（免疫学专业论文）靶向survivin核酶和sirna诱导肿瘤细胞凋亡研究.pdf

华中科技大学同济医学院硕士学位论文 靶向s u r v i v i n 核酶和s i r n a 诱导肿瘤细胞凋亡研究 硕士研究生： 导 师： 刘红云 沈关心教授 中文摘要 目的：构建噬菌体p h i 2 9 马达r n a 与靶向s u r v i v i n 核酶及s i r n a 的嵌合体， 研究其沉默s u r v i v i n 基因的表达及其诱导肿瘤细胞凋亡的效应。 方法：构建p r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) 和p r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) 嵌合体，应用 脂质体转染技术，将其转染入人肿瘤细胞株m c f 7 和h e l a 细胞。采用r e a l t i m e p c r 方法检测转染细胞与对照细胞内s u r v i v i n 基因m r n a 的表达水平，通过倒置 显微镜、倒置荧光显微镜以及a n n e x i n - v p i 双染后流式细胞术( f c m ) 检测实 验组与对照组肿瘤细胞凋亡率。 结果：体外细胞模型研究结果表明：转染p r n m r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) 嵌合体 的人乳腺癌细胞株m c f 7 与转染突变体p r n a r i b o z y m e ( m u t a n t ) 及未转染对照 组比较，转染p r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) 嵌合体的人肿瘤细胞株s u r v i v i nm r n a 表 达水平显著降低，转染突变体p r n a r i b o z y m e ( m u t a n t ) 与未转染对照组比较无显 著差异；转染p r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) $ 1 1p r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) 嵌合体后，细 胞凋亡率明显增高；通过共转染g f p 表达质粒和p r n a s i r n a ( g f p ) 后，采用 倒置荧光显微镜和f c m 检测结果表明，p r n a s i r n a ( g f p ) 可显著沉默g f p 的表 达，而p r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) 嵌合体对g f p 的表达无抑制作用，表明 p r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) 嵌合体的作用具有高度特异性。 结论：p r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) 和p r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) 嵌合体能够特异 性沉默肿瘤细胞中s u r v i v i n 基因的表达，增加肿瘤细胞的凋亡率，有抗瘤效应， 表明p r n a 可作为小分子治疗物质的有效载体。 关键词： 核酶，干扰r n a ，凋亡，p r n a ，p h i 2 9 ，基因沉默 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 s t u d yo ft h ee f f e c t so fr i b o z y m ea n ds i r n at a r g e t i n g s u r v i v i ni ni n d u c i n ga p o p t o s i so ft u m o rc e l l s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h eg e n es i l e n c i n ga n da p o p t o s i s i n d u c i n ge f f e c t so f p r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) a n dp r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) c h i m e r a m e t h o d s ：c o n s t r u c tp r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) a n dp r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) c h i m e r a l i p o t r a n s f e c tt h ec h i m e r ai n t oh u m a nc a n c e rc e l ll i n e ：m c f - 7a n dh e l a e x a m i n et h