更能 准确揭示同一物种内不同种、变种、品种、品系间个体的差异。d n a 分子标记具有不受 季节、环境限制，不存在表达与否的问题，多态性高，自然存在着许多等位变异，不需 专门创造特殊的遗传材料等优越性，d n a 分析技术不仅广泛应用于遗传图谱构建、基因 定位等方面，而且被认为将是鉴别品种、品系及分析种质资源遗传多样性的有利工具。 1 7 结语 综上所述，前人在理论上对真菌及虫草变异多态性方面进行了研究探索，并取得了 一些重要进展，但这些理论如何应用于虫草菌种退化方面的研究，尤其是如何找到与子 实体产量有关的无性形态标志? 继代培养对无性形态和有性形态子实体产量的影响是 什么? 为此，开展蛹虫草在继代培养中多样性研究具有重要的意义。即为生产提供理论 依据。另一方面，与动植不同，微生物的遗传特性使其遗传变化较容易在外部形态表现 沈阳农业大学硕士学位论文 出来，因而，我们可较易根据微生物外部形态的变化来判定其遗传上的差异。因此本学 位论文研究目标，重点是想研究继代培养对虫草菌种形态的影响，并利用菌种无性阶段 的表型性状与子实体的关系进行探索，为蛹虫草生产和菌种选育提供理论依据。 9 材料与方法 2 1 供试菌株及来源 二、材料与方法 1 0 株分离自不同野生蛹虫草的组织分离株t 1 ，t 2 ，t 3 ，t 5 ，t 7 ，t 8 ，t l o ，t 1 2 ，t 1 3 ， t 3 7 及其继代培养分离菌株。野生北虫草来自辽宁沈阳。 2 2 继代培养方法 将供试菌株接种于p d a 培养基平板中央。用封口膜封口，暗培养1 5 d 。培养温度 2 3 ，见光4 8 h 后观察菌落形态。一旦菌落出现角变，将角变区和非角变区分别继代培 养1 5 代。5 次重复( 1 个培养皿1 次重复) 。 2 3 供试菌株子实体产量测定 2 3 1 试验方法 将菌龄为1 5 d 的液体供试菌种接种在栽培培养基中，进行子实体产量测定试验，5 次重复( 每个处理接种5 瓶) 。按常规方法栽培管理。接种后第4 5 d 测定子实体产量，产 量用子实体鲜重的平均值表示( g ) 。 2 3 2 栽培培养基配方每瓶培养基中大米2 5 9 ，k h 2 p 0 4o 0 6