（生物化学与分子生物学专业论文）芯片探针杂交效率的影响因素分析.pdf

学 家有关 理工大 印、缩 本学位论文属于 学位论文作者签名： 保密口，在年解密后适用本版权书。 不保密口。 季撒 j 日期：纠。年o ；月r 日 指导教：q 醐a 蜱何 浙江理工大学硕士学位论文 曲弘理乒大学 硕士学位论文 芯片探针杂交效率的影响因素分析 作者姓名严国权 学科( 专业)生物化学与分子生物学 郭江峰教授 指导老师 丁先锋副教授 所在学院生命科学学院 提交日期 2 0 0 9 1 2 中国杭州 f a c t o r s 分类号： u d c3 c o 芯片实验结果。探针的筛选主要是根据探针灵敏度和特异性的要求，选择一个或多个靶 标序列的候选探针，使芯片上的探针能与靶标结合而与非靶标不发生结合，从而有效的 完成芯片杂交过程。 寡核苷酸探针可以提高靶序列特异性，改善探针与标记样本的杂交特性，并且可更 好地区分来自像剪切体或同一基因家族的相似靶序列。靶序列的二级结构是一种很普遍 的现象，即使在较高温度下靶序列形成的双链也能稳定存在。在很多优化探针设计的软 件中，未考虑靶序n - 级结构对杂交的影响。靶序n - 级结构是干扰杂交的潜在因素， 同时也是影响分析芯片结果、设计芯片标准的重要因素。在寡核苷酸探针设计的过程中 引入靶序列二级结构的因素，可以改变最优探针的选择。 本实验通过对加强型绿色荧光蛋白( e g f p ) r n a 序列进行覆瓦式探针设计，制作原 位合成的微流体芯片，研究探针靶序列杂交双链a g 、t m 、靶序列二级结构和探针末端 碱基因素对芯片杂交信号值的影响。结果表明，相同a g 和t m 值的探针靶序列杂交双 链的杂交信号值存在较大差异，探针靶序列杂交双链a g 和t m 值对芯片杂交信号值影 响没有明显的规律性；表征靶序列二级结构信息的探针p t - s c 参数与芯片杂交信号值间 呈较好的线性关系；探针5 末端碱基组成对芯片杂交信号值也有影响，5 末端碱基为 g c 的探针杂交信号值总体上高于其邻近的5 末端碱基为a t 的探针的杂交信号值。 通过r i b o s w i t c h 覆瓦式探针芯片实验对考虑了靶序n - 级结构的m f o l dp r o b e 和 a r r a y d e s i g n e rp r o b e 进行比较，表明考虑r n a 二级结构，可以明显提高探针的筛选效果。 关键词：覆瓦式探针；d n a 芯片：二级结构；探针靶序列杂交双链；r i b o s w i t c h 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t m i c m a r r a yt e c h n o l o g yi sp e r v a d i n gm a n ya s p e c t so ft h el i f es c i e n c e s t h i si sar e l a t i v e l y n e wa n de x c i t i n g ，h i g h t h r o u g h p u ts c r e e n i n gt e c h n o l o g yt h a te n a b l e sr e s e a r c h e r st or a p i d l y p r o f i l et h ee x p r e s s i o n o ft h o u s a n d so fg e n e ss i m u l t a n e o u s l yo rt of a c i l i t a t et h ed e t e c t i o n o r g e n o t y p i n go f m i c r o b i a ls t r a i n so rg e n e so f m e d i c a lo re n v i r o n m e n t a li m p o r t a n c e u s u a l l yt h ep r o c e d u r eo fa na r r a ye x p e r i m e n ti n c l u d e sp r o b ed e s i g n ，c h i pm a n u f a c t u r i n g , s a m p l el a b e l i n g ，h y b r i d i z a t i o n , i m a g ea c q u i s i t i o na n dd a t aa n a l y s i s a st h ep r i m a r ys t e p ，t h e g o o dq u a l i t yo ft h ed e s i g n e dp r o b e si sap r e r e q u i s i t ef o rt h es u c c e s s f u lr e s u l t so fa