（生物物理学专业论文）辅酶q10的结构及其与生物膜分子的相互作用研究.pdf

辅酶q 。o 的结构及其与生物膜分子的 相互作用研究 专业生物物理学 研究生杨小乐指导教师孙润广教授 摘要：辅酶q l o 广泛存在于各种组织细胞尤其是心肌细胞中的线粒体中，是组织细 胞内具有重要作用的活性酶，在细胞线粒体呼吸链即电子传递系统中起递氢体作 用，是细胞呼吸链的重要组成部分，参与a t p 的合成。它也是一种公认的氧自由 基清除剂，其异常的代谢与人体的许多疾病相关联，人为的补充辅酶o l o 能减缓许 多病症。辅酶o 。o 的结构与其功能有关，但是对辅酶q l o 的结构与功能的关系、溶 液构像等方面的研究报道尚不多见。因此，在分子水平上探寻辅酶q 1 0 的结构定会 对揭示线粒体疾病病理起重要作用。 本论文在前人研究的基础上，利用l b 膜技术和原子力显微镜技术，以猪心肌 线粒体为材料，运用醇碱皂化法从动物组织中提取辅酶q 1 0 运用多种物理手段进 行鉴定，然后将其装配到模拟生物膜中，用l b 膜技术研究其与生物膜的相互作用， 同时用原子力显微镜技术( 廿m ) 探测其在溶液中的构象、模拟生物膜的结构进 而确定其在生物膜中的位置。从辅酶q 1 0 与模拟生物膜的相互作用以及在溶液中构 象入手，有可能为辅酶q l o 在生物膜中的位置、生物利用度等热点问题提供线索。 目前通过实验研究，取得如下研究结果： 1 本研究发现皂化时间在3 0 r a i n ，皂化温度在9 矿c 时辅酶0 1 0 产量最高。在 纸层析提纯实验中，以苯：乙醇( 1 ：2 ) 作展开剂时，r f 值和斑点直径均适宜， 可以得到很好的分离效果。 2 p c ( p e ) 分子膜中加入辅酶q l o 后，相变均出现了延缓。这就为t h o m a sh a u b 等的结论提供了证据。即辅酶q 。o 并没有位于分子膜内，而是位于疏水区，同时碳 氢链伸入膜层当中，有可能起到抑制质子漏的作用，维持一定的梯度。p c ( p e ) 分 子膜中先加入胆固醇，可以很明显的看到第二次相变较原来更加明显。接着加入 辅酶q l o ，我们看到膜压迅速增大，相变趋于平缓。同时我们可看到辅酶0 l o 对p c 的影响比对p e 的影响更具有规律性。而先加入辅酶q l o ，再加入胆固醇，同样我 们可以看到膜压迅速增大，并且p c 分子膜膜质较p e 分子膜膜质更为稳定，这可 能与分子的形状有一定的关系。 3 制得的辅酶q 精品通过原子力显微技术在分子水平上观测其结构。我们 可推测辅酶q l o 分子呈链状。随着辅酶q l o 一乙醚溶液的稀释，辅酶q 1 0 在云母表 面呈现6 类拓扑结构。其在云母表面较容易形成片状多孔区域。 4 辅酶q l o 与其它生物分子的相互作用较为明显：( 1 ) g m 与辅酶0 1 0 作用后 均呈岛屿状。g m l 与辅酶q l o 作用后平整度较低，g m 2 、g m 3 与辅酶q 1 0 作用后 较为平整，但其中有数个孔状。( 2 ) 一般情况下胆固醇对细胞膜起稳定作用，可是 加入辅酶0 l o 后明显的增强了膜的通透性。( 3 ) p e ( 1 0 0 u l ) + c o q l 0 ( 1 0 0 u l ) 组合膜较 为平整，而纯p e 的a f m 图像膜质比较粗糙。p e ( 1 0 0 u l ) + c o q l 0 0 0 0 u l ) + c h o l ( 1 0 0 u l ) 三相组合膜质较为复杂，聚集体形状较为各异。( 4 ) 当比例为p e ：c o q l 0 ：p b s ( 2 0 m ：1 0 m ：5 m | ) 时，p e c o q l o 脂质体的形状和大小较为均匀，平均直径约1 4 0 r i m 。 以上研究成果为辅酶q l o 在生物膜中的方位、作用，溶液构象及在体内的生 物利用度等问题的研究提供了重要的资料，对丰富和进一步发展辅酶q 1 0 结构与功 能等有重要意义，同时也为辅酶q 1 0 的应用积累了资料。 关键词：c o q l o ，a f m ，l b ，溶液构像，相互作用，脂质体 t h e s t u d yo fc o q l 0s t r u c t u r e a n dt h e i n t e r a c t i o n b e t w e e nc o q l 0a n db i o m e m b r a n em o l e c u l e s m a j o r ：b i o p h y s i c s p o s t g r a d u a t e ：y a n gx i a o - l e a d v i s o r ：s u nr u n - g u a n g a b s t r a c t ：c o e n z y m eq 1 0w i d e l y e x i s t si ne a c hk i n do fh i s t i o c y t ei np a r t i c u l a ri n m i t o c h o n d f i o no ft h ec a r d i cm u s c l ec e l l ，i so n ek i n do fi m p o r t a n ta c t i v ee n z y m ei n c a r d i cm u s c l ec e l l ，r e a c ta se l e c t r o nt r a n s f e rs y s t e mi nb r e a t h - c h a i no fm i t o c h o n d r i o n , a n di sai m p o r t a n tp a r ti nb r e a t h - c h a i n ，p a r t i c i p a t e si na t ps y n t h e s i s i ti sa l s oo n ek i n d o fo x y g e nf l e er a d i c a le l i m i n a t i o nm e d i c i n a