（化学工程专业论文）dα生育酚聚乙二醇琥珀酸酯制备工艺研究.pdf

浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 )摘要 摘要 d - a 生育酚聚乙二醇琥珀酸酯( t p g s ) 作为生育酚的衍生物，它既含有生 育酚的亲脂基团，又含有聚l - - 醇长链的亲水基团，是一种非离子型表面活性剂， 也是一种有效的生育酚补充剂和吸收促进剂，作为各种辅料在食品、药品和保健 品市场上有着广泛的应用前景。本文研究了d - a 生育酚聚乙二醇琥珀酸酯的分析 方法和制备工艺，同时对于其产品性质和分离工艺作了一定的探索。 首先，对于t p g s 的分析，本文采用高效液相色谱法，c 1 8 柱为固定相分析 t p g s 和小a 生育酚琥珀酸酯( t a s ) ，同时建立了碱催化水解的方法准确定量 t p g s 中的0 【生育酚含量。本文也建立了c 3 0 柱为固定相分析t p g s 单酯、双酯 和t a s 的高效液相色谱法。 对于t p g s 的合成，采用高纯度d - a 生育酚琥珀酸酯( 含量 9 0 ) 与聚乙 二醇1 0 0 0 ( p e g ) 进行酯化反应，得到t p g s 粗品，通过对于各种反应条件的选 择对合成工艺进行优化。优化工艺为：反应温度为1 2 0 ，p e g t a s 约为3 ( m o l m 0 1 ) ，催化剂用量为0 7 ( 、矶) ，氮气鼓泡且无溶剂化的合成工艺。在该 合成条件下，d - a 生育酚琥珀酸酯的转化率为9 2 以上，t p g s 单双酯比值大于 1 0 。 本文还对t p g s 的纯化工艺做了初步探索，以实验室自制品为原料，采用模 拟移动床( s m b ) 进行分离，c 1 8 硅胶填充柱作为分离介质，乙腈异丙醇混合 溶液作为溶剂，通过s m b 分离纯化后能够得到纯净的t p g s 双酯产品( 9 9 ) 。 另外考察了硅胶柱层析对自制反应粗品的分离效果，选定1 0 0 - 2 0 0 目粗孔硅胶， 流动相为二氯甲烷乙酸乙酯甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，上样浓度0 4 3 6g h d 为最佳条件，通过硅胶柱吸附可以将t p g s 单酯提纯到1 0 0 ，同时总回收率达 到9 4 以上，已经优于e a s t m a n 公司的t p g s 商品( 单酯含量约9 0 ) 。 本文对自制的t p g s 产品进行了结构确证及性质表征。通过对核磁共振氢谱 和傅利叶红外光谱的解析，证实了产品中t p g s 单酯与双酯结构的存在。通过基 质辅助激光解吸电离飞行质谱结果分析得到t p g s 单双酯的数均分子量分别为 1 5 5 1 、2 0 4 5 ，平均聚合度分别为2 2 2 、2 1 8 等分子量信息。通过示差扫描量热分 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) 摘要 析得到它们的熔点温度( 结晶温度) ，以及通过热失重法分析了它们的热稳定性、 热降解温度，t p g s 单双酯之间表现出不同的热降解过程。 关键词：d - a 生育酚聚乙二醇琥珀酸酯，h p l c ，化学结构表征，模拟移动床， 硅胶柱层析 浙江火学硕士学位论文( 2 0 1 0 )a b s t r a c t a b s t r a c t d - 0 【一t o c o p h e r y lp o l y e t h y l e n eg l y c o ls u c c i n a t e ( t p g s ) i saw a t e r - s o l u b l e d e r i v a t i v eo fv i t a m i ne i tc o n s i s t so fap o l a rp e gt a i la n dah y d r o p h o b i ca t o c o p h e r o l h e a d ，i san o n i o n i cs u r f a c t a n ta n da ne f f i c i e n tv i t a m i nes u p p l e m e n ta n da b s o r p t i o n e n h a n c e r t p g sh a sb e e nw i d e l ya p p l i e di nf o o d ，p h a r m a c e u t i c a la n dn u t r i t i o n a l s u p p l e m e n tf i e l d i nt h i sp a p e r , t h ea n a l y s i s ，p r e p a r a t i o na n ds e p a r a t i o no f 办a t o c o p h e r y lp o l y e t h y l e n eg l y c o ls u c c i n a t ew a ss t u d i e d a n dt h ec h a r a c t e r i z a t i o no f