em r n a l e v e l o fs u r v i v i nw i t h i nt h ec a n c e rc e l ll i n eb yr e a l - t i m ep c r m o n i t o rt h ea p o p t o s i s - i n d u c i n ge f f e c t so f t h ec h i m e r aw i t hi n v e r s em i c r o s c o p ea n df l o wc y t o m e t r ya f t e ra n n e x i n v p id o u b l e l a b e l i n g r e s u l t s ：i n v e s t i g a t i o nw i t h c e l l u a rm o d e li nv i t r or e v e a l e dt h a t ：a f t e r t r a n s f e c t i o no fp r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) ，t h em r n al e v e lo fs u r v i v i nw i t h i nh u m a n b r e a s tc a n c e rc e l ll i n em c f 7w a s s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d c o m p a r e d t o p r n a r i b o z y m e ( m u t a n t ) t r a n s f e c t e dg r o u p ，a n dn od i s t i n c t i v e l yd i f f e r e n c ei nm r n a l e v e lw a sf o u n db e t w e e nt h e 矗u t a n tc h i m e r at r a n s f e c t e dc e l l sa n dt h en o n t r a n s f e c t e d t h ea p o p t o s i sr a t ei sh i g h e ri np r n a r z ( s u r v i v i n ) a n dp r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) t r e a t e dc e l l sc o m p a r e dt oc o n t r 0 1 a f t e rc o n - t r a n s f e c t i o no fg f pe x p r e s s i o np l a s m i d a n dp r n a s i r n a ( g f p ) ，p r n a s i r n a ( g f p ) w a sp r o v e dt ob ea b l et os i g n i f i c a n t l y i n h i b i tg f pe x p r e s s i o n b yu s i n g i n v e r s ef l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e a n df l o w c y t o m e t r y ，w h i l ep r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) h a v i n g n o s i l e n c i n g e f f e c t so ng f p e x p r e s s i o n w h i c hs h o w e dt h a t p r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) c h i m e r ai n t e r f e r e dg e n e e x p r e s s i o ns p e c i f i c a l l y c o n c l u s i o n s ：p r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) a n dp r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) c h i m e r a w a st e s t i f i e dt ob ea b l et os i l e n c es u r v i v i ne x p r e s s i o na n di n d u c ea p o p t o s i so fc a n c e r c e l ll i n e ss p e c i f i c a l l yw h i c hp r o v e dt h a tp r n ac o u l db eu s e da se f f e c t i v ev e c t o r sf o r s m a l lg e n et h e r a p ym o l e c u