（应用化学专业论文）海洋防污涂料及其主要成分的生物学性能研究.pdf

摘要 本论文针对传统的防污涂料防污性能评价方法的局限性，采用生物学方法， 建立了一种易操作、周期短、可定量、普适性好的防污性能室内评价方法。以 自然界典型细菌以及典型的海洋微藻为实验生物，系统地对新型防污剂、功能 树脂、防污涂层的生物学性能进行了快速定量的评价。该方法克服了传统海上 挂板实验因海区、季节不同而无可比性的缺点，同时大大缩短了评价周期。 对本实验室合成的吲哚衍生物、异噻唑啉酮衍生物等环境友好型防污剂的 生物学性能进行研究，并对其机理进行了探讨。结果表明，各防污剂均具有较 好的生物活性，其中吲哚衍生物抑菌性能相对大小为：c i g b p c i g b r g b p c i g m p b r g b r g m p 。对新月菱形藻毒性大d , j 1 顷序为：b r g - b p c 1 g b p c 1 g b r g b r g - m p c i g - m p 。异噻唑啉酮衍生物抑菌性能相对大小为：b o p d c i p h o e o p - d c i e o p d c i 。异噻唑啉酮衍生物跟参比化合物对三角褐指藻均具有 较好的抑制作用，其抑藻顺序为t b t 0 b o p d c i p h o e o p d c i e o p - d c i 0 i t k a t h o n 。 对含辣素衍生结构丙烯酸树脂及其单体的生物学性能进行研究，抑菌实验 及藻类生长抑制实验表明各单体均具有一定的抑菌活性，对藻类具有选择性抑 制作用。采用贴膜法对功能树脂抑菌活性进行研究，结果表明树脂的生物活性 与单体结构及其含量有关。含不同单体防污涂料海上挂板试验则证明实验室内 检测结果与海上挂板结果基本一致，表明实验室内快速定量测试方法是行之有 效的。 以新月菱形藻为实验生物，以藻的生长抑制率作为指标，对7 种国内外防 污涂料对藻类生长抑制作用进行了检测。结果表明，7 种防污涂料均具有较好 的抑制藻类生长的性能，随着在海水中浸泡时间的延长，涂层对藻的抑制效果 呈递减趋势，经藻液浸泡的防污涂层对藻的抑制效果最差。对各防污涂层室内 检测与海洋挂板结果比较，结果两者基本一致，表明实验室内挂板检测方法是 可行的。 关键词：防污剂，树脂，防污涂料，生物学性能 a b s t r a c t as o r to fl a bm e t h o d o l o g yw a se s t a b l i s h e di n t h i sd i s s e r t a t i o nt om a k ea l l i m p r o v e m e n to nt h el i m i t a t i o no ft r a d i t i o n a lm e t h o d s 1 r i l i sm e t h o d o l o g yh a st h e a d v a n t a g e so fs i m p l eo p e r a t i o n ，s h o r tp e r i o d ，q u a n t i t a t i v e ，w i d ea p p l i c a b i l i t yb y u s i n gb i o l o g i c a lm e t h o d si nt h el a b t a k i n gt h et y p i c a lb a c t e r i aa n dt y p i c a lm a r i n e a l g ae x i s t i n gi nt h en a t u r ef o rt h ee x p e r i m e n t a lo b j e c t s ，s y s t e m a t i cr e s e a r c h e sw e r e m a d et oe s t i m a t et h eb i o l o g i c a lp r o p e r t i e so fn e w - t y p ea n t i f o u l a n t f u n c t i o n a lr e s i n a n da n t i f o u l i n gp a i n t s n 圮b i o l o g i c a lp r o p e r t i e s a n dt h em e c h a n i s mo ft h ee n v i r o n m e n t f r i e n d l y a n t i f o u l a n ts u c h 勰i n d o l ed e f t v a f i v e sa n di s o t h i a z o l o n ed e r i v a t i v e sw e r es t u d i e d r e s u l t ss h o wt h a tt h ea n t i f o u l a n t sa l lh a v en i c ep e r f o r m a n c e ，a n dt h ea n t i b a c t e r i a l a c t i v i t yo ft h ei