（分析化学专业论文）基于末端保护分析的比色生物传感技术的研究.pdf

r e s e a r c ho fc o l o r i m e t r i cb i o s e n s i n gt e c h n o l o g yb a s e do nt e r m i n a l p r o t e c t i o n l p e i b s ( i - i u n a nu n i v e r s i t y ) 2 0 0 9 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i n t h e g r a d u a t es c h o o l h u n a nu n i v e r s i t y p r o f e s s o ry ur u q i n m a y ，2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：文j 吼日期：刀f 1 年6 月3 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 保密口，在一年解密后适用本授权书。 2 不保密团。 ( 请在以上相应方框内打”) 作者签名： 导师签名： 奢t 哆 e l 期：为7 f 年移月3 日 日期：劾，1 年多月 ? 日 硕士学位论文 摘要 蛋白质是一类重要的生物大分子，它是生命活动的物质基础，也是构成生物 体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质结构与功能关系的研究，不仅可以从分 子水平上解释生命现象的化学本质，而且能促进生物学、医学等学科的发展。生 物传感器作为一种新的生物分析方法，具有选择性好、灵敏度高、稳定性强、成 本低廉且能在复杂的体系中进行在线连续监测等优点，被广泛用于生物、医学、 环境科学、食品等领域。本研究论文基于末端保护分析方法，针对生物体内一些 重要酶的活性检测和生物小分子与其结合蛋白之间的相互作用研究发展了几种新 型生物传感技术。 一 1 建立了一种基于末端保护分析介导纳米金团聚的生物传感技术，用于人 d n a 甲基化转移酶( d n m t1 ) 和d n a 糖基化酶( h o g g1 ) 活性的检测。d n m tl 或h o g gl 与纳米金标记的d n a 底物链结合形成的共价复合物可以有效的保护 d n a 链不被e x oi 和e x oi i i 酶切降解，保存下来的单分散纳米金通过对其特征等 离子共振吸收峰强度的检测，从而对d n m tl 和h o g gl 活性进行定量，该方法用 于检测d n m t1 和h o g g1 活性具有方便、快速、灵敏度高、可视化等优点。 2 基于末端保护分析发展的比色和荧光检测技术用于研究叶酸与其结合蛋白 之间的相互作用，以及对叶酸结合蛋白进行定量分析。通过叶酸与其结合蛋白之 间的特异性结合，将叶酸结合蛋白共价结合到修饰叶酸的d n a 链上，形成的复合 物能够有效的保护d n a 链不被e x oi 酶切降解，通过血红素结合g 四股螺旋适配 体催化氧化2 ，2 联氮二( 3 乙基苯并噻唑6 磺酸) 二铵盐( a b t s ) 显色和实 时定量p c r 检测保留下来的d n a 链，从而对叶酸结合蛋白进行定量。比色分析 具有特异性强、可视化等优点；实时定量p c r 法具有操作简单、高灵敏度等优点。 关键词：生物传感器；末端保护分析；酶活性检测；纳米金；叶酸结合蛋白；a b t s ； 实时定量p c r 基于末端保护分析的比色生物传感技术的研究 a bs t r a c t p r o t e i ni sak i n do fi m p o r t a n tb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s i ti st h eb a s i cs u b s t a n c e o fl i f ee v e n t ，a n da l s oi st h em o s tb a s i cs t r u c t u r ec o n s t i t u t es u b s t a n c ea n df u n c t i o n a l m a t e r i a li no r g a n i s m s t h ea c k n o w l e d g e m e n to fs t r u c t u r ea n df u n c t i o no fp r o t e i n s c o u l df a c i l i t a t et oe x p l a i nt h ec h e