l e s k e yw o r d s ：r i b o z y m e ，s i r n a ，a p o p t o s i s ，p r n a ，b a c t e r i o p h a g ep h i 2 9 ，g e n e s i l e n c i n g 2 b s a c d n a d e p c m r n a e d l a p b s p c r 英文缩写与汉语名称对照 b o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a d i e t h y l p y r o c a r b o n t e 二乙基焦磷酸盐 m e s s e n g e rr n a 信使r n a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i dd i s o d i u ms a l t 乙二胺四乙酸二钠 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链反应 r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r 逆转录p c r r e a l - t i m ep c r 实时定量一p c r o l i g o ( d t )寡聚胸腺嘧啶核苷酸引物 r n a s i n f c m p r n a r z ( m u t ) r n a 酶抑制剂 f l o wc y t o m e t r y 流式细胞术 p r n a r i b o z y m e ( m u t a n t ) 靶向s u r v i v i n 的核酶突变体和p r n a 嵌合体 p r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) 靶向s u r v i v i n 的核酶和p r n a 嵌合体 独创性声明 本人声名所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不包含任何其他人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文版权使用授权书 学位论文作者签名： 日期：2 0 0 6 年4 月1 6 日 互毛 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密区在4 年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“4 ) 学位论文作者签名：a i ) 五 b 期：2 0 0 6 年4 月1 6 日 指导教师签名： 日期：2 0 0 6 年4 月1 6 日 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 前言 核酶【1 - 5 和干扰r n a 6 ，7 】是一种通过下调特异性基因表达的抗肿瘤及抗病 毒的分子之一。但有效的核酶和干扰i 埘a 治疗分子必须具备以下特征：能够 穿过细胞膜进入细胞内：不能被胞浆内的核酸酶降解；不能被内体和溶酶体 破坏；能到达细胞内合适的作用区域；负载于载体上的核酶能够正确折叠； 特异性识别靶细胞。 本课题组前期研究已经发现s u r v i v i n 基因在人肿瘤细胞中高度特异性表达， 并且已经证明s u r v i v i n 的反义r n a 能够诱导多种肿瘤细胞的凋亡 2 l 2 2 1 。然而反 义r n a 在胞内容易被降解因而作用短暂，且单独使用反义r n a 作用特异性较低。 为了克服反义r n a 分子的上述缺点，我们构建了一种由p r n a 为载体的s i r n a ， 核酶嵌合体分子。 这种由噬菌体p h i 2 9 编码的小分子r n a ( p r n a ) 已经被证实在 该病毒包装过程中起着关键作用p j ，进一步研究发现六个相同的这种小分子 r n a 所形成的环状六聚体 9 1 0 】起着驱动噬菌体p h i 2 9 包装的马达作用 1 1 ，1 2 1 。 每个p r n a 分子包含两个功能域：第一个功能域( 位于# 2 3 9 7 位核苷酸) 参与分 子间的相互作用和接合 1 3 - 16 1 ，第二个功能域( 位于配对的5 3 ，末端) 参与p h i 2 9 马达的包装作用l l 川，而且去掉包装功能域不影响p r n a 分子间相互作用的特性， 例如在# 2 3 位核苷酸之前或者# 9 7 位核苷酸之后替换或者插入核苷酸不影响 p r n a 分子二聚体，三聚体和六聚体的生成【5 ，1 6 ，18 1 。因此，p r n a 分子的双链 螺旋状5 37 末端可以被用来携带外源分子序列。 我们研究发现将p r n a 分子上可以连接上各种小分子物质如与细胞表面受体 特异性结合的r n a a p t a m e r 、核酶、干扰r n a 、叶酸等组成一个嵌合体，这种 由p r n a 分子和治疗小分子组成的嵌合体既不影响p r n a 分子间多聚体的形成， 也不影响其所携带治疗小分子的功能【1 9 2 0 1 。本课题组构建了p r n a 分子与靶向 s u r v i v i n 的核酶和干扰r n a 分子的嵌合体，将靶向s u r v i v i n 基因的干扰r n a 和 核酶连接到p r n a 分子上，拟研究其在诱导肿瘤细胞凋亡中的效应。 