na r r a y e x p e r i m e n t a c c o r d i n gt ot h er e q u i r e m e n t ss e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yo ft h ep r o b e s , m u l t i p l y c r i t e r i as h o u l db ee s t a b l i s h e df o rt h es c r e e n i n go ft h ec a n d i d a t ep r o b e st os e l e c tt h eq u a l i f i e d p r o b e sm e e t i n gt h ea b o v er e q u i r e m e n t s , t h a t st os a yt h a tt h es e l e c t e dp r o b e ss h o u l db ea b l et o b i n dt h e i rt a r g e t ss p e c i f i c a l l yb u tn o tt on o n - t a r g e t sa n da l lt h ep r o b e si nt h es a m ea r r a yh a v e s i m i l a rh y b r i d i z a t i o na t t r i b u t e s o l i g o n u c l e o t i d ep r o b e sp r o v i d eh i g h e rt a r g e ts p e c i f i c i t y ，p r o b es e l e c t i o ng i v e si m p r o v e d e x p e r i m e n t a lc o n t r o lo fh y b r i d i z a t i o np m p e n i e s ，a n dt a r g e t i n go fs p e c i f i cg e n es u b s e q u e n c e s a l l o w sb e t t e rd i s c r i m i n a t i o no fh i g h l ys i m i l a rt a r g e t ss u c ha ss p l i c ev a r i a n t so rg e n ef a m i l i e s s e c o n d a r ys t r u c t u r ei nt h et a r g e ti sp e r v a s i v e ，a n das i g n i f i c a n tf r a c t i o no ft h et a r g e ti s f o u n di nd o u b l es t r a n d e dc o n f o r m a t i o n se v e na th i g ht e m p e r a t u r e s e c o n d a r ys t r u c t u r ei nt h e t a r g e ti sap r o p e r l yn o tu s u a l l yc o n s i d e r e di ns o f t w a r ea p p l i c a t i o n sf o rd e s i g no fo p t i m a l c u s t o mo l i g o n u c l e o t i d ep r o b e s s t a b l es t r u c t u r ei nt h et a r g e th a st h ep o t e n t i a lt oi n t e r f e r ew i 吐i h y b r i d i z a t i o na n ds h o u l db eaf a c t o ri ni n t e r p r e t a t i o no fm i c r o a r r a yr e s u l t s ，a sw e l la sa n e x p l i c i tc r i t e r i o ni na r r a yd e s i g n c o n s i d e r a t i o no ft h i sp r o p e r t yi na no l i g o n u c l e o t i d ed e s i g n p r o c e d u r e w o u l dc h a n g et h ed e f i n i t i o no fa no p t i m a lo l i g o n u c l e o t i d es i g n i f i c a