m i c a ln a t u r eo fl i f ep h e n o m e n o na tt h em o l e c u l a r l e v e l ，b u ta l s ob o o s tt h ed e v e l o p m e n t so fo t h e rf i e l d s ，s u c ha sb i o l o g y , m e d i c i n e a sa n e w b i o l o g i c a la n a l y s i sm e t h o d ，b i o s e n s o rh a sg o o ds e l e c t i v i t y , h i g hs e n s i t i v i t y , s t r o n g s t a b i l i t y , l o wc o s ta n dc a na l s ob ee m p l o y e di no n l i n em o n i t o r i n gc o m p l e xs y s t e m ，e t c s ob i o s e n s o ri sw i d e l yu s e di nf i e l d so fb i o l o g y , m e d i c i n e ，e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e ，f o o d ， e t c t h i st h e s i sr e p o r t ss e v e r a ln e wb i o s e n s i n gt e c h n o l o g ya n a l y s i sm e t h o d s ，w h i c ha r e u s e df o rt h ed e t e c t i o no fs o m ei m p o r t a n te n z y m a t i ca c t i v i t ya n dt h er e s e a r c ho f i n t e r a c t i o n sb e t w e e ns m a l lb i o m o l e c u l e a n d b i n d i n gp r o t e i n b a s e do nt e r m i n a l p r o t e c t i o n 1 as i m p l e ，r a p i da n dh i g h l ys e n s i t i v eb i o s e n s i n gt e c h n o l o g yb a s e do nt e r m i n a l p r o t e c t i o nh a sb e e np r o p o s e da n da p p l i e d t od e t e c tc a t a l y t i c a c t i v i t y o fd n a ( c y t o s i n e - 5 ) 一m e t h y l t r a n s f e r a s el ( d n m t1 ) a n d8 - o x o g u a n i n ed n ag l y c o s y l a s e ( h o g o 1 ) v i ag o l dn a n o p a r t i c l e sc o l o rc h a n g e s t h es p e c i f i cb i n d i n go fd n m t1o rh o g g1 a n dg o l dn a n o p a r t i c l el a b e l e dd n as u b s t r a t e sf o r m sc o v a l e n tc o m p l e x e s ，w h i c hc a n e f f e c t i v e l yp r o t e c td n a f r o mb e i n gh y d r o l y z e db ye x oia n de x oi i i t h ec a t a l y t i c a c t i v i t yo fd n m t1a n dh o g g1 c a nb eg a i n e dt h r o u g hd e t e c t i n gt h ep l a s m ar e s o n a n c e a b s o r p t i o no fp r o t e c t e dg o l dn a n o p a r t i c l e t h i sm e t h o dm