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 材料 一、主要仪器设备 1 高速低温离心机( h e r a e u s 公司) 2 台式高速离心机( s i g m a 公司) 3 a b ip r i s m6 7 0 0r e a l t i m ep c r 检测仪( 上海枫林中加合资生物有限公司) 4 c 0 2 培养箱( 3 3 1 9 s n ，f o r m as c i e n t i f i c ，u s a ) 5 流式细胞仪( 美国b d 公司) 6 p c r 仪( b i o r a d 公司) 7 恒温摇床( 美国e d i s o n 公司) 8 分光光度计( p h a r m a c i ab i o t e c h ) 9 倒置荧光显微镜( 日本o l y m p u s 公司) 二、细菌、质粒与细胞株 1 菌株e c o l id h 5 a ( 本室保存) 2 p e g f p - n 2 质粒( 美国普渡大学郭培轩教授惠赠) 3 m c f 7 和h e l a 细胞( 华中科技大学同济医学院免疫学系冻存) 。 4 p r n a - 干扰r n a ，p r n a - 核酶嵌合体( 美国普渡大学郭培轩教授惠赠) 三、主要试剂及其配制 1 细菌培养所需试剂 ( 1 ) l b 培养基：在9 5 0 m l 双蒸水中加入蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c i1 0 0 9 ， 摇动溶解，用5 mn a o h 调p h 值至7 o ，补足双蒸水至1 0 0 0m l ，高压 ( 1 0 3 4 1 0 5 p a ) 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 ( 2 ) 卡那霉素阳性的l b 琼脂平板：将1 5 9 琼脂加入1 0 0 m l 配制好的l b 培养基 高压后冷却至6 5 左右，在无菌条件加入卡那霉素( 终浓度5 0 9 9 m 1 ) 混匀， 缓慢倒入平皿自然冷凝。 2 质粒d n a 和m r n a 提取纯化试剂 ( 1 ) 溶液i ：5 0 m m 葡萄糖 2 5m m i r i s h c l p h 8 0 1 0r a me d t a p h8 0 4 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 ( 2 ) 溶液i i ：i s d s0 2 nn a o h ( 3 ) 溶液i i i ：3m mk a c 2m mh a c ( 4 ) 异丙醇 ( 5 ) t e 缓冲液 ( 6 ) 7 0 乙醇无水乙醇， ( 7 ) r n a s e a 2 0 1 a g m l ( 8 ) 平衡酚p h 8 0 ( 9 ) 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ( 1 0 ) t r i z o l ( 美国g i b c o 公司) 3 细胞培养等所需试剂及其配制： ( 1 ) 细胞培养基d m e m ( d u l b e c c o sm c d i f i e de a g l em e d i u m ) ( g i b c o 公司产 品) ( 2 ) 脂质体l i p o f e c t a m i n e v m 2 0 0 0 为i n v i t r o g e n 公司产品 ( 3 ) 胎牛血清( g i b c o 公司产品) ( 4 ) 无血清培养基( o p t i m e d i u m ，为g i b c o 公司产品) ( 5 ) d m e m 培养基配制 d m e m 粉剂1 0g ，h e p e s2g ， n a h c 0 3 3 5g ， l 一谷氨酰胺0 4g ，加三 蒸水至1 0 0 0m l 溶解，调p h 值为7 0 ，过滤除菌，分装置4 c 保存。 ( 6 ) 0 2 5 胰酶 o 5m g 胰酶( 华美公司产品) ，加p b s 至2 0 0m l 溶解，调p h 值至7 4 ，过 滤除菌，分装置4 c 保存。 ( 7 ) o 1 5 m o l lp b s 缓冲液( p h7 2 7 4 ) n a c i8 0 9 ，k c l0 2 9 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 01 1 5 9 ，k h 2 p 0 4 0 2 9 ，加双蒸水至 1 0 0 0 m l 溶解，调p h 值至7 2 7 4 ，高压灭菌。 ( 8 ) a n n e x i n v p i 凋亡检测试剂盒( b d 公司) ( 9 ) r e v e r t a i d t mf i r s ts t r a n dc d n a s y n t h e s i sk i t ( f e r m e n t a s 公司) ( 10 ) q u a n t i t e c ts y b rg r e e nr t - p c r k i t ( q i a g e n 公司) 5 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 实验方法 一、g f p 表达质粒的扩增和鉴定 1 感受态细胞的制备 ( 1 ) 取8 0 c 保存的d h 5 e t 菌种，用一白金丝接种环直接蘸取菌液，在l b 琼脂 平板( 不含抗生素) 上划线，3 7 。