（微生物学专业论文）食品级乳酸乳球菌表面展示系统的构建与性能分析.pdf

华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 摘要 乳酸类细菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a ，l a b ) 是一类公认的对人体及动物无致病性和 无定殖力的、在食品和医药医疗领域具有重要应用价值的食品级微生物，而革兰氏 阳性菌( g + ) 乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 是其中的一种具代表性的菌种，受到 研究者的广泛重视。乙酰葡萄糖胺糖苷酶( n - a c e t y l m u r a m i n i d a s e ，a e m a ) 是乳酸乳 球菌的一种主要的自溶素，自1 9 9 5 年被发现以来，国内外对其结构和功能已进行了 定的研究。本研究通过克隆乳酸乳球菌野生型菌株a s l 2 8 2 9 的a c m a 编码基因 a c m a a s ，然后通过构建该基因部分中断的染色体整合重组工程菌，对该部分缺失基 因型的编码活性及其对宿主菌生长和细胞分裂的影响进行了初步考察；在此基础上， 利用缺失性a c m a a s 作为运载蛋白，通过染色体整合作用构建了1 株食品级乳酸乳 球菌表面展示工程菌。 首先通过对已发表的编码a c m a 基因序列的比对分析，设计特定引物，从乳酸 乳球菌菌株a s l 2 8 2 9 中由p c r 反应扩增得到其a c m a 的编码基因，经测序验证为 a c m a 编码基因，命名为a c m a a s 。对a c m a a s 的结构预测结果表明，该蛋白由1 个 具催化活性的n 末端和1 个具细胞壁锚定活性的c 一末端结构域组成，其中c 末端 又由3 个l y s m ( 1 y s i nm o t i f ) 结构域组成，具有典型的“d o 姒b ”型二级结构。进一 步通过体外在a c m a a s 基因中引入红霉素抗性基因( e r a 7 ) 而构建了可以与与宿主菌 染色体a c m a a s 基因进行整合作用的重组质粒p m b 2 5 7 ，导入宿主菌l 1 a c t i s a s l 2 8 2 9 后，通过含有红霉素的平板筛选得到与宿主菌发生染色体整合重组的重组 菌株m b 2 5 7 。通过对生长曲线的测定，菌落形态观察，普通相差显微镜观察和扫描 电子显微镜的观察对该菌株的形态与生长特性进行了初步考察，结果表明该菌株所 携带的a c m a a s n - l y s m l 基因在保留其n 端酶催化活性结构域和1 个l y s m 编码区后， 其编码产物可发挥其完整生物学活性，不影响菌体的正常生长和分裂，该结果不仅 首次证实了单一l y s m 可以行使独立的细胞壁靶位锚定功能，且所探测的同源重组 位点可以用于构建具细胞表面展示活性的染色体整合重组工程菌。 为了构建染色体整合的食品级表面展示工程菌，考察了枯草芽胞杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 菌株b f 7 6 5 8 的种p 一1 ，3 - 1 ，4 葡聚糖酶( e n d o b e t a 1 ，3 1 ，4 g l u c a n a s e ，g l s ) 作为重组乳酸乳球菌菌株的食品级筛选标记的可行性。通过将表面展示g l s 的乳酸 乳球菌工程菌接种在含有燕麦的培养基上，由刚果红染色和n a c l 脱色后可以在平板 食品级乳酸乳球菌表面展示系统的构建与性能分析 上观察到明显的透明圈，从而证明g l s 可作为一种无抗性的筛选标记而用于构建食 品级染色体整合重组菌。在此基础上，构建了以g l s 为筛选标记和乘客蛋白，以 a c m a a s 作为重组位点和运载蛋白的染色体整合质粒p m b 2 6 0 ，在导入乳酸乳球菌受 体菌后，以g l s 作为筛选标记，筛选到表面展示g l s 的染色体表面展示重组工程 茵。对重组菌性能的分析测定、以及进一步用于展示其它功能性外源蛋白的工作仍 然在进行中。 关键词：乳酸乳球菌；a c m a ：g l s ；染色体整合重组；表面展示 i i 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 a b s t r a c t l a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) a r eag r o u po ft h ef o o d g r a d em i c r o o r g a n i s m st h a th a v e b e e nr e g a r d e da sn o n p a t h o g e n i ca n dn o n c o l o n i z e dt oh u m a n ，a n de x h i b i t i n gav a r i e t yo f s i g n i f i c a n ta p p l i c a t i o n si nt h ef i e l do ff o o da n dm e d i c i n em a n u f a c t u r i n g o n eo ft h e s e b a