n t l y t h er n am i c m f l u i d i cp i c o a r r a yf o re n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( e g f p ) r n a t r a n s c r i p tw a sd e s i g n e du s i n gt i l i n gp r o b e s t h ee f f e c t so ff r e ee n e r g y ( g ) a n dm e l t i n g t e m p e r a t u r ef r m ) o fp r o b e - t a r g e th e t e r o d u p l e x , s e c o n d a r ys t r u c t u r eo ft a r g e ta n d b a s ei nt h e e n do f p r o b ew e r ee v a l u a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es a m ef r e ee n e r g y ( g ) a n dm e l t i n g t e m p e r a t u r eo m ) o fp r o b e - t a r g e th e t e r o d u p l e xh a dd i f f e r e n th y b r i d i z a t i o ns i g n a li n t e n s i t i e s ： n os i g n i f i c a n tr e g u l a r i t yb e t w e e nf r e ee n e r g y ( g ) a n dm e l t i n gt e m p e r a t u r e ( 1 h ) o f 浙江理工大学硕士学位论文 p r o b e - t a r g e th e t e r o d u p l e xa n dh y b r i d i z a t i o ns i g n a li n t e n s i t yw a so b s e r v e d ；t h e r ew a s al i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e np t - s co fp r o b ew h i c hr e f l e c t e dt h es e c o n d a r ys t r u c t u r ei n f o r m a t i o no f t a r g e ta n dh y b r i d i z a t i o ns i g n a li n t e n s i t y t h eb a s ec o m p o s i t i o no ft h ep r o b e s5 - e n da l s o a f f v c t e dt h eh y b r i d i z a t i o ns i g n a li n t e n s i t y t h es t r o n g e rh y b r i d i z a t i o ns i g n a li n t e n s i t yw a s u s u a l l yo b t a i n e dw h e nt h e5 - e n db a s eo fp r o b e sw a sg o rc c o m p a r e at ot h ep r o b e sw h i c h 5 - e n db a s eo f p r o b e sw a sao rt w ed e m o n s t r a t e dt h er n as e c o n d a l 嗲s t r u c t u r ec o u l di m p r o v et h ee f f e c to fd e s i g nb y c o m p a r i s o n o fr s wt i l i n g m i c r o a r r a ye x p e r i m e n t a ls i g n a l s o fm f o l dp r o b e sa n d a r r a y d e s i g n e rp r o b e s k e yw o r d s - t i l i n gp r o b e s r n a m i e r o a r r a ys e c o n d a r ys t r u c t u r e r i b o s w i t c hp r o b e t a r g e t h e t e r o d u p l e x 浙江理工大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章绪论1 1 1d n a 芯片技术l 1 1 1d n a 芯片的产生及原理1 1 1 2d n a 芯片的发展过程3 1 1 3d n a 芯片制造方法5 1 1 4d n a 芯片的分类7 1 2 芯片探针设计国内外研究现状9 1 2 1 探针对芯片杂交的影响9 1 2 2r n a 二级结构及其预测l l 1 2 3r n a 二级结构对芯片探针设计的影响1 5 1 3 核糖开关( r i b o s w i t c h ) 1 5 1 4 论文的主要内容16 第二章e g f p 覆瓦式芯片实验探针设计及数据分析。