t h et p g se s t e r sw a sa l s op e r f o r m e d f i r s t l y , w ed e v e l o p e d t h eh p l cm e t h o dt o a n a l y z et h e 办0 【- t o c o p h e r y l p o l y e t h y l e n eg l y c o ls u c c i n a t ea n dd - a - t o c o p h e r y l a c i ds u c c i n a t e ( t a s ) u s i n gc18 s i l i c aa st h es t a t i o n a r yp h a s e a ne s t e r o l y t i cp r o c e d u r ec a t a l y z e db yk o hw a s d e v e l o p e dt oq u a n t i f yt h e0 【一t o c o p h e r o lc o n t e n to ft h ed - a - t o c o p h e r y lp o l y e t h y l e n e g l y c o ls u c c i n a t ep r o d u c t ah p l cm e t h o dw a sa l s op r o p o s e dt od e t e r m i n et h em o n o a n dd i - t p o s ，t a sw i t hac 3 0s o r b e n ti nt p g sm i x t u r e t h e nt h ep r e p a r a t i o no fd - a t o c o p h e r y lp o l y e t h y l e n eg l y c o ls u c c i n a t ew a s s t u d i e d i tw a sf o r m e db ye s t e r i f y i n gah i g hp u r i t yt a s ( 9 0 ) w i t hp e g10 0 0 e f f e c t so ft h er e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d t h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e a sf o l l o w s ：r e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s12 0 ( 2 ，n ( p e g ) n ( t a s ) w a s 3 ( m o l m 0 1 ) ， c a t a l y s ta m o u n tw a so 7 ( 叭) ，n i t r o g e nw a sb u b b l e di n t ot h er e a c t i o nm i x t u r ea n dn o s o l v e n tw a su s e d t h ec o n v e r s i o no f 正q - t o c o p h e r y la c i ds u c c i n a t ew a sh i g h e rt h a n 9 2 t h em o l a rr e l a t i v ev a l u eo ft h em o n o - a n dd i - t p g sw a sh i g h e rt h a n10 a t t e m p tw a sm a d et op u r i f yt h e 正0 【一t o c o p h e r y lp o l y e t h y l e n eg l y c o ls u c c i n a t e a s i m u l a t e dm o v i n gb e d ( s m b ) p r o c e s sw a su s e dt os e p a r a t et h et p g sm i x t u r e t h e s m bs e p a r a t i o nw a sc a r r i e do u tw i t hc18s i l i c ap a c k e dc o l u m na st h es o r b e n t a n a c e t o n i t r i l e i s o p r o p y la l c o h o lm i x t u r ew a su s e da st h ee l u t i o ns o l v e n t d i t p g sw i t h ah i g hp u r i t y ( 9 9 ) w a so b t a i n e da f t e rt h es m bp u r i f i c a t i o np r o c e d u r e t h es i l i c a g