i g h tp r o v i d eac o n v e n i e n t ， q u i c k ，h i g h l ys e n s i t i v ea n ds p e c i f i cd e t e c t i o np l a t f o r mf o rc a t a l y t i ca c t i v i t yd e t e c t i o n o fd n m t1a n dh o g g1 2 t w ob i o s e n s o rt e c h n o l o g i e sb a s e do nt e r m i n a lp r o t e c t i o nh a v eb e e np r o p o s e d a n da p p l i e dt os t u d yi n t e r a c t i o n sb e t w e e nf o l a t ea n df o l a t er e c e p t o rv i ac o l o r i m e t r i c a n a l y s i sa n dr e a l - t i m eq u a n t i t a t i ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - q p c r ) t h es p e c i f i c b i n d i n go ff o l a t el a b e l e dd n aa n df o l a t er e c e p t o rf o r m sc o v a l e n tc o m p l e x e s ，w h i c h c a ne f f e c t i v e l yp r o t e c td n af r o mb e i n gh y d r o l y z e db ye x oia n de x oi i i f o l a t e r e c e p t o r c a nb e q u a n t i t a t e dt h r o u g h c o l o r i m e t r i c a n a l y s i s o f p r o t e c t e d g q u a d r u p l e x - h e m i nc o m p l e x e sc a t a l y t i n g2 ，2 一a z i n o b i s - 3 一e t h y l b e n z t h i a z o l i n e - 6 s u l p h o n a t e ( a b t s ) a n dr e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - q p c r ) o fp r o t e c t e df o l a t el a b e l e dd n a t h ec o l o r i m e t r i ca n a l y s i sh a sh i g hs p e c i f i c i t ya n dc a n m 硕士学位论文 b ed e t e c t e d b y v i s u a l i z a t i o nw i t h o u tn e e d o f s p e c i a le q u i p m e n t ；t h er e a l t i m e q u a n t i t a t i ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - q p c r ) m e t h o di sn o to n l yc o n v e n i e n tb u t a l s oh a sl o wd e t e c t i o nl i m i t k e yw o r d s ：b i o s e n s o r ；t e r m i n a lp r o t e c t i o n ；e n z y m ea c t i v i t yd e t e c t i o n ；g o l d n a n o p a r t i c l e ；f o l a t er e c e p t o r ；a b t s ；r e a l - t i m eq u a n t i t a t i ep c r i v 基于末端保护分析的比色生物传感技术的研究 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i i i 第1 章绪论1 1 1 生物传感器1 1 1 1 生物传感器的工作原理1 