c t e r i a ，t h eg r a m - p o s i t i v el a c t o c o c c u sl a c t i s ，i sa l li m p o r t a n ta n dd i s t i n c t i v es p e c i e st h a t h a sd r a w naw i d e na t t e n t i o no fi n v e s t i g a t o r s n - a c e t y l m u r a m i n i d a s e ( a c m a ) i sam a j o r a u t o l y s i no fl 1 a c t i s i th a sb e e nw i d e l yi n v e s t i g a t e di ni t ss t r u c t u r ea n df u n c t i o ns i n c e 19 9 5 i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h eg e n ee n c o d i n gt h ea c m ap r o t e i n ，w h i c hd e s i g n a t e da s a c m a a s ，w a sa m p l i f i e db yp c rf r o ml 1 a c t i sw i l d t y p es t r a i na s1 2 8 2 9 ，f o l l o w e db y c o n s t r u c t i n gt h ec h r o m o s o m e i n t e g r a t e dr e c o m b i n a n te n g i n e e r i n gs t r a i n st h a th a r b o r i n g t h ep a r t i a l l yd e l e t e da c m a a sf r a g m e n ti nt h eh o m o l o g o u sr e g i o no fc h r o m o s o m e ，t o i n v e s t i g a t et h ei m p a c to ft h ep a r t i a l l y m u t a t e da c m av a r i a n to nt h eg r o w t ha n dc e l l d i v i s i o nc o n d i t i o n so ft h eh o s ts t r a i n f u r t h e r , u s i n ga c m a a sa st h ec a r r i e ra n d e n d o - b e t a - 1 ，3 - 1 ，4 一g l u c a n a s e ( g l s ) f r o mb a c i l l u s s u b t i l i s w i l d - t y p eb f 7 6 5 8a st h e s e l e c t i v em a r k e ra n dt h ef o r e i g np a s s e n g e rp r o t e i n ，af o o d g r a d ec h r o m o s o m e i n t e g r a t e d e n g i n e e r i n gb a c t e r i u mw i t l lc e l l - s u r f a c ed i s p l a y i n ga c t i v i t y , w a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y t h eb l a s ta n a l y s i so fs e v e r a lp r e v i o u s l yp u b l i s h e da c m as e q u e n c e sw a sf i r s t l y p e r f o r m e dt oh e l p t h ed e s i g no ft h ec o n v e r s e dp r i m e r s ，a n dt oa m p l i f yt h ea c m a e n c o d i n gg e n ef r o ml 1 a c t i sa s 1 2 8 2 9s 仃a i n t h er e s u l t i n ga m p l i f i e df r a g m e n tw a s s e q u e n c e da n di d e n t i f i e da st h ea c m a - e n c o d i n gg e n e ，w h i c hw a sd e s i g n a t e da sa c m a a s i t se n c o d e dp r o t e i n ，a c m a a s ，w a sc h a r a c t e r i z e dt h ep u t a t i v es t r u c t u r ea n dd o m a i n o r g a n i z a t i o n t h eo v