e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw a sa l s oa p p l i e dt os e p a r a t et h em i x t u r e t h eo p t i m u m i v - 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) a b s t r a c t c o n d i t i o n so fs i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw e r ea sf o l l o w s ：m a c r o p o r es i l i c ag e l ( 10 0 2 0 0m e s h ) ，ad i c h l o r o m e t h a n e e t h y la c e t a t e m e t h y la l c o h o lm i x t u r ew a su s e da s t h es o l v e n t 、 ，i 1g r a d i e n te l u t i o n ；t h el o a do fs a m p l ec o n c e n t r a t i o ni nm o b i l ep h a s e w a s0 4 3 6g m 1 t h ep u r i t yo fo b t a i n e dm o n o - t p g sw a si n c r e a s e dt o10 0 w i t ha t o t a lr e c o v e r yh i g h e rt h a n9 4 ，w h i c hi sb e t t e rt h a nt h ee a s t m a nt p g sp r o d u c t ( m o n o - t p g sc o n t e n t9 0 1 t h es t r u c t u r e sa n d p r o p e r t i e so f t h eo b t a i n e dt p g sp r o d u c t sw e r ef u r t h e rs t u d i e d t h ec h e m i c a ls t r u c t u r e sw e r ec h a r a c t e r i z e db y1 hn m ra n df t - i rs p e c t r o s c o p y , a n d t h er e s u l t sc o n f i r m e dt h eo c c u r r e n c e so fm o n o a n dd i t p g s m o l e c u l a rd i s t r i b u t i o n p r o p e r t i e sw e r es t u d i e db ym a l d i - t o fm ss p e c t r o s c o p y t h em a l d i t o fm s r e s u l t ss h o w e dt h ed e g r e e so fp o l y m e r i z a t i o no ft h et w oe s t e r sw e r e2 2 2 ，21 8 ， r e s p e c t i v e l y a n dt h e n u m b e r - a v e r a g e d m o l e c u l a rm a s s e sw e r e15 51 ，2 0 4 5 ， r e s p e c t i v e l y t h em e l t i n gt e m p e r a t u r e so ft h et p g se s t e r sw e r ei n v e s t i g a t e db yd s c a n dt h et h e r m a ls t a b i l i t i e sw e r ed e t e r m i n e db yt g a ，s h o w i n gt h ed i f f e r e n tt h e r m a l d e g e n e r a t i o nc o u r s e so fm o n o a n dd i t p g s k e yw o r d s ：小0 l - t o c o p h e r y lp o l y e t h y l e n eg l y c o ls u c c i n a t e ，h p l c ，c h e m i c a ls t r u c t u r e c h a r a c t e r i z a t i o n ，s i m u l a t e dm o v i n gb e d ，s i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y - v 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 墨l 签字日期：加口年弓月i1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙鎏太鲎有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 殇锻 u 签字日期：劢1 。