n d o l ed e r i v a t i v e si sa sf o l l o w s ：c 1 g - b p c i g b r g - b p c i g - m p b r g b r g m et 1 l eo r d e ro ft h e i rt o x i c i t yt on i t z s c h i ac l o s t e r i u mi s ：b r g b p c 1 g b p c 1 g b r o b r g - m p c i g - m p t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo ft h e i s o t h i a z o l o n ed e r i v a t i v e si sa sf o l l o w s ：b 0 p - d c i p h o e o p d c i e o p d c i i s o t h i a z o l o n ed e r i v a t i v e sa n dr e f e r e n c ec o m p o u n d sa l lh a v eg o o di n h i b i t i o nt o p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ，a n dt h eo r d e ri s ：t b t o b o p d c i p h o e o p d c i e o p d c i 0 i t k a t h o n 1 1 1 eb i o l o g i c a lp r o p e r t i e so fa c r y l i cr e s i na n dt h em o n o m e r sw h i c hc o n t a i n c a p s a i c i nd e r i v a t i v e sw e r es t u d i e d t h ea n t i b a c t e r i a le x p e r i m e n ta n da l g a eg r o w t h i n h i b i t i o nt e s ts h o wt h a tt h em o n o m e r sa l lh a v ec e r t a i na n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n d s e l e c t i v ei n h i b i t i o no fa l g a e e a s e dm e t h o dw a su s e dt o s t u d yt h ea n t i b a c t e r i a l a c t i v i t yo ft h er e s i n s r e s u l t ss h o wt h a tt h e yh a v eac o r r e l a t i o nw i t l lt h es t r u c t u r eo f t h em o n o m e r sa n dt h e i rc o n t e n t a n dt h er e s u l to fr a f te x p o s u r et e s t so na n t i f o u l i n g p a i n t sw i t hd i f f e r e n tm o n o m e r sa r eb a s i c a l l ya c c o r dw i t ht h e1 a bm e t h o d s w h i c h p r o v e st h el a br a p i dq u a n t i t a t i v et e s t i n gm e t h o d o l o g ya r ee f f e c t i v e t a k i n gt h en i t z s c h i ae l o s t e r i u mf o re x p e r i m e n t a lo b j e c t ，t h ea l g a eg r o w t h i n h i b i t o r ye f f e c t so fs e v e nd o m e s t i ca n da b r o a da n t i f o u l i n gp a i n t sw e r ed e c t e c t e d ， u s i n gt h ei n h i b i t i o no fa l g a eg r o w t hl a t ea sa ni n d i c a t o r n er e s u l t si n d i c a t e dt h a t s e v e na n t i f o u l i n gp a i n t sa l lh a v eo b v i o u si n h i b i t i o no na l g a eg r o w t h 1 1 l ei n h i b i t