e r a l la m i n oa c i ds e q u e n c eo fa c m a a sw a ss t r u c t u r a l l yd i s t i n g u i s h e d a sa nn - t e r m i n a lc a t a l y t i cd o m a i nw i t ha5 7a ao fs i g n a lp e p t i d es e q u e n c ea n da c t e r m i n a lc e l l w a l lb i n d i n gd o m a i nw i t ht h r e et a n d e m l ya l i g n e dl y s i nm o t i f s ( l y s m ) t h a t c o n s t i t u t e sam o d u l a rs e c o n d a r ys t r u c t u r eo f “p o c q p ”，a n daf u r t h e rb l a s ta n a l y s i sr e v e a l e d a s i g n i f i c a n ts e q u e n c es i m i l a r i t ys u b j e c t e d t ot h e p r e v i o u s l y i d e n t i f i e d n - a e e t y l g l u c o s a m i n i d a s eo fl 1 a c t i ss u b s p 1 a c t i si l l4 0 3 ，s u g g e s t i n ga c m a a sc o u l db e a l ln - a c e t y l g l u c o s a m i n i d a s eo fa s1 2 8 2 9 t oi n v e s t i g a t ei ft h es o l el y s md o m a i ni s f u n c t i o n a lt ob i n dt oc e l l w a l l ，ac h r o m o s o m e - i n t e g r a t e de n g i n e e r e ds t r a i no fa s1 2 8 2 9 ， i i i 食品级乳酸乳球菌表面展示系统的构建与性能分析 m b 2 57 ，w a sc o n s t r u c t e db yi n t r o d u c i n gac h i m e r i cg e n eo f “a c m a a s c l - e m a c m a a s c 2 ”， w h i c he l i c i t e da ni n t r a c e l l u l a rd u a le x c h a n g e sb e t w e e nh o s tc h r o m o s o m ea n dt h e i n t r o d u c e dg e n e i ts h o w e dt h a tm b 2 57s t r a i ne x h i b i t e dn o r m a ld a u g h t e r - c e l ls e g r e g a t i o n a n dg r o w t hp a r e m ，i n d i c a t e dt h a tt h es o l el y s md o m a i nc a ns e r v ea st h ef u n c t i o n a la c t i v e d o m a i nf o rc e l l w a l lb i n d i n g m o r e o v e r , t h i ss t u d ya l s op r e s e n tap o t e n t i a ls t r a t e g yf o r d e v e l o p i n g ac e l l - s u r f a c e d i s p l a ys y s t e m i nl 1 a c t i st h a tm e d i a t e d b y a c h r o m o s o m e i n t e g r a t e da c m a a sa n c h o r t oc o n s t r u c tt h ef o o d - g r a d ec h r o m o s o m e - - i n t e g r a t e dr e c o m b i n a n ts t r a i nw i t hc e l l s u r f a c ed i s p l a y i n ga c t i v i t y , t h eg l sp r o t e i nf r o mb s u b t i l i sb f 7 6 58s t r a i nw a sc h o s e dt o i n v e s t i g a t et h ef e a s i a b i l i t yo ft h ef o o d - g r a d es c r e e n i n gm a r k e rf o rt h er e c o m b i n a n