1 8 2 1 实验试剂材料l8 2 1 1 材料1 8 2 1 2 试剂与仪器1 8 2 2 实验方法l8 2 2 1 芯片探针设计及芯片合成1 8 2 2 2 靶序列制备及芯片杂交1 8 2 2 3 靶序歹u ( e g f p ) 二级结构预测及其探针参数计算l9 2 3 芯片数据结果分析1 9 2 3 1 探针( d n a ) 靶序列( e g f pr n a ) 杂交双链a g 及其1 m 值分析1 9 2 - 3 2 探针p t - s c 参数对杂交信号值的影响2 l 2 3 3 探针5 末端碱基组成对芯片杂交信号值的影响2 5 2 3 4 探针影响因素的交叉分析2 6 第三章r i b o s w i t c h 覆瓦式芯片实验及数据分析2 9 3 1 实验部分2 9 3 1 1 材料j 2 9 3 1 2 试剂与仪器2 9 3 1 3 实验方法：2 9 3 2 2a r r a y d e s i g n c r 探针设计软件2 9 3 3r s w 最优探针设计。3 0 3 3 1m f o l dp r o b e ：( m rp r o b e ) 探针设计3 0 3 3 2a r r a y d e s i g n c rp r o t 圮( a dp r o b e ) 探针设计3 0 3 4r s w 芯片数据分析3 3 第四章结论与讨论3 5 参考文献：3 6 i 改谢：l l 附录l 预测的3 4 个e g f p 二级结构4 2 附录27 0 1 条e g f p 覆瓦式探针相关参数及芯片实验结果4 6 i v 。1 。1 。- 1 。1 _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。i _ - 。_ _ 。_ - 。_ - 。_ 。- 。_ _ 。一 浙江理工大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1d n a 芯片技术 1 1 1d n a 芯片的产生及原理 w a t s o n 和c r i c k 于1 9 5 3 年提出的d n a 双螺旋结构模型是现代分子生物学诞生的里 程碑【1 - 3 】，使核酸研究从此进入一个崭新的时代。d n a 芯片技术【4 5 】也正是以d n a 双螺旋 结构为生物学基础的，是w a t s o n c r i c k 碱基互补配对原则在实验技术中的应用。核酸分 子由含有不同碱基的核苷酸构成，只要单链d n a 或r n a 的序列是互补的，即符合 a t ( u ) 、g c 的w a t s o n c r i c k 碱基互补配对原则，这样的两条核酸链之f 司( d n a d n a ， d n a r n a ，r n a r n a ) 就可以形成一个稳定的杂交复合体，而且杂交复合体的形成并不 要求两条单链的碱基完全互补，不同来源的核酸单链只要相互之间有一定程度的互补碱 基顺序( 即某种程度的同源性) 就可以形成杂交双链( 图1 1 ) 。d n a 芯片技术通过微电子技 术和微加工技术将核酸探针固定于芯片表面，在芯片固体表面构建微型生物化学反应系 统，再将标记的样品分子与固定于微点阵上的核酸分子杂交，实现数万个分子间的杂交 反应。 d n b 嘲p a i r h 咛r u l u l0 一 d o u b l e5 t n 田d i df i s c eo fd n , f 埔g m l m to fo 觚u 鞠d t om a i lop r d 碍 图1 1d n a 芯片技术的生物学原理【6 】 f i g 1 1t h eb i o l o g i c a lp r i n c i p l e so fd n ac h i pt e c h n o l o g y 6 】 餐菡睁窭叠期 回咿 f i g 1 2t h eh i g ht h r o u g h p u tp r o p e r t yo fg e n e c h i p 7 】 d n a 芯片技术最大的优点是高通量，可以在一块指甲盖大小的硅片上合成上百万个 探针( 图1 2 ) ，能同时并行检测大量基因的表达水平，因此可以在基因组水平上对生物学 过程进行研究，提供了一种系统揭示d n a 和r n a 表达变化的方法。