o r y e f f e c t sh a v eat e n d e n c yt od e c r e a s e a st h em a r i n a t i n gt i m ee x t e n d e d t h ep a i n t st h a t d i p p i n gi nt h ea l g a es o l u t i o nh a v et l l ew o r s ti n h i b i t o r ye f f e c t s t h ea c c o r d a n c eo f t h e r a f te x p o s u r et e s t sa n dt h e l a bo n e ss h o wt h a tt h er a f te x p o s u r et e s t si n d o o ri s f e a s i b l e k e y w o r d ：a n t i f o u l a n t ，r e s i n ，a n t i f o u l i n gp a i n t s ，b i o l o g i c a lp r o p e r t i e s 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含未获得! 注! 翅超直基丝益蔓挂型主蛆 的! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文储繇立鳓签字隰严j 月；日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫摧等复制手 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期：沙) 7 年月 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 象矽毳 引日 导师签字：豸，阢 签字目期：加刁年_ l - j l 电话 邮编 刃日 中国海洋大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 防污背景 海洋占地球表面积的7 1 ，蕴藏着无穷的自然资源，如矿物资源、生物资 源、化学资源、旅游资源、空间资源等。在目前陆地资源尤其是不可再生资源 日益枯竭的情况下，大力开发海洋资源对新能源的获得意义重大。与海洋相关 的运输业、养殖捕捞业、海上矿产开发、石油化工等产业是世界经济领域最具 开发潜力的部分，国外己把“海洋工程”列为“第四次产业革命”的主要内容之。 然而当人们兴致勃勃的向海洋进军，对这片基本未开发的疆土寄予殷切希望时， 又不得不正视一个严峻的事实海洋生物污损。 海洋污损生物也称海洋附着生物( m a r i n ef o u l i n go r g a n i s m ) ，是生长在海洋 水下设施表面和船底的动物、植物和微生物的总称。海洋生物的附着是浸没到 海水中的自然或人造表面上附着的细菌、海藻、无脊椎动物等生长的结果【1 1 。 各种海洋附着生物如藻类、水螅、贻贝、牡蛎、藤壶、海鞘等 2 1 无时无刻不在 对人类进行着挑战。海洋污损生物附着于船底，会增加航行阻力、降低船速、 多耗燃料：附着于海洋仪器上，会导致仪器信号失真、性能下降；附着于海洋养 殖网具。会造成堵塞网眼、降低海水交换效率，导致养殖鱼贝类发育不良甚至死 亡；附着于桥梁、石油平台、管线等其他水下设施，也会加速对材料的腐蚀破 坏，缩短使用寿命【2 】o 海洋生物附着带来的损失难以精确计算，污损生物生命力之坚韧，将使污损 问题成为人类征服海洋的一个难以逾越的障碍。因此，随着对海洋资源的深入 探索开发，生物污损带来的问题也日益引起人们的关注，促使人们不断采取各 种措施来防治污损生物的附着与生长【3 】。 海洋生物污损的防治方法多种多样，目前国内尚无统一的分类标准。主要 的防污方法包括涂刷防污涂料、向海水中投加毒料、电解海水生成次氯酸盐、 电解重金属、人工或机械清除、过滤或加热海水、采用防污材料制作结构物、 导电涂膜法f 4 1 等等。不同的防污方法( 或技术) 都有一定的局限性。从目前来看， 中国海洋大学硕七学位论文 8 0 年代以后尽管我国在海洋防污涂料方面有一些投入和支持，相关的研究开发 取得了一定进展，但是在防污涂料技术不断成熟和空前大发展的这个时期，国 内没有开发出产业化的产品。而且与国外相比，由于我国在相关基础材料的品 种和性能研究的落后而使防污涂层整体上的技术差距越来越大，特别是针对可 取代有机锡防污涂料相关的新型合成树脂、防污剂和无锡自抛光防污涂料的研 究几乎是空白，严重制约了我国海洋防污涂层技术的水平提高和应用。同时， 对于防污涂层及防污剂机理剖析、生物学性能等方面的研究也处于停滞状态。 1 3 生物学性能研究现状 生物学性能研究主要用于比较不同化学物质对同一种试验生物的相对毒性 或不同种生物对相同化学物质的相对敏感性。海洋中约有4 0 0 0 5 0 0 0 种污损生 物。其中半数以上浮游在海岸和港湾处，这些生物生长在船底、浮标、输水管 道、冷却管道、沉船、海底电缆、木筏、浮子、浮桥和网具上，除微生物外， 植物性生物约6 0 0 种，动物性生物约1 3 0 0 种，常见的有5 0 1 0 0 种。