c 培养过夜。 ( 2 ) 从3 7 ( 2 培养1 6 2 0 h 的平板上挑取单个菌落，接入2 m l l b 培养基的试管中， 于3 7 振荡培养过夜( 置摇床中，1 5 0 r r a i n ) 。 ( 3 ) 取5 0 i t l 上述菌液( o d 6 0 0 1 5 ) ，转入含2 4 m l l b 培养基的三角烧瓶中，3 7 c 振荡培养约3 h ( 至o d 6 0 0 o 2 ) 。 ( 4 ) 将培养物转入4 0 m l 离心管中，置冰上1 0 m i n ，然后于2 5 0 0 r m i n ，4 c 离心 1 0 m i n 。 ( 5 ) 弃上清，将细菌重悬于2 5 m 1 1 0 0 m m o l l c a c l 2 中，置冰浴2 0 m i n ，然后 15 0 0 0 f f m i n ，4 c 离心10 m i n 。 ( 6 ) 弃上清，将细菌重悬于o 5 1 m 1 1 0 0 m m o l l c a c l 2 中，置冰浴3 0 m i n 或过夜， 不要剧烈振荡试管，不要反复吹打细菌悬液。 2 质粒d n a 的转化 ( 1 ) 取2 个e p 管，设立阴性对照及实验管： 感受态细胞质粒d n a 阴性对照 2 0 0 1 实验管 2 0 0 1 a l 1 0 0 n g ( 2 ) 摇混匀后，置冰上3 0 m i n 。 ( 3 ) 4 2 热休克9 0 s ，迅速置冰上3 0 r a i n 。 ( 4 ) 加入不含抗生素的l b 培养基8 0 0 p 1 ，3 7 。c 2 0 0 r p m 振摇1 h 。 ( 5 ) 准备l b 平板：在事先制备好的l b ( k a r a + ) 培养基倒入平皿内，用无菌玻 棒将溶液均匀涂布于整个平皿表面，静置待所有液体凝固。 ( 6 ) 从每管取0 2 m l 菌液，分别加入以上平皿中，用无菌玻棒将溶液均匀涂布 于整个平皿表面，置3 7 温育过夜。 3 质粒的大量提取 6 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 ( 1 ) 将单个菌落接种于2 0 0 m l l b 培养基中，3 7 * ( 2 振荡( 2 0 0 r m i n ) 培养过夜； ( 2 ) 将培养物转入5 0 m l 离心管中，5 0 m l 管，室温离心2 5 0 0 r p m x 5 m i m ( 3 ) 弃上清，将离心管倒立，使上清流尽，用吸水纸将液体吸干： ( 4 ) 每管加5 m l s t e 溶液，悬浮细菌后转入5 0 m l 离心管( 1 管) ，室温离心 2 5 0 0 r p m x10 m i r a ( 5 ) 弃上清，加入2 m l 溶液i ，悬浮细菌； ( 6 ) 加入4 m l 溶液i i ，颠倒离心管数次混匀，水浴5 m i r a ( 7 ) 加入冰预冷溶液i i i ，充分混匀，冰浴1 0 m i n ，4 c 、5 0 0 0 r p m x l o m i n ( 8 ) 转移上清至另一5 0 m l 离心管，加入0 6 倍体积的异丙醇，充分混匀，室温 静置1 0 m i n ； ( 9 ) 1 5 0 0 0 r p m x l o m i n ，弃上清，加入等体积5 m 的l i c i ，充分混匀后，室温置 1 0 m i n ； ( 1 0 ) 2 5 0 0 r p m x l o m i n ，将上清转入另一5 0 m l 离心管中，加入等体积异丙醇，充 分混匀，室温4 0 r a i n ； ( 1 1 ) 2 5 0 0 r p m x l o m i n ，弃上清，加入2 0 0 i ，t l t e 缓冲液溶解沉淀，转入另一e p 管； ( 1 2 ) 加r n a s e a 溶液3 “1 ( 2 t g l a l ) ，混匀，3 7 温育3 0 m i r a ( 1 3 ) 加入等体积的1 6 mn a c i ，1 3 p e g 6 0 0 0 ，冰浴1 0 2 0 m i n ， 1 2 0 0 0r p m x 5 m i m ( 1 4 ) 吸弃上清，将沉淀溶于2 0 0 i ，t l t e 缓冲液中； ( 1 5 ) 加入等体积酚氯仿异丙醇，涡旋混匀，7 0 0 0 r p m x 3 m i m ( 1 6 ) 吸取上清，加入等体积氯仿异丙醇，涡旋混匀，7 0 0 0 r p m x 3 m i m ( 1 7 ) 吸取上清，加入2 倍体积的无水乙醇和o 1 倍体积的乙酸钠( p h 5 2 ) ，混 匀后置2 0 l 一2 h ； ( 1 8 ) 1 2 0 0 0r p m x l o m i n ，4 c ，真空泵吸净上清； ( 1 9 ) 每管加入1 m 1 7 0 乙醇洗涤一次，弃上清，将d n a 溶于适量无菌水中； ( 2 0 ) 用分光光度计测d n a 浓度及纯度； ( 2 1 ) 置2 0 保存备用。 