年弓月| j 日 聊躲撰冶 导师签名：锱l 签字日期：哟l 哞乞月 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) 致谢 致谢 衷心感谢我的导师杨亦文教授，两年多以来，老师一直很细心很耐心的教 导我，为实验指明研究方向，提出了很多宝贵的经验和方案，为我创造了许多锻 炼与学习的机会。从文献研读至论文撰写，先生都无不给予悉心指导。身为一个 科研工作者，杨老师的钻研探索精神以及对工作认真负责的科研态度令我钦佩万 分。杨老师开阔的胸襟以及对生活的乐观和自信也影响着我，在此论文即将完成 之际，给予最衷心的感谢。 实验过程中，感谢任其龙老师的指导，提出了很多宝贵的研究思路和方案， 任老师的严格要求和渊博学识给了我很多帮助。在此还要对课题组众多老师的帮 助表示感谢，苏宝根老师在日常实验中给我了很多意见和建议，黄小柳老师在液 相操作中给予了很多帮助，苏云老师、潘水泉老师在实验中试剂和设备问题的解 决，还有邢华斌老师、鲍宗必师兄、方兆华师兄等的授道解惑。 实验期间还要感谢张海、杨启炜、董新艳等师兄师姐以及章飞燕、雷华杰、 陈蔚、卫俊杰、刘瑞阳、朱魏等我的同学，在我实验过程中给予了很多宝贵的建 议和帮助，使得实验可以顺利开展。特别要感谢张海师兄，在忙碌自己繁重的科 研任务同时，总是很热心的帮助我解决实验中的困难，在此预祝他顺利取得博士 学位! 实验期间还得到了浙江林学院农业与食品科学学院常银子老师和课题组师 弟师妹们的鼎立协助，王朝锋、闫海燕等，实验的结果有你们的功劳。最后还要 感谢我们课题组的所有成员，有你们，实验室才有欢声笑语，使得这将近三年的 实验室生活变得充实与轻松，这段生活是我生命中很有意义的一段。 要感谢我的父母和家人，他们总是默默的支持我，还有我的室友和好朋友， 有你们的支持，我才这么勇敢的面对困难。 此外要感谢国家“十一五”科技支撑计划食品功能因子高效分离与制备关 键技术的研究( n 2 0 0 7 0 2 0 4 ，2 0 0 6 b a d 2 7 8 0 3 ) 项目对本文工作的资助。 馑以此文献给所有关心我的朋友! 王靖媛 2 0 1 0 年1 月于浙大求是园 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 )绪论 第1 章绪论 1 1 引言 生育酚( t o c o p h e r 0 1 ) 又名维生素e ( v i t a m i ne ) ，自从1 9 2 2 年发现以来，已经 成为了维生素领域的研究热点。1 9 3 6 年，从麦胚中分离出生育酚的第一个生物活 性成分，称为0 l 一生育酚。天然0 【生育酚具有很强的生理、药理活性，而且与化学 合成生育酚相比，具有更高的生物活性和安全性。生育酚具有显著的抗衰老、抗 肿瘤、预防心血管疾病、提高机体免疫力等功能，是人类生命活动中不可缺少的 维生素。 天然生育酚结构上含有酚羟基，因此容易被氧化，同时由于是脂溶性维生素， 对于体内吸收和利用带来了一定的限制。天然0 l 生育酚的衍生物，如醋酸酯、烟 酸酯、琥珀酸酯，对于其理化性质有了一定的改善，这些0 【生育酚的酯化产品一 定程度上改善了0 【生育酚的不稳定性。但是这些a 生育酚的衍生物仍属于脂溶性 生育酚，因此在体内吸收和利用依然不便。通过进一步对天然0 【生育酚的结构进 行修饰，使得其具备一定的水溶性，则得到了一系列水溶性生育酚的衍生物，如 t r o l o xc ，a 生育酚琥珀酸聚l - - 醇1 0 0 0 ( t p g s ) 等。其中，0 【生育酚琥珀酸聚乙 二醇1 0 0 0 在研究中已经表现出独特的优势。 d - a 生育酚聚乙二醇琥珀酸酯是水溶性的生育酚衍生物，由小a 生育酚琥珀 酸酯与聚乙二醇1 0 0 0 酯化而成，它具有一定的表面活性剂性质，可以作为增溶 剂、吸收促进剂、乳化剂、增塑剂以及脂溶性药物传递系统的载体。另外d - a 生育酚聚l - - 醇琥珀酸酯还可作为生育酚的营养补充剂，来治疗一些生育酚吸收 障碍症。 国外对于t p g s 已经研究并连续生产多年，而在国内对其合成等工艺研究报 道非常少。对于已有t p g s 相关文献中提出的若干种合成方法，仍旧需要进行筛 选来确定合适的工艺路线；对于t p g s 混合产品中各成分分析以及t p g s 体系的 分离方法，文献很少报道，但是对于整个生产工艺确是至关重要的。本文根据文 献，对t p g s 的制备、分析、分离等工艺做了相关的研究。为具体的工艺优化提 供依据。 浙江大学硕上学位论文( 2 0 1 0 )绪论 1 2 生育酚的概述 1 2 1 生育酚的结构与命名 生育酚( t o c o p h e r 0 1 ) ，即传统所指的维生素e ( v i t a m i ne ) ，也被称为产妊酚、 抗不育因子、抗不孕维生素、生殖维生素等【l 捌，是脂溶性的维生素，也是人和 动物必需的一种营养物质。