tl 1 a c t i s t h er e c o m b i n a n ts t r a i no fl 1 a c t i s ，m b13 8 ，w a sc o n s t r u c t e da n dw a st e s t e dt h e a c t i v i t yo fn o n - a n t i b i o t i cs e l e c t i o n i ts h o w e dt h ed i s t i n c tt r a n s p a r e n tz o n e sa r o u n dt h e c o l o n i e st h a tg r e wo nt h es e l e c t i v em e d i u mc o n t a i n i n go a t ，a f t e rc o l o r i z i n gb yc o n g o l e s e d y ea n dd e c o l o r i z i n gb yn a c l ，i n d i c a t i n gg l sc a ns e r v e da st h en o n - a n t i b i o t i cs e l e c t i v e m a r k e rt ob eu s e df o rc o n s t r u c t i o no ft h ec h r o m o s o m e - i n t e g r a t e dr e c o m b i n a n tl 1 a c t i s s t r a i n o nt h eb a s i so ft h e s er e s u l t s ，w ec o n s t r u c t e dt h eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n p l a s m i dm b 2 6 0 ，f o rf u r t h e rc o n s t r u c t i o no ft h ec h r o m o s o m e - i n t e g r a t e dl 1 a c t i ss t r a i n m b 2 5 7 i nt h i ss y s t e m ，g l ss e r v e da st h es e l e c t i v em a r k e ra n dt h ef o r e i g np a s s e n g e r p r o t e i n ，a c m a a sc o n t r i b u t e dt oa n c h o rg l so n t ot h es u r f a c eo ft h et a r g e tc e l l s t h e f o l l o w e da p p r o a c ht oa n a l y z et h ep r o p e r t i e so ft h er e c o m b i n a n ts t r a i n , a n du s e df o r s u r f a c ed i s p l a yo t h e rf u n c t i o n a lf o r e i g np r o t e i ni su n d e rt h ew a y k e yw o r d s l a c t o c o c c u s l a c t i s ；a c m a ； g l s ；c h r o m o s o m e i n t e g r a t i o n r e c o m b i n a t i o n ；s u r f a c ed i s p l a y i v 华中农业大学2 0 0 9 届硕上学位论文 a a a c m a a m p b p e b e m o d p c r g l s t e a m i n oa c i d 缩略语表 n - a c e t r l m u r a m i n i d a s e a m p i c i l i n b a s ep a i r e t h i d i u mb r o m i d e e r y t h r o m y c i n o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 1 3 - 1 ，3 - 1 ，4 一g l u c a n a s e t r i se d t a v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 年月 日 是否保密 名 如需保密，解密时问 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究z - 作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究蚴： 认皲 帆呷年钿m 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以周不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者鲐么级耕签名俐 签名吼叫年勿胡 签名魄2 口0 7 年月忉 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 前言 1 1 乳酸菌及其表达系统概述 1 1 1 乳酸菌概述 乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a ，l a b ) 在自然界分布广泛，人类对于乳酸菌的应用 历史是非常久远的，在远古人类就在酿造和食品等方面不自觉地利用了乳酸菌，特 别是用于奶制品生产和肉、蔬菜、面包、株草的发酵等方面。