与传统的基因序列 测定技术相比，d n a 芯片破译人类基因组和检测基因突变的速度要快数千倍。目前该技 术主要应用于基因的表达模式研究、基因图谱绘制、对特定反式因子靶基因进行高通量 筛选和检测染色体拷贝数的变化等【孓1 1 】，既具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业 化前景。d n a 芯片技术的出现给分子生物学、细胞生物学及医学领域带来了新的革命， 成为后基因时代最重要的基因功能分析技术之一。 生物芯片实验主要包括4 个基本步骤： ( 1 ) 芯片制备：采用表面化学方法来处理固相基质，如玻璃片或硅片，然后用直接 点样法或原位合成法将d n a 片段、蛋白质分子等探针分子高密度地固定在芯片上； ( 2 ) 样品制备和处理：生物样品在与芯片反应前，需要先将样品进行生物处理，对 其中的核酸分子或蛋白质进行荧光标记，提高检测的灵敏度； ( 3 ) 芯片杂交反应：标记的生物分子同芯片上探针分子之间的杂交反应是芯片实验 中最为关键的一步，为减少杂交分子之间的错配，需要严格控制杂交反应条件； 2 浙江理工大学硕士学位论文 ( 4 ) 芯片信号检测和数据分析：通过杂交反应固定于芯片固体表面的生物分子，在 特定波长激光的激发下，根据杂交反应情况荧光标记基团分别呈现不同的荧光发射谱， 然后根据其波长及波幅特征，通过c c d 或激光共聚焦检测系统得到杂交信号图像，再由 计算机经相关软件分析杂交信号图像获取杂交信号值，即可以获得相关生物信息数据。 1 1 2d n a 芯片的发展过程 2 0 世纪9 0 年代早期发展起来的d n a 芯片技术是典型的多学科、多技术交叉的结晶， 它涉及生物学化学、物理学、电子工程学、材料科学、核酸分子生物学、遗传学、毒理 学、机械工程学、光学、统计学和计算机科学等，这些学科的研究和先进技术的发展都 直接或是间接促进了d n a 芯片技术的发展。 2 0 世纪5 0 年代，圣路易斯华盛顿大学的k o r n b e r g 及其同事【1 2 】受到c o d 实验室有关 糖原磷酸化酶工作的启发，发现了d n a 聚合酶，d n a 双螺旋结构的提出以及随后发展 起来的d n a 体外聚合、重组d n a 技术、聚合酶链反应( p o l y m a r a s cc h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 等技术的出现，成为d n a 芯片技术出现的生物化学与分子生物学基础。 早期的杂交实验一般采用膜作为介质，2 0 世纪7 0 年代，基于硝酸纤维素膜和尼龙膜 的杂交技术在斯坦福大学诞生。1 9 7 5 年，g n m s t e i n 和h o g n e s s 1 3 悛表了第一篇关于d n a 阵列的文章，作者用硝酸纤维素膜的细菌克隆阵列分离果蝇基因，为2 0 年后d n a 芯片 技术的建立提供了基本的理论基础。 荧光染料的应用也是d n a 芯片产生和发展所不可缺少的因素。早在2 0 世纪7 0 年代， w a g 印o c r 和s t r y e 4 1 棚将荧光染料用于研究生物膜。p i n k e l 等【1 习在2 0 世纪8 0 年代末发展 了荧光显微镜检测策略和双色荧光标记技术，并将其用于染色体分析。y u 掣1 6 】于1 9 9 4 年用花青素荧光染料通过酶反应标记d n a 。这些成果在以后的d n a 芯片标记和检测技 术中都有应用。 杂交测序法的提出和实施直接促进了d n a 芯片形成的。2 0 世纪8 0 年代末，s o u t h e m 等【1 刀提出在载体上固定核苷酸及杂交法测序的方法。l e h r a c h 等最早将机械手臂用于阵 列制备，他们利用机械手臂和实心针将人的基因组d n a 克隆点在大的尼龙膜上，制备成 阵列。这些技术的产生为d n a 芯片技术的进一步发展奠定基础。 d n a 芯片从实验室走向工业化得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的 有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入，这使得合成、固定数以万计的高密度的探针 浙江理工大学硕士学位论文 分子变得切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术可以对杂交信号进行实时、灵敏、 准确的检测和分析。 d n a 芯片产生的两个标志性事件是1 9 9 1 年a f f y m e t r i x 公司生产的第一个原位合成的 d n a 芯片和1 9 9 4 年斯坦福大学用直接点样法制备的第一块微阵列e d n a 芯片。