常见的主 要污损生物有：藻类、水螅、外肛动物门、龙介虫、双壳类、藤壶和海鞘等哺1 。 目前海洋防污涂料的生物学性能研究主要是针对海洋防污涂料中防污剂和树脂 对海洋常见污损生物的生物学毒性的研究，其中对微生物粘膜、藻类、贻贝、 藤壶的研究比较多。 l - 3 1 微生物粘膜 物体浸没在海水中后，首先是有机碎片黏附在表面上，形成一层薄膜，这 层膜改变了物体表面静电荷和润湿度等性质，为微生物附着、繁殖和形成微生 物膜建立了发展基础【9 j 。微生物粘膜主要由以下几部分组成：微生物以及自身 产生的粘性胶质、无机颗粒、晶状沉淀和腐蚀产物【1 0 】。 海洋肪污涂料及其主要成分的生物学性能研究 图1 - 1 微生物粘膜形成和发展示意图【j i j 在微生物膜形成的最初阶段，细菌大都单个分布在表面上，并且它们大都 是异养细菌 9 1 。当附着的细菌继续繁殖和分泌粘性物质时，这时生物膜就连成 一片且厚度不断增加。细菌通过蛋白质样的附属物即鞭毛附着在物体表面上， 一旦鞭毛固定在表面上，细菌就很难从表面脱落。生物膜附着以后，就会分泌 胞外分泌物或黏膜，随着时间的延长，浮游细菌和非生物离子也被吸附在生物 膜中，于是生物膜变成一个越来越复杂的群落。随着生物膜厚度的增加，水体 中国海洋大学硕士学位论文 中溶解的气体及营养物质到达金属基体表面就会变的越来越困难。膜内靠近固 体表面的某些微生物无法得到应有的养料，最后就会逐渐死亡。此时生物膜的 基层附着力就会变弱，水流的冲刷就会使得某部分生物膜脱落，裸露出金属基 体。然后新的微生物又开始重新附着生长繁殖，逐渐形成新的微生物膜。即使 外界环境相对稳定，微生物膜的这种不稳定性也会出现，因此生物膜实际上处 于一个不断变化更新的状态。微生物膜成熟时，就会产生一些酶和蛋白质。它 们与多糖反应生成复杂的高分子聚合物。因此成熟的生物膜要比新鲜的生物膜 难以去除。研究表明膜的生长主要是靠膜内细菌的繁殖而不是浮游生物的附着 1 2 1 。 微生物粘膜的形成对大型附着生物幼虫的附着和变态有重要作用，其中多 数种类的海洋细菌能促进幼虫的附着，少数细菌能抑制幼虫附着。多年来，人 们对微生物粘膜与大型附着生物的附着之间的关系进行了深入的研究。许多学 者从附着细菌中提取出一些能促进大型生物幼虫附着的物质。y o u n g 等【”1 发现 食用牡蛎幼虫的附着变态对微生物粘膜有很强的依赖性。w e i n e r 分离到一株海 洋细菌( l s t ) ，它产生的多糖化合物对牡蛎幼虫的附着、变态有很强的吸引和 诱导能力1 1 4 】。有些附着细菌可阻碍幼虫的附着，纪尚伟等从青岛港钢板桩上分 离得到的硫杆菌，在代谢过程中可产生硫酸，能抑制大型生物的附着，用于无 毒防污涂料的研究中。j a m e s 等从具有被囊的玻璃海鞘( c i o n ai n t e s t i n a l i s ) 表 面分离到一株能形成粘膜的海洋细菌d 2 ，它能产生一种具有抗菌活力的1 9 0 ，0 0 0 道尔顿的蛋白质，同时也具有抑制海洋无脊椎动物及藻类生长的作用。另外， 对各港湾海区微型及大型附着生物群落的形成特点和演替趋势进行研究，可为 防污研究提供基础资料，有利于有效控制大型生物附着 1 5 , 1 6 l 。付玉斌”】研究了 氧化亚铜防污漆、防锈漆、钢片和玻片4 种浸海材料表面生物粘膜中异养细菌 的的演化，结果表明防污漆、防锈漆表面异养细菌的量多于钢片和玻片，而种 类则较少。高运华【1 8 】等研究了防污漆表面细菌粘膜的组成，并筛选菌株制成人 工细菌粘膜验证其对污损生物的附着影响作用，结果制成的人工粘膜在一定时 间内可以进行生物污损的防除。由于海洋附着生物种类繁多，作用方式多种多 样，要弄清微生物粘膜与附着生物之间的作用规律并解决生物污损问题，还有 很长的路要走。 海洋防污涂科及其主要成分的生物学性能研究 1 3 2 藻类 藻类广泛存在于各种天然水体中，种类繁多、个体小、生长繁殖迅速、对 毒物的毒性敏感。它长时间在水体中生长，能较好地反映有害物的综合效应。 同时，它又是水生态系统中物质循环和能量流动中的最基础环节，是水体的初 级生产力之一，实验室内培养也比较容易，方法简便，试验周期短，因此是研 究水生生态毒理学很好的也是必不可少的材料之一【嘲。 有害的化学物质进入水体，藻类的生命活动将会受到影响，生物量也会发 生改变。通过测定藻类的生物量，可评价有害物质对藻类生长的作用，反映对 水体中初级生产营养级的影响以及对整个水生生态系统可能产生的综合环境效 应。 国内有很多人做过藻类方面的研究，如：张硕慧等【2 0 1 研究了异噻唑啉酮在 海水中的灭藻效应，发现其在较低浓度下对海洋单细胞藻有较高的杀灭效应。 洪爱华等f 2 1 】研究了异噻唑啉酮对棕榈藻的抑制效果，发现藻细胞生长到指数生 长前期时，用药浓度为o 3 m g a _ ，就具有较好的除藻效果。 陆光华等测定了苯酚、苯胺及其衍生物对斜生栅列藻的急性毒性，研究它 们对我国第二松花江的污染2 2 1 。唐学熙等研究了蒽对扁藻和盐藻的毒性效应， 探讨海上油污染对海洋生态系统的破坏和海洋生物资源的影响口3 1 。