但是，随着近百年来 生命科学的发展，人类才主动地去研究和掌握乳酸菌的生活规律，并加以应用，随 着7 0 年代分子生物学的迅速发展，有关乳酸菌等分子生物学的研究取得了飞速的发 展，并使乳酸菌的应用范围有了大范围的扩展。 乳酸菌是一类以糖为原料发酵产生乳酸革兰氏阳性细菌，生殖方式为裂殖。目 前在自然界已发现的乳酸细菌在细菌分类学上划分为2 3 个属。这些属包括：乳杆菌 属( l a c t o b a c i l l u s ) 、肉食杆菌属( c a r n o b a c t e r i u m ) 、双歧杆菌属( b i f i d o b a c t e r i u m ) 、链球 菌属( s t e p t o c o c c u s ) 、肠球菌属( e n t e r o c o c c u s ) 、乳球菌属( l a c t o c o c c u s ) 、明串珠菌属 ( l e u e o n o s t o e ) 、片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 、气球菌属似e r o c o c c u s ) 、奇异菌属似t o p o b i u m ) 、 漫游球菌属( v a g o c o c c u s ) 、李斯特氏菌属( l i s t e r i a ) 、芽抱乳杆菌属( s p o r o l a c t o b a c i l l u s ) 、 环丝菌属( b r o c h o t h i x ) 、丹毒丝菌属( e r y s i p e l o t h r i x ) 、孪生菌属( g e m e l l a ) 、糖球菌属 ( s a c c h a r o c o c c u s ) 、四联球菌属( t e t r a g e n o c o c c u s ) 、酒球菌属( o e n o c o c c u s ) 、乳球形菌 属( l a c t o s p h a e r a ) 、营养缺陷菌属( a b i o t r o p h i a ) 、魏斯氏菌属( w e i s s e l l a ) 和芽胞杆菌属 ( b a c i l l u s ) a l p 的少数种( p o u w e l se ta 1 。1 9 9 8 ) 。这些微生物都与乳酸发酵有关，其中乳 酸杆菌和双歧杆菌与人畜机体保健有着更为密切的关系。 乳酸菌由于长期以来一直为人们所食用，普遍认为是安全的( g e n e r a l l y r e c o g n i z e da ss a f eg r a s ) 微生物有机体( g i l l i l a n d 19 9 0 ) 。选择乳酸菌作为表达宿 主菌是因为其具有益生作用，能通过改善人和动物菌群平衡而对机体产生有利的影 响。乳酸菌控制着人体生态菌群的平衡，不断清除有毒物质，抵御外来致病菌的入 侵，对常见致病菌如痢疾志贺氏菌( s h i g e l l ad y s e n t e r i a e ) 、鼠伤寒沙门氏菌( s a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m ) 、致病性大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 、葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u s ) 等 食品级乳酸乳球菌表面展示系统的构建与性能分析 有拮抗作用。乳酸菌做为益生菌可以缓解乳糖不耐受症，增加肠道有益菌和抑制病 源菌，增加机体免疫力，降低胆固醇，降血压，抑制肠癌发生等作用( 程波财和魏 华，2 0 0 1 ) 。 正是基于乳酸菌的这一优良性状，使得近年来乳酸菌除了在传统的乳制品发酵 ( a l p i n ee ta 1 ，1 9 9 8 ) ，益生菌的应用等方面获得广泛应用外( n a i d ue ta 1 ，1 9 9 9 ) ， 乳酸菌工程菌在口服疫苗的研制( h oe ta 1 ，2 0 0 5 ；r i b e i r oe ta 1 ，2 0 0 2 ) ，外源蛋白的 表达( b e r m u d e z h u m a r a ne ta 1 ，2 0 0 3 ；e n o u fe ta 1 ，2 0 0 1 ) 等方面也得到越来越广泛 的关注和应用。而这些广泛的应用都依赖于乳酸菌中食品级表达系统的建立，只有 食品级的可以稳定遗传的表达载体才可以在生产生活中有实际的应用价值。 