1 1 2 生物传感器的分类2 1 1 3 生物传感器的应用2 1 2 光化学传感器4 1 2 1 光化学传感器的工作原理4 1 2 2 光化学传感器的分类5 1 2 3 光化学传感器的应用5 1 3 纳米材料6 1 3 1 纳米材料的分类6 1 3 2 纳米材料的性质6 1 3 3 纳米材料的制备方法8 1 3 4 纳米金在生物传感器中的应用9 1 4 适配体( a p t a m e r ) 1 1 1 4 1 核酸a p t a m e r 的概述1 l 1 4 2 核酸a p t a m e r 的体外筛选1 2 1 4 3 核酸a p t a m e r 在分析化学中的应用1 2 1 5 聚合酶链式反应( p c r ) 1 4 1 5 1p c r 技术的原理1 4 1 5 2p c r 的衍生技术1 4 1 6 本研究工作的构思1 5 第2 章末端保护分析介导纳米金团聚检测甲基化转移酶和糖基化酶的活性1 6 2 1 前言16 2 2 实验部分17 2 2 1 试剂与仪器1 7 2 2 2 金纳米颗粒的制备1 8 2 2 3 聚合延伸含5 - a z a d c 的d n a 链1 8 2 2 4d n a 链标记纳米金1 9 2 2 5 酶活性检测1 9 v 硕士学位论文 2 2 6 凝胶电泳分析2 0 2 2 7 尺寸表征2 0 2 3 结果与讨论2 0 2 3 1 酶活性检测的原理一2 0 2 3 2d n m t1 活性检测的光谱分析一2 1 2 3 3 凝胶电泳分析一2 3 2 3 4 表征实验分析2 4 2 3 5 工作曲线2 6 2 3 6h o g gl 活性的光谱分析2 8 2 3 7 凝胶电泳分析一2 9 2 3 8 工作曲线3 0 2 4 小结3l 第3 章基于末端保护分析的光学检测技术研究小分子与其结合蛋白的相互作用3 2 3 1 前言3 2 3 2 实验部分3 2 3 2 1 试剂与仪器3 2 3 2 2f a 标记氨基修饰的d n a 链3 3 3 2 3 比色分析实验3 3 3 2 4 实时定量p c r 反应( r t - q p c r ) 3 4 3 - 3 结果与讨论3 4 3 3 1 比色分析检测叶酸结合蛋白3 4 3 3 2 干扰实验3 6 3 3 3 动力学曲线3 7 3 3 4 工作曲线3 7 3 3 5r t - q p c r 检测叶酸结合蛋白3 8 3 3 6 优化e x oi 的用量和酶切反应时间4 0 3 3 7 熔链曲线分析4 1 3 3 7 工作曲线4 l 3 4 小结4 2 结论4 4 参考文献4 5 附录a 5 4 致谢5 5 v i 硕1 ：学位论文 第1 章绪论 生化分析作为分析化学与生命科学交叉形成的学科分支，自上世纪九十年代 以来取得了迅猛发展，目前成为分析化学中的重要组成部分。生物传感器作为一 种新型的分析器件，与传统的分析方法相比，具有选择性好、灵敏度高、操作简 单、响应速度快、样品用量少、体积小、成本低廉、能在复杂的体系中进行在线 连续监测等优点，同时还可利用计算机进行数据收集和处理，受到越来越多的关 注，已发展成为现代生物技术的重要研究领域之一，在分析化学、分子生物学、 医学检验、食品检测、环境监测以及国防军事等方面有着良好的研究价值和应用 前景【1 1 。 1 1 生物传感器 生物传感器是由生物学、化学、医学、电子科学等多门学科相互交叉渗透的 产物，是一种将生物敏感基元与各种物理、化学型信号转换器结合起来，能够对 特定种类的化学物质或者生物活性物质具有选择性和可逆性响应的分析装置【2 1 。上 世纪六十年代，c l a r k ；f f i l y o n s t 3 】提出酶电极的概念标志着生物传感器的诞生。将酶 溶液夹在两层透析膜之间形成一层薄的液层，再紧贴在各类电极表面用于检测液 层中的反应，但是由于酶的反应活性下降和酶的价格昂贵，促使人们对生物传感 器进行深一步的研究。经过半个世纪的发展，由于新型材料和新工艺的出现以及 各种研究技术的不断创新，生物传感器的种类迅速增多【4 】，例如：光化学生物传感 器、电化学生物传感器、压电生物传感器等。生物传感器的发展关键在于生物敏 感材料的固定化方法的改进。到目前为止，生物敏感材料的固定化方法经历了三 个发展阶段：固定于非活性基质膜，直接吸附或共价结合到换能器，直接固定到 电子元件1 5 】。进入二十一世纪后，在这样一个信息和生命科学高度发展的时代，人 们对于生物传感器提出了更高更严的要求。对检出的分析结果要求不再局限于物 质的成分和含量，而是要求更加快速、准确的获取与研究体系相关的更多、更全 面的信息。 1 1 1 生物传感器的工作原理 生物传感器是以生物活性单元( 如酶、抗体、核酸、细胞、组织等) 作为生 物敏感基元，与待测物高度特异性结合，通过信号转换器将反应程度引起物理化 学性质的改变用离散或连续的电信号输出，从而用于检测待测物的浓度。 