王朝晖等研 究了丙烯酸及3 种丙烯酸酯类物质对鱼类、藻类及水生甲壳类的毒性，探讨有 毒赤潮藻类棕囊藻所产生的这类物质对海洋生物及海洋环境的影响 2 4 1 。徐明德 等口5 1 研究了有机锡对金藻的毒性效应，并探讨了有机锡对海洋微藻致毒方式及 机理。认为有机锡化合物具有较高脂溶性易进入细胞膜，并在细胞组织中累积， 影响膜上物质正常传递而产生强毒性。 1 3 1 3 贻贝 贻贝属于软体动物f - i ( m o l l u s c a ) 瓣鳃纲( l a m e l l i b r a n c h i a ) 贻贝目 ( m y t i l o i d a ) 贻贝科( m y t i l i d a e ) 贻贝属( m y t i l u s ) ，是旅顺、大连、烟台和青 岛沿海的主要污损生物。该种是冷水种，也广泛分布在欧美温带海域，并且是 该海域很突出的管道污损生物，在温热带、热带海域则没有附着【7 1 。 贻贝依靠足丝附着在坚硬的基体上，这些足丝是由足伸展到足丝器官所产 生的。最初作用是将后期幼虫安全地附着在基体表面，然后经过变态成为成体 中国海洋大学硕士学位论文 形态。附着基面积随贻贝的生长而增加，直接受基材表面性能的影响，急性大 的表面具有较小面积的附着基【2 6 1 。贻贝足丝对附着物表面条件非常敏感，附着 物表面性状变化对足丝的附着与否有着重要的影响。因此，可以用贻贝足丝附 着的敏感性研究来评价防污剂或防污涂层的防污性能。 j g r a n tb u r g e s s l 2 7 1 用贻贝的附着试验来评价防污涂层的防污效果。利用贻贝 具有再附着的特性，他在盛有营养液的玻璃缸中挂入涂有防污涂料的试板及对 照试板，将室内培育的贻贝投入，培养一段时间后，测定贻贝对试板的附着率。 通过对比对照试板和所需检测试板的附着率，来检测防污涂层的防污效果。 y h a y a s h i 和w m i k i t 2 8 1 将天然提取物配成溶液，通过测试溶液对贻贝附着的影 响来筛选防污活性物质。a y a k on i s h i d a 2 9 1 等人用不同的硅偶联剂改造了玻璃表 面后，通过对贻贝在不同表面上的附着率及个体足丝的附着情况，来研究不同 偶联剂处理的玻璃表面对贻贝附着的影响。 国内对贻贝的研究主要是从经济养殖对象的角度进行的。蔡难儿在6 0 年代 早期研究了贻贝的人工育苗及其幼虫培养【3 0 】。 1 3 4 藤壶 藤壶( b a r n a c l e ) 又称为“马牙”或“蚵沏仔”属于节肢动物门( a r t h r o p o d a ) 甲壳动物亚f ( c r u s t a c e a ) 蔓足纲( c i r r i p e d i a ) l 弱胸目( t h o r a c i c a ) 藤壶亚目 ( b a l a n o m o r p h a ) 。由于其特殊的形态结构、生活史和种群生态，已成为世界上 分布最广、数量最多的海洋污损生物之一；也是对船底危害最大，出现频率最 高的污损生物；同时又是管道污损生物中重要的组成部分。 藤壶的种类很多，全世界有1 0 0 0 多种，全为海产。藤壶成体营固着生活， 它们成群地附着在岸边潮问带或潮下带的硬物上，例如船体、浮标、桥墩、码 头、网箱及网具上。我们平时看到的是藤壶的壳板部分，形状象小的火山。底 部是藤壶的柄部，盘状，为着生器官，称为吸板。而它的柔软身体则藏在壳板 和吸板围成的保护罩中【3 1 】。藤壶的大量附着，可以显著增加船舶航行的阻力， 导致航速降低和燃料消耗的增加：或者附着于管道中，缩小管道的内径，甚至 完全堵塞管道。藤壶的附着还可以加速被附着金属的腐蚀、使海中的各种仪器 仪表和传动设备失烈2 1 。在水产业方面，藤壶在网箱、网具上的附着不但造成 网箱、网衣堵塞，减少海水的流动交换，导致养殖环境变差，造成养殖动物疾 海洋防污涂料及其主要成分的生物学性能研究 病多发；而且使网箱网衣阻力增大，易造成漂移及大潮汛和台风期的鱼体擦伤。 此外，藤壶的附着对牡蛎、珍珠贝等贝类养殖危害极大：如果牡蛎采苗时遇到 大量藤壶附着，会占据牡蛎的附苗器，与牡蛎争夺生存空间和饵料，妨碍牡蛎 的正常生长甚至造成死亡；藤壶对珍珠贝养殖的危害除与牡蛎有些相似外，还 间接影响珍珠贝的钙质代谢，降低珍珠的质量【3 2 1 。因此，对藤壶的一系列研究 就显的尤其必要。 图1 2 藤壶的无节幼虫( i 期到期)图1 3 藤壶生活史 藤壶是靠体内分泌的胶体附着在基体表面上的这种附着是永久性的，藤壶 不同生长阶段的附着力不同。成体藤壶在其他浮游生物上分离出一个幼虫形态 的无节幼体，该幼体在浮游生物体上吸取养分并蜕变成介虫形幼虫。介虫形幼 虫在固定前用触角附着接触表面，这种附着容易移动，故称之为暂时粘接；介 虫幼虫发现合适的表面就永久定居，暂时粘接会变成永久粘接，而介虫幼虫会 变为壳状幼体。幼体藤壶在基体表面分泌出幼体胶，使附着更牢固。幼体变为 成体后，成体胶会在定居4 0 天左右分泌到基材上。藤壶刚刚分泌出的胶透明无 粘性，主要由蛋白质、碳水化合物和灰尘组成，通过毛细管作用渗透到基材的 空隙中，6 小时内聚合成不透明的橡胶块。这种胶体与基材表面发生分子与离 子的粘接，聚合过程使该胶体具有较大的内聚强度和抗生物降解性3 3 1 。 