1 1 2 乳酸菌食品级表达系统 乳酸菌表达系统只有符合以下几点要求的表达系统才能称之为食品级的表达系 统载体必须是食品级的，由来自同源宿主或密切相关的安全型微生物的d n a 组 成，且不含有非食品级功能性d n a 片段：宿主菌必须为食品级且为可鉴定及稳定 遗传的微生物：此外，在食品中或进入人的消化道后必须是非常稳定的；选择标记 必须为食品级的，传统的乳酸菌载体为保持一定的选择压力都带有一个或多个编码 特定的抗生素( 红霉素、氯霉素) 抗性的基因，但因抗性因子的转移，将其投放到环 境、人或动物体内会带来严重的生物安全性后果，因此应采用食品级选择标记代替抗 生素标记：诱导物必须为食品级的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、乳酸菌肽等可食 用物质( v o s ，1 9 9 9 ) 。 1 1 3 食品级诱导物 随着对乳酸菌的分子调控机制研究的深入，已经开发出了很多对于乳酸菌比较 适用的食品级的诱导表达系统。由于糖在乳酸发酵中的重要作用，随着对有关糖利 用和转运代谢的基因操纵子的研究深入，开发出很多糖诱导的表达系统。w e l l s 等应 用l 1 a c t i s 的乳糖诱导表达系统成功的在乳酸乳球菌中表达了破伤风毒素，其表达量 达到细胞总蛋白的2 2 ( w 色l l s ，1 9 9 3 ) 。l o k m e n 等使用木糖作为诱导物，应用戊 糖乳杆菌( l b p e n t o s u s ) x y l 基因的表达受木糖诱导的原理，运用l b p e n t o s u s 的x y l 基因的启动子表达乙酰转移酶( a c e t y l t r a n s f e r a s e ，c a t ) ，木糖培养基中的c a t 的活 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 性比葡萄糖培养基中的活性高6 0 8 0 倍( l o k m a ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 乳链球菌素n i s i n 是一种具有抗微生物活性的小分子多肽，广泛用于食品防腐， 对人体安全无毒( 李铁军等，2 0 0 2 ) 。它的生物合成受到n i s k ( 激酶) 和n i s r ( 调 节蛋白) 的双组分调节系统的控制( k u i p e r se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。这种小肽信息素依赖的调 节系统在革兰氏阳性菌中广泛存在，根据这种调节系统，开发出了多种乳酸菌的 n i c e 诱导表达系统( 图1 - 1 ) 。该系统表达的产物可以达到细胞总蛋白的1 0 一 6 0 ，产量提高数千倍( d er u y t e re ta 1 ，1 9 9 6 ) 。现在已经成功地用这种表达系统表 达丙氨酸消旋酶( b r o ne ta 1 ，2 0 0 2 ) ，真核生物蛋白质也能用该系统实现过量表达 ( e n o u f e ta 1 ，2 0 0 1 ；m o n n ee ta 1 ，2 0 0 5 ；r i b e i r oe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。已经有报道利用这种 系统研制出多种活菌疫苗( e n o u fe ta 1 ，2 0 0 1 ；g r a n g e t t ee ta 1 ，2 0 0 1 ；r i b e i r oe ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。加入微量的n i s i n 就可以诱导表达，并且不需要持续的添加诱导物，依靠表 达系统产生的n i s i n 就可以实现持续的诱导表达。正是基于n i s i n 诱导系统这种安全， 高效，应用广泛的优点，已经越来越成为人们研究的热点，并应用于更广泛的领域。 此外，根据乳酸菌噬菌体的各种调控机制的研究，还开发出了噬菌体0 3 1 爆发 式诱导的表达系统( 0 s u l l i v a ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 表达p 半乳糖苷酶和温控表达系统( n a u t a e ta 1 1 9 9 7 ) 。这两种诱导表达系统都能使表达量提高5 0 0 10 0 0 倍。虽然在技术上 还存在些问题，如温控表达系统可能导致一些热休克蛋白的表达，都需要噬菌体 的感染才能诱导表达，因此为实际的利用造成很大的限制，并且对应用于持续的生 产造成一定的困难，但是仍然为其进一步的研究做出了有益的探索。 1 1 4 食品级筛选标记 无论利用乳酸菌做何种的表达系统和表达载体，都需要一个有效的筛选标记做 为筛选重组工程菌的标记。传统的乳酸菌载体的筛选标记一般都是编码特定的抗生 素( 红霉素，卡那霉素等) 的外源基因。在外源选择压力下，使有效的选择标记。 但是在将工程菌投入到环境，食品等实际应用的时候，抗生素标记就不符合实际的 需要，因此，开发出食品级的选择标记就是构建食品级表达系统的必然要求。近年 来，利用显性选择标记和互补选择标记构建了多种乳酸菌的食品级克隆载体。 品级乳酸乳球菌表面艇谦统的构建与性能仆析 图卜1n i s i n 诱导的基因表达示意图( m i e r a ue 1 a 1 ，2 0 0 5 ) f i g 1 - 1 s e b e m e t er e p r e s e n c a t i o no fr d s i n - i n d u e e dg e n e 41 显性选择标记 显性选择标记是利用乳酸菌本身具有的特性进行标记，以乳酸链球菌素( n i s i n ) 抗性基因、噬菌体扰性基因等基因代替抗生素抗性基因作为选择标记。 