生育酚是天然母育酚衍生物的混合物，母育酚即6 羟基2 甲基2 ( 4 ，6 ，1 2 三甲基十三烷基) 氧杂萘满( 见图1 1 ) ，是能够或多或少显 示d - a 生育酚生物活性的衍生物总称1 4 1 。a 生育酚与其对应同系物的相同之处在 于它们均含有苯并二氢毗喃的成分。根据分子结构中2 位上支链双键的不同可以 分为生育酚和生育三烯酚，又根据母体中的甲基数不同可以分为a 生育酚、p 生 育酚、y 生育酚和6 生育酚四种同系物1 5 j ( 见图1 2 ) 。 h o 图1 1 母育酚结构示意图 木为手性碳原子 r l ：c h 3r 2 ：c h 3 a 一生育酚， r l ：c h 3 ，r 2 ：hp - 生育酚 r 2 ：c h 3r 2 ：h y 一生育酚， r l ：hr 2 ：h6 一生育酚 图1 2 生育酚结构示意图 浙江大学硕上学位论文( 2 0 1 0 )绪论 1 2 2 生育酚的性质 a 生育酚化学名称为3 ，4 二氢2 ，5 ，7 ，8 一四甲基一2 ( 4 ，8 ，1 2 三甲基十三烷 基) 2 h 一1 苯并吡喃6 醇，是淡黄色无臭无味粘稠状液体。仅生育酚的分子量为 4 3 0 5 ，分子式c 2 9 h 5 0 0 z ，熔点为2 5 3 5 。c ，相对密度d 4 2 5 = 0 9 5 0 ，不溶于水，易 溶于乙醇，混溶于丙酮、氯仿、乙醚和植物油。对热和酸相对比较稳定，露置于 空气中则缓慢氧化，有铁盐、银盐存在时氧化较快【5 1 。 生育酚在过氧化物、单纯态氧、氧气等存在的一些温和的条件下，氧化途 径和产物非常复杂，同时生育酚的氧化过程还受到许多条件如光照强度、金属 离子、底物、溶剂、生育酚浓度、温度、p h 值等影响。 生育酚可以由天然提取得到，也可以由人工合成得到。合成生育酚主要指全 消旋的a 生育酚，由三甲基氢醌与异植物醇合成得到，记为d 1 0 【生育酚。由于 生育酚结构部分有三个手性碳原子存在，因此根据r ，s 构型命名规则，人工合 成的每一种类似物又都含有组分相等的8 种异构体，即r r r ，r r s ，r s s ，s s s ， r s r ，s r s ，s r r ，s s r 。天然的生育酚八种类似物的构型都是r r r 型。对0 【 生育酚来说，由于合成生育酚是一个8 个光学异构体组成的外消旋体，没有旋光 性，生物活性没有天然0 【生育酚强和安全，人们更加倾向于使用天然的a 生育 酚提取物。 生育酚的生理活性与其分子结构密切相关。通过实验研究比较测定维生素e 类似物与0 【生育酚转运蛋白( 0 【t o c o p h e r o lt r a n s f e rp r o t e i n ，简称c 【t t p ) 结合的 亲和能力，推测不同类似物的生物活性的差异，得到结果如下表1 1 ，也进一步 验证了维生素e 生理活性与分子结构的相关性【刚。 表1 1 不同维生素e 类似物与仅生育酚转移蛋白( 仅t t p ) 的相对亲和力 维生素e 类似物相对亲和力( ) 0 【生育酚 p 一生育酚 丫生育酚 6 生育酚 a 生育酚醋酸酯 0 【生育酚氢醌 l o o 3 8 1 + 9 3 8 9 + 0 6 1 6 + 0 3 1 7 士o 。1 1 5 + 0 1 浙江大学硕上学位论文( 2 0 1 0 )绪论 1 2 3 生育酚的用途 由于生育酚独特的抗氧化作用，它被广泛应用于美容、保健、医疗等多方面。 生育酚在临床应用上已有多年历史。近年来，天然生育酚已经成为各个国家中老 年人风行的防病保健、延年益寿的补充剂。甚至很多人在青年时期就已经有意识 的进行生育酚的补充。 随着时间推移和科技的不断发展，人们陆续发现了生育酚的许多用途，如抗 氧化功能，生育酚与自由基结合，代替其他物质被氧化，从而保护了细胞及组织 结构的完整性，使机体功能正常运作；抗癌功能，它对于治疗宫颈癌、前列腺癌、 皮肤癌、胃癌及肺癌均有一定疗效；增强机体免疫功能，生育酚通过增强体液免 疫、提高细胞介导的免疫应答、影响吞噬细胞功能等作用来影响机体免疫状态。 补充生育酚可以提高血液中免疫球蛋白水平，增强对疫苗或其他抗原产生抗体的 能力【_ 刀；另外还有抗不育功能和保护细胞膜的作用。美国心脏协会也指出，补充 剂中的生育酚能帮助防止心脏病。 总的来说，a 生育酚作为一种细胞内抗氧化剂，能够抑制有毒的脂类过氧化 物的生成，对脑垂体中脑系统有调节作用，促进腺激素的产生，预防细胞生理 衰老，防止致癌物游离基的产生。它对于动脉硬化、冠心病、血栓、习惯性流产、 妇女不育症、月经失调、内分泌机能衰退、肌肉萎缩、贫血、脑软化、肝病、癌 症等许多方面有重要的应用价值，因此对于a 生育酚的研究一直未曾止步。 1 2 4 生育酚的衍生物 1 2 4 1 生育酚的酯化物 正是因为生育酚在光照，受热下易氧化的缺点，在一定程度上限制了生育酚 的广泛应用，因此也导致人们在追求保留其高度生物活性的同时，也在对它的结 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 )绪论 构改性上做了不少的努力。一些研究热点集中在a 生育酚的酚羟基的改性，如生 育酚醋酸酯、琥珀酸酯、琥珀酸钙、烟酸酯、亚油酸酯等【8 1 ，现在商品生育酚产 品一般只含有0 【生育酚或其相应的醋酸酯、烟酸酯或琥珀酸酯。