7 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 二、p r n a 核酶( s u r v i v i n ) 、p r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) 嵌合体和g f p 质粒导入受体 细胞 1 细胞转染采用脂质体法 按l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 脂质体试剂使用方法说明，将p r n a 核酶( s u r v i v i n ) ， p r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) ，或者g f p 质粒和p r n a s i r n a ( g f p ) 分别导入肿 瘤细胞，同时设置对照。 2 从培养箱取出准备好的肿瘤细胞， 6 0 细胞帖壁。用l m l 无血清培养基 冲洗一次。每孔加5 0 0 p l 无血清培养基，置于3 7 c ，5 c 0 2 培养箱培养4 h 。 2 在无菌e p 管中制备下列溶液：溶液a ：将l p g 质粒d n a 或者0 5 p gr n a 分子溶于无血清培养基5 0p l 。溶液b ：将2 0p ll i p o f e c t a m i n e 溶于5 0 肛l 无 血清培养基中。合并溶液a 和溶液b ，轻轻混合，置室温2 0 m i n 。使 l i p o f e c t i n d n a 复合物形成； 3 吸干2 4 孔培养板中每孔培养基，吸取1 0 0 p l 脂质体d n a 或者r n a 混合 物依靠重力均匀滴加到每孔培养基中，轻柔晃动培养板混匀； 4 3 7 c5 c 0 2 培养箱培养6 h ，弃转染液，加入完全培养基，放3 7 c ，5 c 0 2 培养箱中继续培养。 三、r e a l t i m ep c r 检测p r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) 沉默s u r v i v i n 基因的表达 1 细胞中总r n a 的提取 ( 1 ) 将经处理过的2 4 - 孑l 培养板细胞去上清，每孔加入t r i z o l 溶液0 5 m l ，静 置5m i n ，吸入e p 管中。每管加入氯仿2 0 0 t l ，用手振摇1 5 秒。 ( 2 ) 4 c ，1 2 ，0 0 0r p m ，离- b 1 5m i n 。 ( 3 ) 取上清4 0 0 p , 1 ，加入等体积的异丙醇，混匀，2 0 c 放置3 0m i n 。 ( 4 ) 4 c ，1 2 ，0 0 0r p m ，离。g , 1 0r a i n 。 ( 5 ) 去上清，7 5 乙醇洗涤沉淀，离心，去净残余上清液。室温晾干。 ( 6 ) 5 0 i t ld e p c 处理过的三蒸水溶解沉淀，并用分光光度计测定每管r n a 浓度，备用。 2 逆转录反应 m r n a 逆转录成c d n a 分子按照r e v e r t a i d t mf i r s ts t r a n de d n a s y n t h e s i sk i t 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 产品说明完成。 ( 1 ) 将下列试剂在置于冰上的e p 管中混合： 总r n a 2 1 t g o l i g o ( d t ) 18 ( 5 0 1 t g m 1 ) 1 0 9 l 加d e p c 处理的水，使总体积至1 2 1 x l ，轻轻混匀，离心3 - 5 s e e ( 2 ) 把混合物置p c r 仪中7 0 c ，5 m i n ( 打开m r n a 的二级结构) ，取出迅速 置冰上，加入如下试剂： 5 b u f f e r 4 0 1 10 m md n t p 2 0 1 x l r i b o l o c k 刚核酸酶抑制剂( 2 0u r t l )1 0 1 t l 把混合物置p c r 仪中7 0 ，5 m i n ( 3 ) 加入1 0 p 1r e v e r t a i d 刑m m u l v 逆转录酶( 2 0 0 u 斗1 ) 此时总体积2 0 i _ t l 。 ( 4 ) 将混合物置p c r 仪中，设置条件如下：4 2 ，6 0 m i n ，7 0 ，1 0 m i n ， 迅速将产物置于- 8 0 冰箱备用。 3 荧光定量r t p c r 反应 反应体系：( 总体积2 0 i t 1 ) 模板11tl 3 吲物 o 5 1 5吲物051xl b u 岱玎1 0 x 5 1 t l m g c l 2 ( 2 5 m m ) 7 p , 1 d n t p1 0 m m l p , l s y b rg r e e n i1 0 x 1 1 d n a 聚合酶1 1 0 2 p 1 d d h 2 0 3 8 “l 扩增s u r v i v i nc d n a 引物： 正向引物：5 a a a g a gc c a a g a a c a a a a t r gc 一3 反向引物：57 g a ga g a g a ag c ag c ca c tg 耵a c 3 扩增人类基因组中p a c t i n 基因的引物： 9 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 正向引物：5 - t c a c c c a c a c t g t g c c c a t c t - a c g a 3 反向引物：5 - c a g c g g a a c c g c t c a t t g c c a a t g g 3 反应液混合后将反应板放入定量p c r 仪中，进行扩增反应。 