lp r e p a r a t i o n i t su n u s u a lm e t a b o l i s mi s c o n n e c t e d 研t l lm a n yd i s e a s e s a n da r t i f i c i a l s u p p l e m e n t o fc o e n z y m e0 1 0c a n s l o w d o w nm a n yi l l n e s s t h es t r u c t u r eo fc o e n z y m eq l oi sr e l a t e dw i t hi t sf u n c t i o n ，b u t t h e r ea r cf e wr e s e a r c hr e p o r t sa b o u tt h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e ni t ss t r u c t u r ea n di t s f u n c t i o n , c o n f o r m a t i o ni ns o l u t i o n t h e r e f o r e ，i ti sv e r yi m p o r t a n tt os t u d yt h es t r u c t u r e o fc o e n z y m eq l oi nt h em o l e c u l a rl e v e lt om a k et h em i t o c h o n d r i o nd i s e a s ep a t h o l o g y k n o w n i nt h ef o u n d a t i o no fp r e d e c e s s o rs t u d y ，w eg a i nc o e n z y m eq 1 0i np i gc a r d i c m u s c l e ， a n du s em a n yk i n d so fp h y s i c sm e t h o dt oi d e n t i f y ，t h e na s s e m b l ei tt ot h eb i o m e m b r a n e n e x ts t u d yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ec o a n z y m eq 1 0a n dt h eb i o m e m b r a n eb yl b ，a n d i n v e s t i g a t ei t sc o n f o r m a t i o ni ns o l u t i o n , d e t e r m i n et h ep o s i t i o ni nt h eb i o m e m b r a n eb y m i c r o s c o p et e c h n o l o g y ( a f m ) t h ei n t e r a c t i o na n dt h ec o n f o r m a t i o n i ns o l u t i o n o b t a i n e dh a st h ep o s s i b i l i t yt op r o v i d et h ec l u ef o ri t sp o s i t i o n i nt h eb i o m e m b r a n e ，t h e u s i n gd e g r e ea n d s oo n a tp r e s e n tt h r o u g ht h ee x p e r i m e n t a ls t u d y ，w eo b t a i n st h ef o l l o w i n gr e s e a r c hr e s u l t ： 1 t h i sr e s e a r c hd i s c o v e r st h a ti ti st h em o s ta p p r o p r i a t ew h e nt h es a p o n i f l e dt i m ei s 3 0 m i n ，t h es a p o n i f i e dt e m p e r a t u r ei s9 0 0 c i nt h ep a p c r - c h r o m a t o g r a p h i ce x p e r i m e n t ， w h e nb e n z e n e ：e t h a n o l ( 1 ：2 ) ，t h er fv a l u ea n dt h es p o td i a m e t e ra r es u i t a b l e ，m a y o b t a i nt h eg o o ds e p a r a t i o ne f f e c t 2 a f t e ra d d i n gt h ec o c n z y m eq i oi nt h ep c ( p e ) m o l e c u l a rf i l m ，t h ec h a n g eo fp h a s ei s d e l a y e d a n dt h i sh a sp r o v i d e dt h ee v i d e n c ef o rt h ec o n c l u s i o no ft h o m a sh a n be t c n a m e l yc o e n z y m eq l oh a sn o tl i e di nm o l e c u l a rf i l m ，b u tl o c a t e di nt h eh y d r o p h o b i c r e g i o n ，a tt h es a m et i m ee n t e r st h eh y d r o g e nc h a i nt ot h em