美国的 a f f y m e t r i x 公司在2 0 世纪8 0 年代末组织了多位分子生物学、数学、计算机科学和工程学 专家率先展开了d n a 芯片方面的研究，于1 9 9 1 年运用半导体照相平板技术，在l c m 2 大小的 玻璃片上通过原位合成的方法合成了寡聚核苷酸片段n 钊，得到了世界上的首张寡聚核苷 酸d n a 芯片( g e n ec h i p ) ，并很快在d n a 序列分析中得到应用。1 9 9 4 年，斯坦福大学b r o w n 等n 1 发展了直接点样的d n a 芯片制备技术，用机械手臂将p c r 扩增的c d n a 点在经过化学 修饰的玻璃片上，制备了第一张c d n a 微阵列芯片，并创造性地将双色荧光杂交系统引入 到d n a 芯片技术中。斯坦福大学的研究人员使用该方法研究了拟南芥和人a c h r 之间m r n a 表达水平差异，这是d n a 芯片第一次用于大规模基因表达差异分析，初步显示出d n a 芯 片技术在基因表达研究方面的巨大潜力。由于直接点样法制备d n a 芯片的方法对探针的 要求低，可以是任意长度的核酸分子，还可以是蛋白质或其他的任何生物大分子，甚至 可以是细胞或组织，因此该技术吸引了众多的公司和研究者，使该技术迅速得到普及和 推广，推动生物芯片技术步入了全面研究和应用的新时代。此后十几年的时间里，在d n a 微阵列技术的基础上，又逐渐出现了以糖、蛋白质、组织和细胞等为材料的生物芯片， 包括糖芯片、蛋白质芯片、组织芯片、微流体芯片( m i c r o f l u i d i cc h i p ) ( 图1 3 ) 和芯片 实验室( l a b o n a c h i p ) 等。 图1 3 微流芯片主要结构特征示意图 f i g 1 3s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o na n dt h em a j o rf e a t u r e so ft h em i c r o f l u i d i ca r r a yc h i p 4 1 1 3d n a 芯片制造方法 目前经典的d n a 芯片制各方法主要有4 种：光引导原位合成法、接触式点样法、化 学喷射法、压电喷墨原位合成法【2 0 】。 光引导原位合成法是由美国a f f y m e t r i x 公司开发的【1 9 1 ，该方法主要利用微加工光刻 工艺和光化学合成法两项技术，是照相平板印刷技术( p h o t o l i t h o g r a p h y ) 与传统的核酸、多 肽固相合成技术结合的产物，可以在预设位点按照预定的序列，方便、快捷地合成大量 寡核苷酸或多肽分子，原位合成的寡核苷酸或多肽分子与芯片基片共价连接。图1 4 是典 型的d n a 芯片光导原位合成法流程图。芯片合成前，预先将基片氨基化，并用光不稳定 保护剂将活化的氨基保护起来，用来聚合的单体分子一端受光敏保护剂的保护另一端活 化。然后选择特定的掩膜使需要聚合的部位透光，不需要发生聚合的位点蔽光，当光通 过掩膜照射到支持物上时，受光部分生物分子的光敏保护集团脱落，使氨基解保护，从 而与聚合用单体分子发生偶联反应。每次反应在成千上万个位点上添加一个特定的碱基， 并且由于发生反应后的生物分子末端依然受到光敏保护剂的保护，所以可以通过控制掩 膜透光、蔽光图案以及每次参与偶联反应的聚合用单体分子的种类，就可以实现在特定 位点合成大量预定寡核苷酸序列或寡肽的目的( 图1 4 ) 。光导原位合成法适用于制造寡核 苷酸和寡肽微点阵芯片，具有合成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点。但是 由于其每步的合成效率较低，该方法合成的寡聚核苷酸较短，一般只有几十个碱基。 第二种方法是由斯坦福大学研制的接触式点样法。在芯片的制备过程中，加样针器 通过虹吸作用载入生物样品，然后通过高速精密机械手臂的精确移动让移液头与芯片接 触，送至芯片底物的固相表面，从而将探针涂敷在芯片上。每一轮点样完成后，加样针 会被彻底冲洗干净以免产生交叉污染，然后载入新的样品开始下一轮点样【2 l 】。该方法相 对于原位合成芯片在价格上更具竞争力，同时因为探针是通过生物方法制得的，所以探 针的长度没有像a 脚n e 臼讧的探针那样受到限制，甚至数百个碱基的探针也能制备，该 5 浙江理工大学硕士学位论文 _ - - - 1 - r i 冒- u - t 一- 一- - _ 遨i i i 遨i i i 监ii 岭燃 f g a t c g i 邈t c c 燕墨t t c 托巡t t 盥t ooo lt g 黪c o - a l o h o t 、幽r e p e b t 甾i 渔。立业幽 图1 4d n a 芯片光导原位合成法流程图 f i g 1 4t h es c h e m a t i co fl i g h t - d i r e c t e di ns i t us y n t h e s i so f d n ac h i p 【2 2 】 优点使得它有更好的选择性。 