这些a 生育酚 的酯化产品改善了生育酚的不稳定性能。0 【生育酚及其酯的生物活性数据具体见 表1 2 。 表1 2d - a 一生育酚及其酯的生物活性【9 】 从上表可以看出，生育酚酯类衍生物的生理活性比相应的生育酚要低，同时 由于a 生育酚醋酸酯在体外直接与0 【一t t p 的亲和力比0 【生育酚的低许多，因此可 以推测生育酚酯类衍生物主要不是以酯类衍生物的形式被吸收利用。事实上，生 育酚酯类的衍生物是被胰脂肪酶水解后才被小肠细胞吸收的【1 0 , i l l 。 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 )绪论 虽然通过将0 【一生育酚制备成酯的形式，在一定程度上保留了其活性，也增加 了稳定性，但是由于这些酯类产品仍然是不溶于水的物品，因此当人们使用它们 的时候仍然不便，因此，当前出现了的研究新热点是将0 【生育酚进一步改性，通 过结构修饰，将其改造为易溶于水的水溶性维生素。 1 2 4 2 水溶性生育酚 天然生育酚为油溶性，造成一定程度上的吸收和利用的不便，特别是对于一 些肝病患者，无法吸收利用，缺乏较多。而水溶性生育酚( 其衍生物) 在人体吸收 时不需要油脂与胆汁酸的参与，可以直接被小肠吸收【7 1 。现在常见的水溶性生育 酚产品主要有以下几类：t r o l o xc ，生育酚琥珀酸聚乙二醇1 0 0 0 ( 办a t o c o p h e r y l p o l y e t h y l e n eg l y c o ls u c c i n a t e ，t p g s ) ，生育酚单糖苷( t o c o p h e r o lm o n o g l u c o s i d e ， t m g ) ，以及生育酚磷酸酯盐【1 2 1 等等。 t r o l o xc 是最早发现的具有生育酚特性的水溶性生育酚，其化学名为 6 - h y d r o x y 一2 ，5 ，7 ，8 - t e t r a m e t h y l c h r o m a n - 2 c a r b o x y la c i d ，结构上相当于生育酚分子的 长支链被一个羧基取代，因此可以视为生育酚的衍生物【1 2 1 。典型的结构如下图 所剥1 3 1 ： r r l o l l ( c h ) ，一c o h r l ，r i ，r l ”：可以分别是氢，低碳数烷烃 r 2 ：可以是氢，低碳数烷烃，苯基 。i i 0 或1 图1 3t r o l o x c 典型结构图示例 这种水溶性生育酚衍生物具有维生素的抗氧化、抗辐射等功能，在药理试验 浙江大学硕上学位论文( 2 0 1 0 ) 绪论 中常将其作为水溶性生育酚的模板化合物，用作生育酚与其他活性成分对比 【1 4 ，1 5 】 o 生育酚单糖苷是一种较新颖的水溶性生育酚产品，它基本上保留了生育酚抗 氧化、抗辐射和保护组织等功效，同时克服了生育酚不溶解在水中的缺点。制备 方法是将生育酚与乙酰化的葡萄糖在硫酸存在的条件下进行1 6 】。 另外一个研究热点就是生育酚聚乙二醇琥珀酸酯1 0 0 0 ，它是较早开发并且 研究也较成熟的产品，国外已经有成熟的工业化产品。而本课题就是基于以上研 究现状，着重于对t p g s 进行了研究。 1 3a 生育酚聚乙二醇琥珀酸酯，t p g s t p g s 最早在1 9 5 0 年由美国e a s t m a n 公司生产，随后在1 9 6 0 年发现它可以 作为增溶剂应用，随后关于其毒性、安全性的报道出现，2 0 世纪8 0 年代开始用 它来治疗生育酚缺乏症，之后越来越多的研究开始关注于其自身特征和应用，特 别是做为环孢素、维生素d 等难吸收物质的吸收促进剂，以及止血剂载体的局 部应用等等【1 7 】，至今已经研究并连续生产多年，在国外现已广泛应用于制剂研 究中。 t p g s 是由a 生育酚琥珀酸酯与聚乙二醇酯化反应而得，它既含有生育酚亲 脂基团，又含有聚乙二醇长链的亲水基团，是一种非离子型表面活性剂。t p g s 除了能溶于水之外，还具有良好的表面活性和保湿性能，因此被认为可以在化妆 品、食品和药品中作为润湿剂、抗氧化剂和表面活性剂，是一个多功能的添加剂。 1 3 1t p g s 的结构与性质 t p g s 是由0 【生育酚琥珀酸酯( 0 【t o c o p h e r y la c i ds u c c i n a t e ，t a s ) 与聚乙二 醇( p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ，p e g ) 酯化反应而得。一般这里用的聚l - - 醇平均分 子量为1 0 0 0 ，因此也将t p g s 称为t p g s l 0 0 0 ，一般情况下提到的t p g s ，都是 指t p g s l 0 0 0 ，t p g s 平均分子量约1 5 1 3 。 具体从结构上看，它既含有生育酚亲脂基团又含有聚乙二醇长链的亲水基 团，因而具有表面活性剂的性质。 浙江大学硕上学位论文( 2 0 10 )绪论 。h ：，：一矿( h 2 c ) 2 一c 。 