s a s i k u m a r 3 4 1 等通过研究比较多种海洋无脊椎动物对重金属、石油、碳水化 合物、清洁剂及各种有机化合物敏感性后，认为藤壶幼虫是最合适的防污试验 材料。 中国海洋大学硕士学位论文 s e b a s t i a n og e r a c i 和m a r c of a i m a i l 在实验室内用藤壶幼虫对传统防污剂的 防污性能和环境潜在影响性进行了检测。他们采用了两种方法： ( 1 ) 使在实验室培育好的幼虫与所需检测的防污剂接触，测定7 2 小时后的 变态率。 ( 2 ) 在不同时间间隔加入防污剂坝4 定藤壶的死亡率。由于所选用的实验 生物是成体藤壶，死亡的精确时间无法从外表看出来，因而他们采用微热量测 定来确定藤壶死亡的精确时间。微热量测定是记录生物体细胞所含热量的变化 的一种技术1 3 5 1 。 s e b a s t i a n og e r a c i 和m a r c of a i m a i l 还在实验室内采用藤壶幼虫在有效性检 测的基础上加入毒性试验，得到了e c 5 0 7 2 和l c l 2 4 由下式得到环境影响因子 ( e 。1 1 ) 。 e 1 1 = 1 - - e c 5 0 7 2 l c l 2 4 e c 5 0 7 2 ：经过7 2 小时，防污剂抑制5 0 幼虫变态的浓度 l c l 2 4 ：经过2 4 小时，防污剂抑制1 幼虫变态的浓度 环境影响因子可用来衡量防污剂对环境的影响。e 1 1 越小，代表e c 5 0 7 2 与l c i “越接近，因而对环境影响越小。反之亦然。 国内吴尚勤等在6 0 年代初期就对布纹藤壶的生活史进行了研究，为以后从 事这方面的研究打好了基础3 。 史航等【3 7 】研究报道了影响藤壶附着的因素主要有被附着物的表面能、环境 光线与颜色、海水理化因子、网目大小。他们认为被附着物表面越粗糙、表面 能越高越利于附着；黑暗环境、橘色或绿色表面利于附着；夏季、海水温度为 1 8 、盐度为1 9 o 2 4 o 、p h 值7 9 8 4 利于附着。 周媛等f 3 s 】以青岛常见的东方小藤壶为实验材料，以三种重要污染物c u 、 z n 、c d 作为胁迫因子，探讨了重金属对藤壶幼虫生长的影响。田斌【3 9 1 研究了 几种异噻唑啉酮衍生物对东方小藤壶幼虫生长的影响，通过其l c 5 0 值得出随着 衍生物极性的增强，对东方小藤壶i i 期幼虫的致毒作用减弱。 1 4 海洋防污涂料生物学性能研究的目的及意义 传统的评价防污涂料防污性能的方法主要有两种：一种是通过测定防污涂 料的有效成分( 如c u 2 + 、s n ) 渗出率间接反映防污性能，该方法只适用以“毒 海洋防污涂料及其主要成分的生物学性能研究 料”渗出为防污手段防污涂层防污性能的评价，不适用于以涂层表面特殊性能为 防污手段防污涂层的评价，因而该法使用受限、普适性差；另一种是通过实海 挂板直接评价防污涂层的防污性能，该方法实验周期长、风险高( 完全依赖海 上挂板，海试中易失落或破坏) 且由不同海区、不同季节的生物多样性造成了 不能定量评价的问题。因此，传统评价方法难以满足基础防污材料开发初期工 作量巨大的筛选择优工作。 本文利用室内生物学方法对防污涂料及其主要成分防污剂、功能树脂的有 效性和持续性进行评价，有利于深入探讨防污涂料的防污机理，从而加速防污 涂料的开发过程。目前国内外专门针对防污涂料生物学性能的研究鲜有报道。 更没有形成系统的评价方法。因此，建立一种容易操作、实验周期短、可定量 的、普适性好的室内防污性能评价方法是很有必要的。 中国海洋大学硕士学位论文 第二章吲哚衍生物生物学性能研究 近年来，以有机重金属和具广泛毒性杀虫剂为防污剂的传统防污涂层对海 洋环境造成的巨太危害越来越受到人们的关注，因此环境友好型防污剂的开发 具有现实意义。研究表明，海洋有机物如海藻、珊瑚虫、海绵等可以产生具有 防污活性的次级代谢产物，该类化合物具有对人体及其它非目标生物无害、对 环境无污染、生物可降解性等特点，属于无毒防污剂。因此，研制开发海 洋天然产物防污剂己成为获得高效无毒防污剂的重要途径之一。目前，人们已 对多种生物进行了研究，获得了一系列具有防污活性的天然产物，包括有机酸、 无机酸、内酯、萜类、酚类、甾醇类和吲哚类等天然化合物【4 1 1 。 天然吲哚类防污剂包括吲哚3 甲醛系列和2 ，5 ，6 三溴1 甲基芦竹碱( t b g ) 。 t b g 是2 0 世纪9 0 年代由k o n y a 等 4 2 1 从苔藓虫中分离出来的2 ，5 ，6 三溴1 甲基芦 竹碱( t b g ) 。这两类化合物均对藤壶和贻贝有较强的防污活性，其中6 溴吲哚3 甲醛和2 ，5 ，6 一三溴一1 一甲基芦竹碱对藤壶幼虫的e c 5 0 分别为5 l 咖l 和1 肛g ，m l 【4 3 1 。 日本学者将2 ，5 ，6 - 三溴1 甲基芦竹碱跟三丁基氧化锡( t b t o ) 作比较，发现其 防污活性是t b t o 的2 倍。其类似物5 ，6 二氯1 甲基芦竹碱、5 , 6 二氯芦竹碱的防 污活性分别是t b t o 的4 倍和1 5 倍。吲哚类化合物如此高效的防污活性正满足了 人们对新型防污剂的要求。 