乳酸茵中使用做多的选择标记是细菌素抗性标记，n i s i n 是其中研究最深入的细 菌素( t a k a l aa n ds a r i s ，2 0 0 2 ) 。n i s i n 是一种食品级具有抗微生物活性小分子多肽， n i s i n 抗性基因可用作显性选择标记。根据n i s i n 抗性基因构建的第一个食品级载体系 统含有来自乳酸乳球菌的n i s i n 抗性标记h f ，( f r o s 乱ha n d m c k a y 。1 9 9 1 ) 。f r o s c t h ， h u g h e s 等利用n i g 基因构建了食品级克隆载体p f m 0 1 2 ，表达编码细菌噬菌体抗性 的e c o r i 片段，导八乳酸乳球菌乳酸亚种l m 0 2 3 中表达，利用n i s i n 抗性筛选转化 子，获得了具有噬菌体抗性表型特征的工程菌，证明n 矿表型特征可以直接筛选转 化子，可代替传统的抗生素抗性标记( m c k a y , 1 9 9 2 ；m c k a y , 1 9 9 1 ) 。随着对n i s i n 生物合成的分子机理的研究的深入，可以利用n i s i n 合成的操纵子中的免疫基因n 耐 用作乳酸乳球菌及其他乳酸菌的食品级显性选择标记( t a k a l aa n d s a n s 2 0 0 2 ) 。随着 不唰的菌株中n i s i n 抗性基因被更多的克隆，人们还丌发了多种乳酸乳球菌食品级系 统，其选择标记是1 1 i s i n 抗性决定子n l s 的同源标记基因( p l a t t c e u we ta 1 1 9 9 6 ) 。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 除了乳酸乳球菌，乳酸菌中的乳杆菌属、明串珠菌属和片球菌属中也有n i s i n 敏 感菌株，可以用作n s 7 做为选择标记的宿主菌，但是分泌n i s i n 并具有对n i s i n 的抗 性是很多乳酸菌的优良性状，是用在食品防腐等方面的一个重要因素，用做基因工 程菌的宿主菌就不能破坏这一性状，因此给其应用造成了很大的局限。使用可以产 n i s i n 的乳酸菌做为用甩做选择标记的表达载体的宿主菌，就要先破坏其对n i s i n 的 抗性，实际的应用也是一个限制。 乳酸菌在发酵过程中对糖的利用是它的典型特征，随着对乳酸菌的糖代谢过程 的认识的深入，针对其对糖的利用开发出了许多食品级的选择标记。可以将发酵特 殊糖类的乳酸菌的特定基因当做筛选标记，用做不能利用这种特殊糖的乳酸菌的筛 选。一般的乳酸菌中通常不存在a 一半乳糖苷酶基因( a g a ) ，不能利用蜜二糖发酵， 因此可将a g a 作为筛选标记，蜜二糖为筛选物构建食品级表达系统。b o u c h c r 等利用 来自棉子糖乳球菌的a g a 基因做为筛选标记，成功构建了乳酸乳球菌和嗜酸片球菌 ( p e d i o c o c c u sa c i d i l a c ti c i ) 的食品级载体( b o u c h e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 乳糖是乳酸菌可以普遍利用的糖类，乳酸菌乳糖操纵子的研究也很深入。通过 构建乳糖利用的缺陷体，就可以通过构建互补型载体利用乳糖作为筛选物筛选重组 菌。l a c f 基因编码乳酸乳球菌乳糖磷酸转移酶系统的关键酶i ia ，首先构建乳酸乳 球菌肠护基因的突变体或缺失体，然后构建含有l a c f 基因做为筛选标记的互补型 载体，就可以利用乳糖进行筛选，已经利用这种载体成功表达了了大肠杆菌b 葡糖 醛酸酶基因 鲥) 和人谷胱甘肽转移酶及c u z n 超氧化物歧化酶( h a s h i b ae ta 1 ， 1 9 9 2 ；x i a n g e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。但是这种表达系统受中间产物塔格糖6 磷酸的诱导，并 且诱导效率不高，使其应用受到限制。 此外，利用l b p e n t o s u s 中发酵木糖相关基因x y l r a b ( 编码d 木酮糖激酶) 做 为筛选标记，可以使不能利用木糖的干酪乳杆菌发酵木糖，但是木糖的价格较贵及 发酵速度低等原因限制了其应用( p o s n oe ta 1 ，1 9 9 1 ) 。l e e n h o u t s 利用来自于戊糖片 球菌( p e d i o c o c c u s p e n t o s a c e u s ) 的蔗糖基因做为筛选标记构建了乳酸乳球菌整合载 体，并表达了来自谢氏丙酸杆菌( p r o p i o n o i b a c t e r i u ms h e r m a n i i ) 的p r o l i n e i m i n o p e p t i d a s e 基因，但是这个系统需要高剂量的蔗糖以利于宿主菌稳定利用蔗糖发 酵，故限制了其利用( l e e n h o u t se ta 1 。1 9 9 8 ) 。 