反应程序如下： 首先9 4 0 c2 m i n 然后9 4 0 c 3 0 s e c ， 6 0 0 c3 0 s e c ， 7 2 0 c2 0 s e c 共4 0 个循环， 最后7 2 0 c1 0 m i n 。 结果分析：s u r v i v i n 的相对表达水平= 2 。c 协u i v i n 其中 a a c t s u r v i v i n = a c t s u r v i v i n - a c t l 3 - a c t i n c t s u r v i v i n = c t 阴性对照c t s u r v i v i n ( c t 阴性对照= 4 0 ) a c t i b a c t i n = c t 阴性对照- c t b a c t i n ( c t 阴性对照= 4 0 ) 为了证实反映产物的特异性，进行了熔解曲线分析：反应条件：6 0 。c ， t o u c h d o w n p c r ，每循环温度上升0 2 。c ，18 0 次循环证实产物的特异性 良好 四、流式细胞仪检测p r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) 和p r n a s i r n a ( s u r v i v i n ) 嵌合体 诱导肿瘤细胞凋亡 1 用冰冷的p b s 洗两遍，然后以l x l 0 6 m l 的密度重悬于1x b i n d i n gb u f f e r 中： 2 吸取1 0 0 i - t l ( 1 x 1 0 5 细胞) 溶液至5 m l 培养管中； 3 分别加入5 la n n e x i nv - f i t c 和5p lp i ；同时设立非染色组和单染组为对 照； 4 轻轻混匀后，室温放置( 2 5 0 c ) 1 5 m i n ，避光； 5 每管中加入4 0 0 t l1 x b i n d i n gb u f f e r ，l h 内上机测定。 6 采用流式细胞仪f a c sc a l i b u r ，发射波长4 8 8 n m ， 7 利用c e l l q u e s t 软件进行参数获取和资料分析。 五、流式细胞仪检测p r n a s i r n a ( g f p ) 嵌合体沉默g f p 的表达 1 用冰冷的p b s 洗两遍； 2 吸取2 m l 溶液至5 m l 培养管中； 3 轻轻混匀后，采用流式细胞仪f a c sc a l i b u r 检测 4 利用c e l l q u e s t 软件进行参数获取和资料分析。 l o 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 实验结果 一、p r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) 沉默肿瘤细胞中s u r v i v i n 基因的表达 为了检测这种治疗性p r n a 分子在肿瘤治疗中的有效性，p r n a 嵌合 体分子就必须能够抑制与肿瘤发生发展密切相关的基因。选择s u r v i v i n 基因 为靶基因，不仅因为它仅在肿瘤细胞中高特异性表达，还因为有研究证明通 r c 1 过抑制s u r v i v i n 基因表达能够诱导肿瘤细胞的凋亡卜j j 。 为了检测靶向s u r v i v i n 的p r n a 核酶嵌合体是否可以下调肿瘤细胞中的 s u r v i v i n 基因表达水平，利用脂质体转染的方法将其引导入人肿瘤细胞内， 通过r e a l t i m ep c r 检测结果表明，靶向s u r v i v i n 的p k n a 核酶嵌合体能够在 m r n a 水平显著降低s u r v i v i n 基因的表达。瞬时转染后4 8 h ，人乳腺癌细胞 m c f 7 中s u r v i v i nm r n a 水平为对照组以及突变组的1 6 左右( 表l ，图1 ) 。 而靶向s u r v i v i n 的p r n a 核酶嵌合体( 突变体) 对照组中s u r v i v i nm r n a 的 表达水平与未转染对照组相比没有显著差异。 由此得出结论，位于p r n a 载体分子上的核酶能够特异性抑制肿瘤细 胞中s u r v i v i n 表达，由此p r n a 分子和靶向s u r v i v i n 的核酶所构成的嵌合体 小分子可能具有诱导肿瘤细胞的凋亡的作用。 