本章对实验室内合成的六种吲哚衍生物5 溴芦竹碱( b r g ) 、5 , 6 二氯芦竹 碱( c i g ) 、3 - ( 5 一溴- 3 一( ( 二甲氨基) 甲基) 一1 一吲哚基) 丙酸丁酯( b r g b p ) 、3 - ( 5 ，6 二氯一3 一( ( 二甲氨基) 甲基) 一1 一吲哚基) 丙酸丁酯( c i g b p ) 、3 - ( 5 溴- 3 ( ( 二甲氨基) 甲基) 一1 一吲哚基) 丙酸甲酯( b r g m p ) 、3 - ( 5 ，6 二氯3 ( ( 二甲氨基) 甲基) 1 吲哚 基) 丙酸甲酯( c i g - m p ) 生物学性能进行评价，为其在防污涂料中的应用提供 必要的实验依据。 2 1 实验材料 2 i 1 实验仪器与设备 超净工作台 苏州净化设备有限公司 振荡培养箱h z q x 1 0 0 ，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 生化培养箱w m k 0 8 型，山东潍坊医疗器械厂 海洋防污涂料及其主要成分的生物学性能研究 冷藏箱 生物显微镜 可见分光光度计 点热恒温鼓风干燥箱 微型旋涡混合仪 可调式移液器 血球计数板 牛津杯 三洋高压灭菌锅 i k a 加热板 体式显微镜 紫外可见分光光度计 人工气候箱 2 4 小时程控定时器 2 1 2 试剂 b c d 1 6 6 g 型，海信( 北京) 电器有限公司 d m 5 0 0 0 b ，德国l e i c am i c r o s y s t e m sw e t z l a rg m b h 7 2 3 型，山东高密彩虹分析仪器有限公司 d h g 9 1 4 0 a 型，上海精密实验设备有限公司 w h 一1 型，上海泸西分析仪器厂 热电( 上海) 仪器有限公司 苏州丹阳市光学仪器厂 上海东方药品科技实业有限公司 m l s 3 7 5 0 型，日本s a n y oe l e c t r i cc o l t d c - m a gh p 7 ，广卅i 仪科实验室技术有限公司 m z l 6 ，德国l e i c am i c r o s y s t e m sw e t z l a rg m b h u 一2 8 0 0 ，h i t a c h ih i g h - t e c h n o l o g i e sc o r p o r a t i o n t o k y oj a p a n l r h - 2 5 0 g si i ，广东省医疗器械厂 s b 6 7 1 7 - - i 型，上海海申塑料电器厂 乙醇( 分析纯，烟台三和化学试剂有限公司) ，n ，n 二甲基甲酰胺( 分析纯， 天津博迪化工有限公司) ，丙酮( 分析纯，国药集团化学试剂有限公司) ，四氢 呋喃( 分析纯，天津博迪化工有限公司) ，氢氧化钠( 分析纯，天津博迪化工有 限公司) ，氯化钠( 分析纯，天津博迪化工有限公司) ，蛋白胨( 生化试剂，北 京奥博星生物技术有限责任公司) ，营养琼脂( 北京陆桥技术有限责任公司) ， 牛肉浸出粉( 北京陆桥技术有限责任公司) ，硅酸钠( 分析纯，天津市博迪化 工有限公司) ，柠檬酸铁( 分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司) ，硝酸钠 ( 分析纯，天津市博迪化工有限公司) ，硝酸铵( 分析纯，天津市化学试剂批发 部监制) ，尿素( 分析纯，淄博化学试剂厂) ，磷酸二氢钾( 分析纯，中国山东 兖州化工厂) ，维生素b 1 2 注射液( 开封前锋制药厂) ，维生素b l 注射液( 山 东省方明药业有限公司) 中国海洋大学硕士学位论文 2 1 3 供试菌种、藻种及其来源 金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l o 亚心型扁藻( p l a t y m o n a sc o r d i f o r m i s ) 湛江叉鞭金藻( d i c r a t e r i az h a n f i a n g e n s i s ) 、 三角褐指藻( p h a e o d a c t y l l l mt r i o r r u t u m ) 新月菱形藻( n i t z s c h i ac l o s t e r i u m ) 、旋 链角毛藻( c h a e t o c e r o sc u r v i s e t u s ) 。在分类学上金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳 性菌，大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，亚心型扁藻属于绿藻门，湛江又鞭金藻属 于金藻门，三角褐指藻、新月菱形藻、旋链角毛藻属于硅藻门。 ( 以上菌种由中国海洋大学海洋生命学院微生物实验室提供，实验藻种由 水产学院藻种室提供并在本实验室扩种培养。) 2 1 4 培养基 牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，氯化钠5 9 ，水1 0 0 0 m l ， p h 值7 o 7 2 ，1 2 1 灭菌2 0 分钟，置于冰箱中备用 牛肉膏蛋白胨固体培养基：营养琼脂3 3 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 值7 0 7 。