e m b r a n e a d d i n gt h e c h o l e s t e r o lm o l e c u l a ri nt h ep c ( p e ) m o l e c u l a rf i l m ，w em a yf i n dt h a tt h es e c o n dp h a s e m c h a n g ec o m p a r a t i v e l ym o r eo b v i o u s t h e na d d i n gc o e n z y m eq 1 0 w ec a ns e et h e m e m b r a n ep r e s s u r ei n c r e a s e sr a p i d l y ，a n dt h ep h a s e - c h a n g ef l a t t e no u t s i m u l t a n e o u s l y w eo b s e r v et h a ti ti sm o r er e g u l a rt h a tc o e n z y m eq 1 0i n f l u e n c ew i t hp ct op e b u t w h e nw ea d dt h ec o e n z y m eq 1 0m o l e c u l a re a r l i e r ，a n dt h e na d dt h ec h o l e s t e r o l m o l e c u l a r ，w em a ys e et h es a m er e s u l t ，a n dp cm o l e c u l a rf i l mi sm o r es t a b l et op e m o l e c u l a rf i l m ，t h i sm a yh a v ec e r t a i nr e l a t i o n s h i p sw i t ht h em o l e c u l a rs h a p e 3 w eo b s e r v et h es t r u c t u r eo fc o e n z y m eo l om o l e c u l a rb ya f m a n dw em a y e x t r a p o l a t et h a tt h ec o e n z y m eq l om o l e c u l a ri sc a t e n a r i a n a l o n gw i t ht h ec o e n z y m e q l o - e t h e rs o l u t i o nd i l u t i o n , c o e n z y m eq 1 0m o l e c u l a rp r e s e n t s6k i n do ft o p o l o g yi nt h e m i c as u r f a c e i ti se a s i e ri nt h em i c as u r f a c et of o r mt h el a m i n a t e dp o r o u sr e g i o n 4 t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc o e n z y m e so l oa n do t h e rb i o m o l e c u l a ri sv e r yo b v i o u s ： ( 1 ) t h ee o e n z y m eq l om o l e c u l a ra c tw i t hg mm o l e c u l a r , t h es u r f a c ep r e s e n t si s l a n d s h a p e w h e nt h eg m im o l e c u l a ra c tw i t hc o e n z y m eq l om o l e c u l a r , t h es u r f a c ei sv e r y r o u g h ，b u ti ti sm o r es m o o t hw h e nt h eg m 2 ，g m 3m o l e c u l a ra c tw i t hc o e l l z y m eq l o m o l e c u l a r , a n dt h e r ea r em a n yp o r e s ( 2 ) i nt h eo r d i n a r yc i r c u m s t a n c e st h ec h o l e s t e r o l m o l e c u l a rc a ns t a b i l i z et h ec e l lm e m b r a n e ，b u ta f t e ra d d i n gt h ec o e n z y m eq 1 0m o l e c u l a r ， t h ep e r m e a t i o no ft h ec e l lm e m b r a n eh a sb e e ne n h a n c e d ( 3 ) t h em e m b r a n eo f p e ( 1 0 0 u l ) + c o q x 0 ( i o o u l ) i sm o r es m o o t h b u tt h ep em e m b r a n ei sv e r yr o u g h a n d t h em e m b r a n eo fp e ( 1 0 0 u l ) + c o q i o ( 1 0 0 u l ) + c h o l ( 1 0 0 u l ) i sv e r yc o m p l e x ，t h e s h a p e o f a g g r e g a t e s a r e v a r i o u s ( 4 ) w h e n t h e p r o p o r