利用某些微生物对重金属的抗性基因，开发出了一些具有重金属抗性的表达载 体，利用镉抗性基因做为筛选标记在乳酸乳球菌和嗜热链球菌中成功构建了食品级 食品级乳酸乳球菌表面展示系统的构建与性能分析 表达载体( l i ue ta 1 ，1 9 9 6 ) ，利用铜抗性基因作为标记也构建成功了食品级表达载 体( w o n g e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。但是重金属离子具有毒性，所以这类表达载体的实际应用 受到限制。 一些球菌中存在对噬菌体的天然的防御机制，如吸附机制，限n 修饰，流产感 染等系统，以防止噬菌体的感染和增殖。随着对噬菌体抗性机制的研究的深入，构 建了以噬菌体抗性为筛选标记的表达系统，这些系统可以保护对噬菌体敏感的工业 菌株免受噬菌体的感染，而且多个噬菌体抗性机制可用于筛选标记( de ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。 1 1 4 2 互补选择标记 互补选择标记是指先将宿主的染色体特异性突变，然后利用质粒的选择标记来 补充宿主染色体的缺失突变，从而恢复宿主菌的原有特性进行筛选的方法。互补筛 选标记通常是建立在对编码与代谢相关的重要基因的研究的基础之上，一个最大的 优点就是在选择压力下，即使在工业发酵期也可以保持质粒的稳定遗传( e m o n de t a 1 2 0 0 1 ) 。细菌的某些基因编码的产物催化细菌的基本代谢反应，或者在其中起 关键的作用。这些基因的突变或者缺失后不能合成相应的酶或不能催化反应，导致 细菌在外界环境中或基本培养基中不生长或生长不良，需要补充相应的底物，称为 营养缺陷型细菌。营养缺陷型菌株在其质粒上克隆入同源的或异源的互补基因后， 可使其恢复原始的表型。 t h y a 基因编码胸苷酸合成酶，在d n a 的合成中起关键作用，缺失t h y a 基因的菌 株在基本培养基上不能生长。根据这种原理，f u 等先通过三甲氧苄氨嘧啶诱变剂诱 变处理获得t h y a 缺失的嗜酸乳杆菌，并成功构建了以t h y a 基因为选择标的载体( f u a n dx u ，2 0 0 0 ) ，在此基础上，s a s a k i 等在嗜热链球菌中成功利用f 嘲基因做为筛选 标记表达 s b o v i s 淀粉酶基因( s a s a k ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 d 丙氨酸是细胞壁不可缺少的成分，可是在工业发酵培养基只含有l 丙氨酸， 因此，微生物的生长需要将培养基中的l 丙氨酸转化为d 丙氨酸的a i r 基因编码的 消旋酶。根据这个原理，可以将a l r 基因用作食品级互补筛选标记。b r o n 等构建了 表达a i r 基因的质粒，用该质粒转化a i r 基因突变的植物乳杆菌和乳酸乳球菌后，这 两个a i r 基因突变的宿主菌能在无d 型丙氨酸的培养基中生长，表明成功的利用a i r 6 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 互补标记构建了植物乳杆菌和乳酸乳球菌的食品级选择系统。该质粒的一个特性是 除了能应用于a r 基因突变的宿主菌外，还能应用于利用d 环丝氨酸( d - c y c l o s e r i n e ， 是丙氨酸消旋酶的竞争抑制剂) 作为营养物的乳酸菌。因此，a r 既可为显性标记又 可作为互补标记( b r o ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 t h r 基因参与天冬氨酸到苏氨酸的转化过程，t h r 缺失菌株不能合成苏氨酸而表 现为营养缺陷型。h o m t h r b 操纵子编码同型苏氨酸脱氢酶一同型苏氨酸激酶，参与天 冬氨酸苏氨酸的转化过程。因此，对工1 a c t i sm g l 3 6 3 的h o m t h r b 操纵子进行删 除，可以构建苏氨酸营养缺陷菌株。h o m t h r b 缺失菌株不能合成苏氨酸，需要补充 额外的苏氨酸供生长。以h o m t h r b 操纵子为选择标记构建的载体能够对1 a c t i s m g l 3 6 3 的h o m t h r b 缺失菌株提供良好的功能互补，从而能在无苏氨酸的培养基 中生长，并利用该载体表达外源蛋白( g l e n t i n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 无论是显性选择标记还是互补选择标记，都需要筛选特定的宿主菌或者对宿主 菌进行分子改造，以适应所用的筛选标记，因此，在挑选要使用的筛选标记之前， 对所用宿主菌进行一系列的调查是必须的，没有一种标记可以适用于所有的乳酸菌， 而且大部分的筛选标记都要对宿主菌进行一系列的分子改造才能够用于实际的应 用。 1 1 5 外源基因导入乳酸菌的方法 一般将外源基因导入乳酸菌的方法有两种，一种是选定一个对乳酸菌的正常生 长和性状表现无损的基因做为同源重组位点，构建染色体同源重组质粒，将外源基 因整合到乳酸菌染色体上，实现整合性表达( h e n r i c he ta 1 ，2 0 0 2 ) 。另一种方法是 将携带有外源基因的质粒载体导入乳酸菌，在外界选择压力下，质粒驱动表达外源 基因( b o s m ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 2 细菌表面展示技术及应用进展 1 2 1 表面展示技术的概念 细菌细胞表面