生物传感器的种类繁多，但其总体结构由以下两个主要部分组成：其一是作 基于末端保护分析的比色生物传感技术的研究 为感受器的生物敏感基元，是具有特定分子识别能力的生物活性单元，如组织切 片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸、生物小分子等；其二是信号转换 器，也称为换能器，主要有电流型或电压型电化学电极、半导体、光学检测元件、 热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体以及表面等离子共振器件等。当待测物 与生物敏感基元特异性结合形成复合物，其物理化学性质的改变通过信号转换器 转变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测待测物的目的【6 】。生物传 感器的工作原理图如图1 1 所示。 爷 移 o 移3 o 移毫 每 l 生信号转换器 l 物 化学物质嘲电极、半导体等 l 功 热_ 嘲热敏电阻 能 光一睁光纤、光度计 性 质量- - - 睁e 电晶体等 膜 介电性质哪表面等离子共振 图1 1 生物传感器的工作原理图 1 1 2 生物传感器的分类 酶电极概念的提出标志着生物传感器的诞生，由于生物传感器具有特异性强、 灵敏度高、稳定性好等优点，受到越来越多的研究和应用。随着新型材料的开发、 新工艺的使用以及相关学科的研究发展，生物传感器的种类日益增加【7 1 。一般来说， 生物传感器按以下三个方面进行分类。 根据生物传感器输出信号的产生方式分类，可分为：亲合型生物传感器【8 】、代 谢型生物传感器和催化型生物传感器【9 】。 根据生物传感器中生物敏感基元分类，可分为：酶传感器、免疫传感器、适 配体传感器、核酸传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞传感器、分子印迹 传感器等。 根据生物传感器的信号转换器件分类，可分为：电化学生物传感器【l 们、热敏 生物传感器、光化学生物传感器】、半导体生物传感器、声波生物传感器等。 1 1 3 生物传感器的应用 1 1 3 1 在环境监测中的应用 传统的环境检测方法具有分析时问长、操作复杂、需要昂贵的仪器且无法现 场快速检测和连续在线分析等缺点，而生物传感器的发展和应用能够很好的解决 这些难题【l2 。 水质分析是生物传感器在环境监测中应用最多的领域，例如：生化需氧量 硕j j 学位论文 ( b o d ) 是衡量水体有机污染程度的重要指标，也是水质评价过程中最常用的指 标之一。传统的b o d 测定方法一一培养法，所需测定时间长、操作繁琐、结果准 确度差。而利用环境中的微生物，制成微生物胶原膜复合物，并将其与氧电极组 装在一起，即可制成测定b o d 的微生物传感器【1 3 】，只需1 5m i n f l o 能测得结果，不 仅操作简单、分析速度快，而且可进行现场快速监测和连续在线分析。 生物传感器还可以对农药进行快速连续在线分析【l4 。农药残留检测目前研究 较多的有乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 和丁酰胆碱酯酶( b c h e ) 传感器【1 5 】。在乙酰胆 碱酯酶的催化下，乙酰胆碱水解为乙酸和胆碱。有机磷和氨基甲酸酯类农药与乙 酰胆碱类似，能与乙酰胆碱酶酯的活性部位发生不可逆的键合从而抑制酶活性， 因此，农药的残留量可通过酶反应产生的p h 变化由电位型生物传感器测出。 1 1 3 2 在食品分析中的应用 生物传感器可广泛用于食品的检测分析【1 6 】，如对食品中的营养成分、生物毒 素、食品添加剂、重金属、微生物、农药残留等进行检测【1 7 , 1 8 】。 由于铅、汞等重金属离子可以在生物体体内不断的富集，重金属对环境的污 染和人类的健康都造成了极大的威胁【l 引。检测重金属离子的生物传感器的基本原 理是：重金属离子可以造成氧化酶和脱氢酶失活。h i p e r t 并1 1 r e i n h o l d t 2 0 】以谷光甘肽 作为检测水溶液中重金属离子生物传感器的生物识别元件，将其固定在合适的信 号转换器的表面，通过硫醇盐选择性地与重金属结合，由此产生的物理化学性质 变化( 如氢离子释放、质量及光学特征变化) ，可被信号转换器( 氢离子敏感型 场效应管、质量敏感型光装置) 转换成电信号，从而实现对重金属离子的快速监 测。 1 1 3 3 在生物医学中的应用 生物传感器可以用于体液中的微量蛋白、有机小分子、核酸等多种生物分子 的检测【2 1 1 ，可以在生物体内对待测物实时监控。