化学喷射法是由i n c y t ep h a r m a c e u t i c a l 公司首先研制并采用，是将d n a 合成试剂按 一定的顺序逐层喷射到芯片指定位置，合成寡核苷酸来制作芯片。通过压电晶体或其他 推进形式从喷嘴内将生物样品喷射到芯片的基片上，它与接触式点样法的区别是喷嘴和 芯片基片不发生接触。化学喷射法的缺点在于打印针的尖端每完成一次点样必须重新浸 入探针溶液中打湿，导致针头容易发生堵塞。 第四种方法是a g i l e n t 芯片公司使用的压电喷墨技术【2 3 1 。该方法通过使用4 支分别装 有a ，t ，g ，c 核苷酸的压电喷头在芯片上并行地合成出d n a 探针。其原理同普通的 喷墨打印机一样，只不过装在墨盒里的是单核苷酸。生化样品载入带压电感应装置的喷 嘴，在电流控制下喷嘴有序地开放和关闭，使得样品溶液体精确地喷射在预设的底物位 6 h 嘲聃dh 由触刚h 妇姗 图1 5d n a 芯片( a f 黟m e t r i x ) 单通道实验示意刚4 1 f i g 1 5at i y p i c a lo n ec h a n n e lm i c r o a r r a ye x p e r i m e n t t 4 】 点表面，然后喷嘴同样需要清洗后在循环进行点样。此方法的优点是允许几乎任何感兴 趣的生物样品作为芯片的探针，包括c d n a 、基因组d n a 、抗体和小分子物质等乜制。 1 1 4d n a 芯片的分类 按结构模式可以将d n a 芯片划分为单通道芯片、双通道芯片和芯片实验室 f l a b o n a c h i p ) 三大类。在一张芯片上只用一个来源的实验材料做杂交实验，得到其表达 量的绝对值，这种芯片称为单通道芯片( 图1 5 ) 。如果芯片包含两种来源的生物样本( 一 个为实验样本，另一个作为对照的参考样本) ，分别进行必要的处理后再给以不同的荧光 标记( 一般实验样本用c y 5 ，对照样本用c y 3 ) ，然后在杂交之前将不同来源的样本混合在 一起同芯片杂交，杂交后的芯片要进行两次不同波长的荧光扫描，可以获得同一基因在 两个样本中的表达值及二者的比值，这样的芯片称为双通道芯片( 图1 6 ) 。实验样本和对 照样本分别与两张单通道芯片杂交，也可获得基因表达的相对比值，如a f f y m e t r i x 芯片 图1 6d n a 芯片双通道实验示意图【5 】 f i g 1 6at i y p i c a lt w oc h a n n e lm i c r o a r r a ye x p e r i m e n t 5 】 本身只能用来做单通道实验的芯片杂交，但使用者可以用两张芯片单独对实验样本和对 照样本做比较性地杂交实验，同样能得到其表达量的相对比值。 以微电子加工技术为依托的微型全化学分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a lc h e m i c a la n a l y s i s s y s t e m s ，u t a s ) 最早是m a n z 和w i d m e 在分析化学领域提出的【2 5 】，是通过分析化学、微 机电加工、计算机、电子学、材料科学、医学和工程学等学科的交叉应用来实现化学分 析检测的微型化、自动化、集成化与便携化，其在生物学的应用称为d n a 芯片实验室 f l a b o nac h i p ) 。 芯片实验室将生物化学实验室微型化，即在一个封闭的系统内用很短的时间完成样 品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程( 图1 7 ) 。d n a 芯片实验室同d n a 芯片相 关，但其功能已经超过了传统意义上的d n a 芯片，而是一种高度集成的，融分离、分析 等各种基本实验操作于一体的微型生物化学分析系统。借助于芯片实验室，可以使珍贵 图1 7 芯片实验室示意刚2 6 】 f i g 1 7t h es c h e m a t i co fl a b o n a c h i p 2 6 】 的生物样品和试剂消耗降低到微升甚至纳升级，成倍提高分析速度和降低实验成本，因 此芯片实验室d n a 芯片技术发展的最终目标之一。 1 2 芯片探针设计国内外研究现状 1 2 1 探针对芯片杂交的影响 目前对于d n a 芯片技术的改进研究主要集中于芯片制备、探针设计、芯片杂交条件 优化、芯片扫描图片分析及芯片数据归一化处理等方面【2 7 3 1 1 ，其中芯片探针的设计和选 择是芯片实验的第一步，在很大程度上决定了芯片的数据结果。因为芯片设计上的问题 无法通过算法来得到根本解决，不同的芯片检测结果很大程度上是由于选择了不同的探 针而造成的【3 2 】，这将会导致错误的生物学结论。 在探针设计过程中主要需要考虑探针的特异性和灵敏度两个特性。探针特异性是指 芯片上的探针能与靶标结合而与非靶标不发生结合，这就要求探针和样本中的非靶序列 的连续匹配长度和整体相似度不能过长或过大。