t a b 1p i 珊a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) i n h i b i t ss u r v i v i ne x p r e s s i o n n ，s a m p l en u m b e r a a c ti se x p r e s s e da sm e a n - 4 - s t a n d a r dd e v i a t i o n e ，r e l a t i v e e x p r e s s i o nl e v e l s 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 n or n a p r h m r t ( m u t ) p r n a r z l s u r ) f i g1c o m p a r i s o no fm r n a l e v e l so fd i f f e r e n tp r n ac h i m e r at r e a t e ds a m p l e s r e v e a l e db yr e a l - t i m ep c r r e a l - t i m ep c rw a sp e r f o r m e d ， a n dt h er e s u l t sw e r ea n a l y z e da sd e s c r i b e di n m a t e r i a l sa n dm e t h o d sa n dg e n ee x p r e s s i o nl e v e lw a sc o m p a r e dt ot h el e v e lo fg e n e e x p r e s s i o nf o u n di nn o n t r a n s f e c t e ds a m p l e ，a r b i t r a r i l ya s s i g n e dt h ev a l u e1 b a r s r e p r e s e n tt h ef o l d n u m b e ri n g e n ee x p r e s s i o no v e rt h ee x p r e s s i o nl e v e li n t h e n o n t r a n s f e c t e dm c f 一7s a m p l e s f o rs a m p l e st r a n s f e c t e dw i t hp r n a r z ( s u 0 ，t h e m r n al e v e ld e c r e a s e dt o16 o ft h a to ft h en o n t r a n s f e c t e dc e i l s ，2 4 o f p r n a r z ( m u t ) t r e a t e dc e l l s 二、倒置显微镜和流式细胞仪检测p r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) 诱导m c f 7 凋亡 转染p i 州核酶嵌合体后的人乳腺癌细胞，p r n a 核酶诱导瘤细胞凋亡效应 用倒置显微镜观察结果表明：培养孔中靶向s u r v i v i n 的p r n a 核酶处理过的绝大 部分细胞皱缩，并从贴壁生长变为悬浮状态提示细胞死亡，而p r n a 核酶突变分 子和未转染组细胞生长正常( 图2 ) 。 1 2 ia够一2比e my翟吩面叱 $ 十h # 女 目* e r 论文 l o w d o s e h i g h d o s e f i g 2 c e l lm o r p h o l o g yo fm c f - 7a f t e rt r e a t m e n to fp r n a r i b o z y m e ( s u r v i v i n ) c h i m e r a m c f - 7w e r et m n s f e c t e dw i t hp r n a ) s i r n a ( s u r v i v i n ) ，p r n a s i r n a ( m u t a n t ) a th i g ha n dl o wd o s eo n ed a ya r e rt r a n s f e c t i o n ，i m a g e sw e r et a k e nu s i n ga l li n v e r s e m i c r o s c o p e a n n c x i nv 和p i 取染后用f c m 检测其凋亡率。如图3 a 和3 b 结果所示， p r n a 核酶转染后的细胞与突变的p r n a 核酶分子转染组以及未转染组细胞相比 捌l 率显著增高。由此明见，靶向s u r v i v i n 的p r n a 核酶能够特异性的诱导肿瘤 细胞凋亡。 _。一 唧 _ 一 习孓 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 图3 a p i 鼍 p i 连 p i 图3 b 3 5 ( 冀) 3 0 暑2 5 口 一 盆2 0 “ 们1 5 一 曲 等1 0 5 0 p r n a v e c t o r g , t l = 啪 p r n a r z ( s u r v i v i n ) p r n a r z ( m u t a n t ) 暑 暑 冉 n 2 曼。 - n 簿 ，0 蕊 ：2 。i “ = = 二 。一! i 菇? -豢 雾 宴j警 。j ：；