c h a r p e n t i e r t 2 2 1 等报道了一种过氧 化物酶修饰的电化学传感器用于胆固醇的快速检测，酯化的胆固醇在胆固醇酯酶 的作用下水解生成游离胆固醇，游离胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下与氧气发生 氧化还原反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下将亚铁氰化钾氧化 为铁氰化钾，并在电极表面发生电子传递产生电流，电流的大小与被测血液中胆 固醇的浓度成正比关系。 1 1 3 4 在军事中的应用 生物传感器由于具有特异性强、灵敏度高，成为检测化学战剂和生物战剂中 最重要的成员之一。美军早在1 9 9 2 年报道一种生物战剂免疫传感器【2 3 1 ，该生物传 感器由采用荧光素标记的多种生物战剂抗体、涂有生物素的多孔醋酸纤维捕获膜、 基于末端 5 l ：护分析的比色生物传感技术的研究 缓冲溶液、含尿素的底物溶液的检测器组成，采用竞争法和夹心法测定单价和多 价生物战剂的抗原，可在几分钟内对生物战剂气溶胶进行检测，如检测细菌、芽 胞、病毒和毒素等。生物传感器检测生物战剂、化学战剂具有经济、简便、快速、 灵敏等优点，具有广阔的军事应用前景【2 4 1 。 1 2 光化学传感器 光化学传感器是一种建立在光谱化学和光学波导与量测技术基础上的传感装 置，能将待测物的物理化学信息转化为光吸收、光反射、荧光、化学发光、光散 射、光折射和偏振光等光学性质【2 5 1 。p h 试纸是最早光化学传感装置，通过颜色对 比即可知道待测溶液的p h 值。光化学传感器自八十年代建立以来，经过短短三十 年的发展取得了引入注目的成绩，发展成为化学传感器中最活跃和最重要的研究 领域之一。 1 2 1 光化学传感器的工作原理 光化学传感器是利用敏感层与待测物相互作用前后物理化学性质的改变而引 起光吸收、光反射、荧光、化学发光、拉曼光散射、光折射和偏振光等光学性质 的变化对待测物进行检测的一类特殊化学传感器【2 6 1 。一般来说，光化学传感器的 光学检测手段有光度法、光谱法( 磷光、荧光、拉曼散射) 、椭偏法、干涉法、 表面等离子体激元共振，以及波导耦合法、布儒斯特角法及p 偏振光双面反射法等 1 2 7 - 2 9 】。随着光纤技术及光集成技术的发展，光化学传感器得到迅猛的发展，运用 先进的检测方法，结合光纤技术和光集成技术，已经构建了许多高性能的小型化 光化学传感器，目前已广泛应用于临床医学、环境监测、食品检测、免疫分析及 d n a 杂交分析等领域。 光化学传感器的工作原理如图1 2 所示，由光源发出检测光，经过光学波导到 达与样品接触的探头部位，经与待测样品相互作用后产生可量测的光学信号，再 经光学波导将信号光传回检测器。 图1 2 光化学传感器的工作原理图 硕l ：学位论文 1 2 2 光化学传感器的分类 光化学传感器自八十年代建立以来，由于其安全性好、可远程检测、分辨率 高、工作温度低、能耗低、可连续实时监控、易转换为电信号等优点，受到人们 广泛的关注，经过三十年的发展，光化学传感器的种类越来越多，按照不同的标 准有不同的分类方式3 们。 根据光学波导的作用不同，光化学传感器可以分为：传光型光化学传感器和 功能型光化学传感器两类，前者光学波导只起传递光波的作用，检测对象本身或 敏感层表现出不同的光学信息：后者光学波导本身的传光性能受环境因素变化而 改变。 根据获取的光学信息性质不同，光化学传感器可以分为：吸收、反射、散射、 折射和发光等。其中发光型光化学传感器分为荧光、磷光和化学发光，目前成为 光化学传感器中最大的分支。 根据光化学传感器的复杂程度，光化学传感器可以分为：普通光学波导传感 器、化学修饰传感器和生物修饰传感器。普通光学波导传感器本身不具备特异的 识别功能，依赖于待测物本身固有的可检测光学性质；化学修饰传感器和生物修 饰传感器都是通过在光学波导的特定位置固定敏感层化学或生物试剂来提高传感 器对待测物的特异识别能力。 1 2 3 光化学传感器的应用 与传统分析方法相比，光化学传感器具有安全性能好、可远程检测、分辨率 高、工作温度低、能量损失少、可连续实时监控、易转换为电信号等优点，受到 越来越多的关注。近年来，随着光学信号检测技术的快速发展，光化学传感器被 广泛应用于食品检测、医学、环境监测等多个领域，具有良好的应用前景和研究 价值【3 1 , 3 2 1 。 1 2 3 1 在食品检测中的应用 人们对食品安全要求越来越高，食品检测也越来越重要，包括食品中的营养 成分、生物毒素、食品添加剂、重金属、微生物、农药残留等等检测，生物传感 器可广泛用于食品检测阮3 4 1 。 食品中的生物毒素对人体的伤害是极大的，因此对生物毒素的检测是非常有 必要的。