探针的灵敏度是指探针与靶序列相互结 合能力的高低，这要求所设计的探针不能形成稳定的二级结构，否则将影响其与靶序列 的杂交结合，使得灵敏度降低。 对芯片数据结果的分析主要是基于芯片扫描图像的杂交信号值，但是芯片的杂交信 号值同其靶序列的实际表达值之间可能存在差异，而芯片杂交信号值的高低来源于探针 同其靶序列的杂交效率，所以选择质量好的探针可以提高对可变剪切或同一基因家族靶 序列的区分程度，以保证芯片数据结果的准确性。 9 浙江理工大学硕士学位论文 d n a 芯片探针主要分为两大类：一类是寡核苷酸探针，这类探针通常是由2 5 7 0 个 碱基组成【3 3 1 ，其中最典型的是a n 眵m e m i x 芯片为其每个转录本设计的一组分离式2 5 n t 探 针洲。最近的研究表明，1 5 0 n t 的探针也可应用于芯片设计p 2 】：另一类是长度可以达到几 百个碱基的全长e d n a 探针1 4 】。短的寡聚核苷酸探针因为难以形成发夹结构，加上具有 更加一致的杂交性质，使其更容易找到匹配的序列位置，从而提高芯片数据的质量口5 3 6 】， 而且7 0 m e r 的寡核苷酸探针可以达到和全长e d n a 探针相似的灵敏度【3 7 】，所以寡核苷酸 探针相对于c d n a 探针应用更为广泛。但是短的寡核苷酸探针和长的靶序列杂交时不能 准确预测【3 3 】，很多为特定m r n a 选择的寡聚核苷酸探针不能有效地和全长转录本杂交绑 定p 9 ，柏】，并且有些寡核苷酸探针存在较差的信噪比瞰，3 引。片段化靶序列可以部分解决探 针的有效绑定问题，但会降低靶序列的总量，还可能打断探针的绑定位点。长的探针( 比 如e d n a 探针或者1 5 0 n t 的寡聚核苷酸探针) 可改善探针的无效杂交问题，但其自身折叠 问题比较严重【4 l 】。 目前有很多软件可用于寡聚核苷酸探针设计，每个软件都有特定的设计标准【4 搠， 有些因素是所有的芯片设计软件都考虑的，特别是探针靶序列的特异性和探针的g c 含 量平衡这两个因素。高质量的探针设计要求在复杂的体系里对芯片的探针杂交情况进行 预测f 刀；b l a s t 是一个被广泛使用的用于生物序列一级机构比对的算法，探针靶序列 的特异性可以通过b l a s t 工具 4 1 1 1 来有效地检测；低复杂度序列是指序列组成上单一或简 单重复，如连续单核苷酸序列、连续二核苷酸序列等，质量好的探针序列中包含的低复 杂度序列要尽可能的小，对低复杂度序列进行过滤，可以避免探针产生非特异性杂交信 号；t m ( 溶解温度) 是影响核酸杂交的重要因素，探针t m 的微小改变可以导致芯片的信 号强度发生较大变化，t m 较高的探针会产生相对较高的芯片信号值【4 9 】，通过平衡探针的 g c 含量及探针的长度，可以简单地产生t m 较为统一的探针；探针与靶序列形成的杂交 双链能量( g ) 也可以影响芯片信号值强度【5 川；探针在特定的实验条件下形成稳定分子内 发夹结构的能力对芯片结果也有很大影响，对探针的发夹结构进行过滤 4 4 , s q ，可以提高 探针和靶序列的杂交效率。 除了考虑探针自身的因素外，研究人员还想出各种方法来优化探针设计，比如 a f f y m e t r i x 公司为其靶序列设计了独特的p m m m 探针方案( 图1 8 ) t 5 2 1 。芯片上的每一个 基因或e s t 都是由一个或几个探针组( p r o b es e t ) 组成，每组探针由1 1 2 0 对2 5 m e r 的探针 对0 r o b ep a i o 组成，每个探针对包括两个探针池( p r o b ec e l l ) ，其中一个探针为完全匹配的 探针( p e r f e c t - m a t c hp r o b e ，v m ) ，长度为2 5 个碱基，它是与目标靶序列完全匹配的；另 图1 8a f f y m e t r i x 独特的p m m m 探针设计【5 3 】 f i g 1 8t h es p e c i f i cp m m mp r o b ed e s i g no fa f f y m e t r i xg e n e c h i p 【5 3 】 一个为错配探针( m i s m a t c hp r o b e ，m m ) ，它除了第十三个碱基与p m 相对位置根据碱基 配对原则改变之外，其余均与p m 完全相同，其主要作用是评估对应的p m 探针的特异 性背景信号【5 4 1 ，使d n a 芯片的特异性达到能区分大部分基因序列的水平。 1 2 2r n a 二级结构及其预测 随着对r n a 研究的逐步深入，r n a 不再被仅仅看做是d n a 到蛋白质之间的一种信息 中介，而是从过去简单、线性、功能单一的形象转变为今天种类多样、结构复杂、功能特 异的新形象。尤其是具有催化性质r n a 的发现，促使了“r n a 世界假说的提出【5 5 1 。现在， r n