2 ，1 2 1 灭菌2 0 分钟 2 1 5 受试化合物 5 溴芦竹碱 b r g 5 , 6 一二氯芦竹碱 c i g 3 一( 5 一溴3 一( ( 二甲氨基) 甲 b r g b p 基) - 1 - 吲哚基) 丙酸丁酯 3 一( 5 ，6 一二氯- 3 一“二甲氨基) 甲 c l g b p 基) 1 吲哚基) 丙酸丁酯 3 ( 5 - 溴一3 - ( ( 二甲氨基) 甲 b r g m p 基) l - 吲哚基) 丙酸甲酯 眵扎h h a 可扎、c h 。a 一字一孛一c 心 一字一宇一 海洋防污涂料及其主要成分的生物学性能研究 3 一( 5 ，6 一二氯一3 - ( ( 二甲氨基) 甲 基) 一1 - 吲哚基) 丙酸甲酯 2 2 实验方法 2 2 1 抑菌实验 2 2 1 1 菌种保藏 将菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，在( 3 7 士1 ) 下培养2 4 h 后， 置于0 。c 5 c 环境下保藏( 不得超过1 个月) ，作为斜面保藏菌。 2 2 1 2 菌种活化 将斜面保藏菌转接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，( 3 7 4 - 1 ) 下培养2 4 h ， 得到纯化的单菌落。挑取单菌落接种于斜面培养基使其活化。试验时应采用连 续转接2 次后的新鲜细菌培养物。 2 2 1 3 菌悬液制备 将菌种充分活化，用接种环刮取斜面培养基上的新鲜菌株接种到无菌液体 培养基中，培养一段时间，用无菌生理盐水依次1 0 倍稀释至所需浓度。 2 2 1 4 抑菌圈测定 采用常规杯碟法 4 4 1 ，用可调式移液器移取2 0 0 1 t l 适宜浓度的菌悬液于无菌 的琼脂平板上，均匀涂布。5 m i n 后，将已灭菌的直径6 m m 的牛津杯轻轻垂直置于 其上，并向杯中加入2 0 0 1 t l 受试化合物配制液，小心平鹭于恒温培养箱中培养 2 4 h 。在菌体生长的同时，试液均匀扩散到琼脂平板上，抑制其周围的微生物生 长，从而产生不长菌的透明抑菌圈。用游标卡尺测定抑菌圈直径大小。为确保试 验数据准确性，每隔一定角度测不同方向的d 值最后取其平均值，每个化合物傲 三个平行样【4 5 1 。 2 2 1 5 最小抑菌浓度( m i c ) 测定 采用试管二倍稀释法 4 6 1 ，取加有2 m l 液体培养基的灭菌试管，以不加受试化 合物而接种菌的试管为阳性对照。以不加受试化合物也不接种菌的试管为阴性对 照。药物初始浓度为l m g m l ，依次二倍稀释，混合均匀。分别向各试管中加入一 定浓度的菌悬液2 0 0 江，使最终菌液浓度为1 0 4 1 0 5 c f u m l ( c f u 即菌落形成单位， l c f u 是指经培养后在琼脂平板上形成的一个单菌落) 。震荡培养2 4 h 后，肉眼观察 阳性对照管有菌生长( 混浊) ，阴性对照管无菌生长( 透明) 1 4 7 1 。确定待测物对 1 4 - 中国海洋大学硕士学位论文 两种试验菌株的最小抑菌浓度并依次测定每支试管中菌液的吸光度值，作受试化 合物浓度一吸光度值曲线。 2 2 2 藻类生长抑制实验 2 2 2 1 藻液的培养 海水取自青岛鲁迅公园附近海滨，经玻璃砂芯漏斗过滤、煮沸消毒，冷却 后配成培养液，培养液配方见表2 1 。藻液在人工气候箱内培养，光照强度为 3 0 0 0 4 0 0 0l u x ( 1 u x 为照射到单位面积上的光通量1 l u x 大约等于1 烛光在1 米距离的照度) 左右，光暗比为1 2 ：1 2 ，温度为2 1 士1 ，p h 为8 0 士o 1 。进行 重复实验，或比较不同化合物对某种藻的相对毒性时，为了减少实验误差和实 验结果便于比较，实验过程应使用藻龄相同的藻种，且吸光值应介子0 0 5 到o 8 之间。 表2 - 1 营养液配方( w ，v ) 藻种培养液配方 亚心型扁藻 硅藻 湛江叉鞭金藻 硝酸铵4 磷酸二氢钾o 4 尿素1 8 柠檬酸铁o 0 4 5 硝酸铵4 磷酸二氢钾o 4 尿素1 8 柠檬酸铁0 0 4 5 硅酸钠2 硝酸钠6 磷酸二氢钾0 4 尿素1 8 柠檬酸铁0 0 4 5 v s ll m i l l 0 0 0m lv b l 20 5 m l l o o o m l 注：使用时，按营养液海水= 1 1 0 0 0 配置 2 2 2 2 藻液浓度一吸光值线性关系 通过紫外可见分光光度计扫描得到藻液的最大吸收波长。如图2 1 所示。 4 0 0 0 0 7 0 0 a 亚心型扁藻 n n 0 ， 0 n 0 n n n m 0 1 7 s ，、 1酒65-160-60- jo v 4 0 05 0 06 0 07 0 0 b 湛江叉边金藻 海洋防污涂料及兑主要成分的生物学性能研究 4 0 05 0 06 0 07 0 0 c 新月菱形藻 a b s勰 黜羁 飘008508075070-1人 八 o 妇f oj、 o v 567 0 0