o g e r t 3 5 】等构建光纤型生物传感器对食品中的肉毒素a 进行检测，将肉毒 素单抗或多抗共价结合到光纤表面，通过酶联免疫法将肉毒素a 和荧光基团标记的 肉毒素抗体以夹心形式固定到光纤表面，检测到荧光信号的变化与样品中肉毒素a 的含量呈正比，其检测下限可达5n g ，m l ，并且可在1m i n 内完成检测，具有良好 的选择性。 基于末端保护分析的比色生物传感技术的研究 1 2 3 2 在医学中的应用 光化学传感器由于具有体积小、绝缘性好、抗干扰、光路可弯曲以及安生可 靠等优点，被广泛用于基础研究、临床应用、医学检测等医学领域中研究。t a n 3 6 】 等结合光学探针技术和近场光聚合方法构建一种亚微米光纤型传感器，与其他光 学传感器相比，这种传感器体积小( 约0 1g m ) ，所需要的样品量少( 约1 0 。1 5l ) ， 响应时间明显缩短( 毫秒级) ，检测下限可达3 0 0 0 个h + ，并将这种传感器插入单 个活体兔胚胎，用于监测不同生长期下胚胎内部f l 向p h 值，还可用于活体和细胞的 无损分析检测，而不影响生物组织的正常生长。 1 3 纳米材料 纳米材料是指在三维空间里至少有一维处于纳米尺度范围( 1 1 0 0n m ) 或由 它们作为基本单元构成的材料，相当于1 0 1 0 0 个原子紧密排列在一起的尺度【37 1 。 自上世纪九十年代纳米材料的发现以来，经过二十年的发展，纳米材料已取得了 长足的发展，目前纳米材料的种类丰富，功能繁多。由于其独特的结构，如比表 面积大、表面活性位点增加、表面原子配位不全等，使得纳米材料物理化学性质 发生改变，如表面反应活性高、催化效率提高、吸附能力增强等。目前纳米材料 的研究成为材料科学研究中的重要部分，一些发达国家根据自身的国情制定了相 应的战略计划，投入大量资金，鼓励进行纳米技术的基础研究和应用研究，纳米 材料已经成为当今新型材料研究领域中最富有潜力，对未来的经济和社会发展影 响深远。 1 3 1 纳米材料的分类 纳米材料是纳米粉末、纳米纤维、纳米薄膜、纳米块体、纳米复合材料和纳 米结构的总称，其分类方式有多种【3 引。 按照纳米材料的维数分类，可以分为：零维纳米材料( 纳米颗粒) 、一维纳 米材料( 纳米线) 、二维纳米材料( 纳米薄膜) 和三维纳米材料。 按照传统材料科学体系分类，可以分为：纳米金属材料、纳米陶瓷材料、纳 米高分子材料和纳米复合材料等。 按照应用目的分类，可以分为：纳米电子材料、纳米磁性材料、纳米发光材 料、纳米隐身材料、纳米生物材料等。 1 3 2 纳米材料的性质 纳米材料的性质取决于纳米材料的结构【3 9 1 ，纳米材料的结构上存在两种结构 单元：即晶体单元和界面单元。晶体单元由所有晶粒中的原子组成，这些原子严 格地位于品格位置；界面单元由处于各晶粒之间的界面原子组成，这些原子由超 硕1 j 学位论文 微晶粒的表面原子转化而来。纳米材料晶粒小，表面积大，正是因为纳米材料独 特的结构以及特有的效应，使其具有不同于常规材料和单个分子的性质。 ( 1 ) 小尺寸效应当纳米材料的微粒尺寸与光波波长、德布罗意波波长以及超导 态的相干长度或透射深度等物理特性相当或更小时，纳米颗粒的周期性边界条件 消失，由于颗粒尺寸小到一定程度会引起颗粒性质的改变，由颗粒尺寸变小引起 宏观物理性质的变化称为小尺寸效应。 ( 2 ) 表面效应对球体来说，比表面积与直径成反比，即随着颗粒尺寸变小，比 表面积会显著增大，表面原子占总原子的百分比会显著增加，原子配位数严重不 足，使得表面原子极其活跃，颗粒的表面能和表面结合能增加，从而引起纳米颗 粒性质的变化。 ( 3 ) 量子尺寸效应当纳米颗粒的尺寸与光波波长或其他相干波长等物理特征 尺寸相当或更小时，金属费米能级附近的电子能级由准连续变为离散，纳米颗粒 中存在不连续的高能级分子占有轨道和最低分子空轨道，随着纳米颗粒的粒径变 小，高低轨道之间的间距增大，这种现象称为量子尺寸效应。 ( 4 ) 宏观量子隧道效应微观粒子的总能量低于势垒高度也能穿越势垒的现象 称为隧道效应，代表微观颗粒穿过势垒的能力。一些宏观物理量，如颗粒的磁化 强度、量子相干器件中的磁通量等也具有隧道效应，称之为宏观量子隧道效应。 纳米颗粒由于特殊的结构，也具有这种贯穿势垒的能力。 正是由于纳米材料具有颗粒尺寸小、比表面积大、表面能和表面结合能高等 特点，以及具有特有的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效 应，使得纳米材料表现出奇特的物理化学性质 4 0 】，主要表现在以下方面： ( 1 ) 力学性质纳米颗粒由于界面的原子排列混乱，使得原子在外力的作用下更 容易迁移，因此纳米材料具有更好的韧性和延展性。