图1 40 【生育酚琥珀酸酯结构图 c h 3 c h 3 图1 5a 生育酚聚乙二醇琥珀酸酯结构图 t p g s l 0 0 0 含有聚合度为2 3 的聚乙二醇链，它是一种白色到浅棕色的蜡状 固体，以o r , 生育酚计其生育酚含量不得少于2 6 0 3 0 0 m g g ，生物活性约为 3 8 7 - 4 4 7 i u g ，熔点3 7 4 1 ，酸值不超1 5 ，比重( 4 5 下) 约为1 0 6 。能与水 混溶，旋光度不超过+ 2 4 0 ，h l b 值约为1 3 2 ，在空气中能稳定存在【18 1 。有研究 证实长期存放的t p g s 稳定性依然较好，见表1 3 。 表1 3 存放于环境中t p g s 长期稳定性试验1 7 】 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 0 ) 绪论 半皂化后的0 【生育酚含量 未检测 t p g s 作为营养补充剂保存在氧气、热、光或氧化剂等条件下不会发生降解。 采用d s c 检测t p g s 在空气中的热稳定性，结果显示t p g s 加热到1 2 5 时可稳 定1 小时。此外还发现t p g s 在热介质、冷介质及冷热循环条件下仍然稳定，没 有降解现象。根据e a s t m a n 公司 1 8 1 的研究，t p g s 在碱性条件下不稳定，t p g s 在p h 大于1 0 和p h 小于1 2 的时候水解的速度很快。将熔融的t p g s 注入6 0 9 0 。c 的水中，当t p g s l 0 0 0 质量分数2 0 以内时，t p g s 能够迅速地吸收部分水，形 成可溶的凝胶颗粒；继续搅拌2 h 可形成完全可溶的凝胶1 9 1 。若超过此浓度，将 形成高黏度的液晶相。随着在水中浓度的增加，液晶相的结构逐渐变化，从各向 同性的球状胶束到圆筒状胶束、正反六角形胶束、反球状胶束，最后成薄层片状 液晶态。从热力学角度看，它的每一相都有着规整的晶体结构和热力学性质。此 外，t p g s 在形成其它液态晶体相时不需要加入其它的表面活性剂【1 8 】。同时， t p g s 具有比较低临界胶束浓度，c m c = 0 0 2 。 美国药典【2 0 】中提到，t p g s 是由a 一生育酚琥珀酸酯与聚乙二醇酯化反应得到 的一种混合物，主要由是t p g s 单酯构成，同时也含有少量的t p g s 双酯，规定 以d - a 生育酚计，含量不能小于2 5 。同时对于酸价规定如下，将1 0 9 t p g s 溶 于2 5 m l 由酚酞指示和被0 1 n 氢氧化钠中和至中性的乙醇与乙醚( 1 ：1 ) 混合溶液 中，加入o 5 m l 酚酞指示剂后，用0 1 n 氢氧化钠滴定到振荡3 0 秒后溶液仍呈微 粉红色，所使用的氢氢化钠溶液不能超过0 2 7 m l 。 s a d o q i l 2 1 1 等人首次采用稳态荧光光谱技术对商品t p g s1 0 0 0 和t p g s4 0 0 水溶液的临界胶束浓度( c m c ) 、表观聚集数( n a g g ) 以及微粘度等性质进行了 浙江大学硕士学位论文( 2 0 10 ) 绪论 表征，给出了两种t p g s 水溶液的特征参数，得到的c m c 数值与前期文献报道 值吻合。 1 3 2t p g s 的制备 早期的研究中主要利用助溶剂对生育酚的助溶解作用来制备脂溶性生育酚 的水溶液，总的思路都是将某种助溶剂先加热熔化，随后加入生育酚，形成澄清 水溶液，一般来说这类助溶剂包括一系列环氧烷烃衍生物特别是与多元醇或其多 元酣。这种产物从严格意义上来说并不能算是水溶性生育酚，却为后来合成t p g s 提供了一定的思路和研究基础【2 2 。2 4 】。 现在一般认为t p g s 是由生育酚琥珀酸酯与聚乙二醇1 0 0 0 酯化反应而得。 o h o 十? 亍h 3 r ：十c h 2 c h 2 c h 2 c ih t c h 3 图1 6t p g s 合成反应方程式 由于酯化反应是可逆的，为完成反应通常采用过量的反应原料，加入能与水 共沸的溶剂，把水不断从反应体系中带出，使反应向右进行。酯化反应是通过加 成一消除机理进行的，首先是羧酸的羰基被质子活化，然后醇作为亲核试剂进攻 羰基碳，最后在酸催化下脱水生成酯2 5 1 。 o | | r c o hr j 亘毽r 一堇二。h 墨 i o h l h + h - - z ，o - - r c o h = ；= 一 i o r h q r 。 o h + l l = ；= r c o r 图1 7 酸催化酯化双分子反应历程 泺 h 一 +oc r 浙江人学硕士学位论文( 2 0 1 0 )绪论 因此酯化反应最好要在溶媒中进行，一些常用的有机溶剂，如甲苯，二氯乙 烷，苯，或类似的惰性溶剂。反应中催化剂的存在可以推动酯化反应的进行，例 如硫酸、草酸、盐酸、三氯乙酸等类似的酯化反应催化剂。酯化反应中，如果酯 化反应过程中生成的水可以由共沸精馏除去，那么可以促进酯化反应的进行。 如果利用缩合剂如二环己基碳二亚胺( d c c ) ，催化剂4 一二甲氨基吡啶 ( d m a p ) 反应时，可认为酸与d c c 或者其它活化剂生成活性酯之后离去，进而 生成酯或者酰胺，d c c 在反应后生成二环己基脲( d c u ) 。 