王婷婷【4 1 】等在a 1 2 0 3 陶瓷材料 中加入z r 0 2 纳米颗粒，陶瓷材料的性能得到明显改善，平均三点弯曲强度达6 2 1 3 m p a ，平均断裂韧性( k i c ) 高达6 7 2m p a m o 一。 ( 2 ) 热学性质纳米材料由于颗粒尺寸小，比表面原子多、活性大且相邻配位不 全，体积远小于大块材料，因此纳米粒子熔化时所需要的能量少，熔点低。如常 规a 1 2 0 3 的烧结温度在2 1 0 0k 左右，而纳米a 1 2 0 3 的烧结温度在1 4 0 0k 1 8 0 0k 之间， 并且具有很高的致密度。 ( 3 ) 光学性质当纳米颗粒的粒径与超导相干波长、波尔半径以及电子的德布罗 意波波长相当时，量子尺寸效应十分明显，同时大的比表面使处于表面的原子、 电子与处于颗粒内部的原子、电子的行为差别明显，导致纳米材料的光学性质发 生改变。在1 9 9 0 年日本发现，粒径小于6n m 的硅在室温下发射可见光，可能是载 流子的量子限域效应引起的。 ( 4 ) 磁学性质当纳米颗粒的尺寸小到一定值时，各向异性能减小到与热运动动 基于末端保护分析的比色生物传感技术的研究 能差不多，磁化方向不再固定在一个易磁化方向，易磁化方向作无规律的变化， 从而表现出超顺磁性，不同种类的纳米颗粒表现超顺磁的临界尺寸不同。女1 f e 3 0 4 纳米颗粒的粒径为1 6n m 时成为顺磁体【4 2 1 。 ( 5 ) 催化性质纳米颗粒尺寸小，表面原子数多，原子配位严重不足以及高的表 面能，使表面原子具有很高的化学活性，容易与其他原子结合。如化学惰性的p t 制成纳米材料后具有良好的催化性能【4 3 1 。 1 - 3 3 纳米材料的制备方法 自1 9 8 4 年g l e i t e r 4 4 】采用金属蒸发凝聚原位冷压成型法制备纳米晶体以来，由 于纳米材料具有各种优良性质，得到广泛的研究与应用，纳米材料的合成与制备 方法成为重要的研究课题。目前，纳米材料的制备方法有：物理法、化学法以及 综合法，常见无机纳米材料制备方法列于表1 1 。 表1 1 常见无机纳米材料制备方法分类 ( 1 ) 物理法通过高能耗的方式改变物质物理形态将颗粒细化到纳米尺寸的方 法【4 引，有机械研磨法、物理粉粹法、真空冷凝法等，该方法的优点是合成纳米材 料纯度高，缺点是产量低、成本高等。 ( 2 ) 化学法通过气相沉积法【4 6 、水热合成法【4 7 1 、相转移法【4 8 1 、沉淀法、界面 合成法、溶胶凝胶法【4 9 1 、微乳法【5o 】等化学反应合成纳米颗粒，该方法的优点是合 成纳米材料均匀、产量大且设备投入小，缺点是产品纯度低。 硕 学位论文 ( 3 ) 综合法综合法结合物理法和化学法的优点以提高效率和纯度，如超级沉淀 法、激光沉淀法、微波合成法等。 1 3 4 纳米金在生物传感器中的应用 纳米材料的诞生推动了生物传感器的进一步发展，使得生物传感器的线性检 测范围、响应时间、检测下限、稳定性等各项性能指标都得到明显的改善。纳米 金颗粒由于合成方法简单，有着优异的物理化学性能，因此被广泛用于生物传感 器的研究与应用【5 。 纳米金是直径在l 一1 0 0n m 范围内的金颗粒，具有纳米材料共有的特性外，还 具有高电子密度、介电特性和催化作用等性质，能与多种生物分子结合且不影响 其生物活性。纳米金颗粒主要通过柠檬酸钠还原氯金酸得到，通过控制两种反应 物的配比即可控制纳米金颗粒的直径，合成步骤简单，粒径均匀；由于纳米金颗 粒的直径在1 1 0 0n l t l 之间，与大部分重要的生物分子( 如蛋白质、核酸等) 的尺 寸相当，通过a u s 共价键容易与生物分子结合，并且能够与生物很好的相容，因 此可以利用纳米金作为探针进入生物组织内部探测生物分子的生理功能。纳米金 在生物传感器中的应用主要表现在作为信号分子、探针载体等。 ( 1 ) 信号分子随着颗粒直径的改变，纳米金在可见区的特征等离子体共振吸收 峰发生频移，其颜色随粒径的增大从酒红色向紫色加深。w e i 5 2 l 等利用寡核苷酸单 链通过静电作用缠绕在纳米金的表面，使得纳米金很好地分散在一定盐离子浓度 的溶液中，设计了凝血酶适配体用于检测凝血酶，实验原理如图1 3 所示。凝血酶 适配体使纳米金分散在一定浓度的氯化钠溶液中，凝血酶与其适配体结合，使得 纳米金裸露在氯化钠溶液中发生团聚凝集，纳米金的特征等离子体共振吸收峰发 生蓝移，溶液颜色由酒红色变成紫色。该方法用于凝血酶的检测，具有低成本、 操作简单、灵敏度高等优点，在0 1 6 7n m 范围内具有良好的线性关系，检测下限 达0 8 3n m 。 烹善紫 某于末端保护分析的比色生物传感技术的研究 ( 2 ) 探针载体纳米金具有纳米材料共有的特性外，还具有大比表面积、