现在国外对于其合成方法的研究已经非常成熟，而国内仍处于起步阶段。主 要报道的制备方法有： c a w l e y 等【2 6 1 将t a s 与p e g 溶于甲苯，在硫酸的催化下进行酯化反应2 小 时，再经过萃取，真空下旋蒸后得到t p g s 粗产品。 合成中p e g 尽量要通过蒸馏，溶剂萃取或者其它的分离方法将低分子量的 组分除去，因为分子量4 0 0 - 4 5 0 0 的组分，特别是4 0 0 以下的会降低酯在水中的溶 解性。因此，最佳的方法是将平均分子量为1 0 0 0 的p e g 原料进行蒸馏，除去约 1 5 的低沸点组分。 c o l l n o t 等【2 7 1 将t a s 溶解于二氯甲烷，1 ：1 等量的加入p e g ，室温下搅拌， 加入d m a p ( 4 - d i m e t h y l a m i n o p y r i d i n e ) 和d c c ( n n 一d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e ) ， 盖上反应器后通宵搅拌，反应混合物通过布氏漏斗过滤，将残留物减压浓缩得到 粗品。同时在文中指出，通过合成不同的p e g 链，其活性有差异，p e g l 0 0 0 是 其中最具活性的。 通过研究认为，原料p e g 的分子量最好要在6 0 0 以上，是为了使产物可以 有好的水溶性，当p e g 有分子量低于6 0 0 时，合成得到的t p g s 水溶性不理想， 虽然仍可以在溶解度小于1 的时候使用。水溶性好的产品可以由通过提高p e g 的分子量，如高于6 0 0 来获得，但是这种合成得到的t p g s 分子量通常在6 0 0 0 以上。为了获得高活性的生育酚同时非活性成分较低，最好的p e g 分子量实际 上不要超过2 0 0 0 为宜，因此最佳的分子量是在6 0 0 1 5 0 0 。 此外，也有制备t p g s 类似物质的研究报道。z h a n gy u e h u a 等【2 8 】将t a s 和 聚氧乙基甘油醚1 0 0 0 溶于三氯甲烷中，在d c c 和d m a p 存在的条件下，室温 反应2 0 h 后，将混合液用布氏漏斗过滤，再将滤液减压蒸馏。所得残留物溶于一 浙江大学硕士学位论文( 2 0 10 )绪论 定量的按一定比例配制的乙酸乙酯和正己烷溶液，进一步沉淀除去二环己基脲； 滤液减压蒸馏，残留物再用正己烷二乙醚混合液( 体积比为5 1 ) 洗涤3 次，真空 干燥得油状物质。文中同时报道了合成一些类似结构的包括有生育酚疏水基团和 聚氧乙烯亲水基团的化合物，两者可以简单的共价连接，也可以将两个生育酚基 团通过聚氧乙烯键连接，形成有x 或y 构型的化合物。 1 3 3t p g s 的分离 由于酯化得到的t p g s 粗品主要是由生育酚聚乙二醇琥珀酸单酯和双酯组 成，还需要将其进行进一步的分离；另外由于原料p e g 的分子量有一定的分布， 因此得到的t p g s 也是具有一系列分子量的混合物，低分子量的产品会影响最终 产品的溶解性，分子量过高则会造成单位质量中活性成分浓度过低，因此服用剂 量增加，也不利于使用，所以需要将反应得到的t p g s 粗品进行分离。 由于t p g s 的水溶性，可以利用来- 9 有机相进行分离，因此c a w l e y 等【2 6 】提 出可以将商品p e g 直接进行酯化反应，再将得到的产品用石油醚或苯与石油醚 ( 2 0 8 0 ) 的溶剂进行萃取，将较不水溶的成分萃取出来，或是用结晶方法得到目 标产品，结晶溶剂可以是乙醇或异丙醇。 c o l l n o t 等【2 7 】报道了将t p g s 粗品用制备色谱h p l c 将其单酯和双酯分离。 色谱条件为：色谱柱：c 8 柱，2 5 0 m m 4 1 4 m m ，流动相采用a 甲醇乙腈 2 5 7 5 ( v ；b 正丙醇乙腈2 5 7 5 ( v v ) ；c 正丙醇，进行梯度洗脱，洗脱条件为： a2 4 m i n ，b6 m i n ，c1 2 m i n ，流速为8 0 m l m i n 。 1 3 4t p g s 的检测 t p g s 的检测方法比较少，主要有报道的是有h p l c 、d s c 等方法。 b e r n a r d 等冽采用h p l c 检测t p g s ，h p l c 检测条件为：色谱柱：i n e r t s i lc 8 柱，4 6n u n 1 5 01 1 2 i 1 ，5 p 粒径；流动相为a 乙腈异丙醇( 5 0 5 0 ，v v ) ，b 去离 子水，梯度洗脱；步骤1 ：由6 0 a 变为1 0 0 a ，洗脱时间4 0 m i n ；步骤2 ：1 0 0 a ，洗脱时间1 0 m i n ；步骤3 ：1 0 0 a 变为6 0 a ，洗脱时间：l m i n ；流动相流 速：1 0 m l m i n ；紫外检测器：2 8 0 n m ；进样量：2 0 “l 。 g o o d 等【3 0 1 建立了一种以生育酚醋酸酯作为内标，能够同时分析t a s 和t p g s 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1