t i o n i sp e ：c o q i o ：p b s ( 2 0 m ：1 0 m ：5 m 1 ) ，t h es h a p ea n ds i z eo fp e c o q i ol i p o s o m e s i su n i f o r m ，a n dt h e d i a m e t e ri sa b o u t1 4 0 h m t h ea b o v er e s u l t sp r o v i d ei m p o r t a n ti n f o r m a t i o nf o rt h ep o s i t i o na n df u n c t i o n i nb i o m e m b r a n e ，c o n f o r m a t i o ni ns o l u t i o n ，a n dt h eu s a g ed e g r e ee r e a n de n r i c ha n d d e v e l o p t h et h e o r yo ft h e e o e n z y m eq l o s t r u c t u r ea n df u n c t i o n , s i m u l t a n e o u s l y a c c u m u l a t et h em a t e r i a lf o rt h ec o e n z y m eq i oa p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：c o o l o ，a f m ，l b ，c o m f o r m a t i o n ，i n t e r a c t i o n ，l i p o s o m e 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文 中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：扬! 匣日期：坌丝笸! 垡 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者始垒型! 丝日期：垃望 第一章绪论 1 1 引言 辅酶q 是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，不同来源的辅酶q 其侧链 异戊烯单位的数目不同，人类和哺乳动物是1 0 个异戊烯单位，故称辅酶q l o 。1 9 5 7 年由f r e d e r r i c k 从牛心线粒体中分离得到，同年c r a n e 等确定其是线粒体呼吸链上 的组分之一1 1 】，1 9 5 8 年w o l f 等初步粗略的确定了其复合结构1 2 i ，6 0 年代证实了辅 酶0 1 0 在呼吸链中起重要作用，1 9 7 5 年以来m i t c h e l l 提出o 循环，指出辅酶q 1 0 在能量转化系统中对质子转移所起的关键作用1 3 叫。最近十几年，许多学者致力于 详尽的研究辅酶q l o 在线粒体呼吸链上的角色和相关的氧化磷酸化作用以及临床 应用。 辅酶q l o 富含于心脏、肝脏、肾脏和胰腺中。人体内总含量为0 5 1 5 9 。在 细胞内的分布为：细胞核内占2 5 一3 0 ，线粒体内占加一5 0 ，微粒体内占 1 5 一2 0 ，细胞质内占5 一l o f q 。 作为人体中唯一的辅酶q 类物质，其异常的代谢与人体的许多疾病相关联， 人为的补充辅酶q 1 0 能减缓许多病症。 1 2 辅酶q l 研究现状 近年来研究证实，辅酶q 1 0 是人体细胞中重要的生化辅酶之一，有抗脂质过氧 化作用，能预防心肌再灌注损伤，能增加心肌能量储备，改善缺血时线粒体功能， 稳定和修复细胞结构，促进心肌功能恢复，具有清除自由基、维持细胞膜的通透 性、提高免疫功能等多种药理作用。它还能降低血压，在治疗坏血病、十二指肠 溃疡、坏死性牙周炎、病毒性肝炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果i s j 。 最近发现它对肿瘤和艾滋病有显著辅助疗效。 人体可从食物中吸收，或由体内制造获得，但细胞通过食物获得的辅酶q l o 远远无法满足人体正常生理功能的需要。由于辅酶q l o 具有治疗、保健、预防等作 用，作为药物和保健品在发达国家已广泛使用，但辅酶q 。o 分子量大、水溶性差， 传统的片剂、胶囊在小肠中的生物利用度较低，因此如何安全有效的提高辅酶0 l o 的体内生物利用度已成为国外近年来研究的主要方向。 当前国外的文献报道主要集中在辅酶q l o 对心血管疾病、帕金森氏综合症、糖 尿病等疾病的预防和治疗，以及利用色谱等手段检测机体内辅酶q 1 0 的含量和氧化 还原状态等研究。国内辅酶0 l o 临床与实验研究很大程度上限制于若干器官和疾病 时线粒体的形态、功能和代谢的变化及脂质体的研究上。 辅酶q 1 0 的氧化磷酸化作用以及临床应用的研究取得了不同程度的研究结果， 但仍然存在很多问题。氧化磷酸化方面，辅酶o i o 在膜上的位置对呼吸链的氧化还 原传递起重要作用，但众多学者运用各种物理手段所得到的结果竟然是互相矛盾 的，所用物理手段有：荧光光谱、核磁共振、圆二色、电子自旋共振、红外光谱、 x 衍射、d s c 等。最近t h o m a sh a u b 等用中子散射技术获得了很好的证据，证明 辅酶q 1 0 是平行于双层膜位于双层膜中央的，认为这样的方位对氧化磷酸化至关重 要，很可能会起到抑制跨膜质子漏的作用【9 j o 临床应用方面，辅酶q 1 0 在体内的生 物利用度以及最新应用于研究的辅酶q l o 脂质体等均处于摸索阶段，仍然未寻到一 个很好的途径。鉴于此，进一步确定辅酶q l o 在生物膜中的定位、研究辅酶q 1 0 的 溶液构象等，为辅酶q l o 在生物膜中的作用及在体内的生物利用度等问题提供重要 的线索和理论依据就迫在眉睫，相信此课题具有重大科学意义和学术价值，同时 具有潜在的社会效益。 1 3 辅酶q l o 性质 辅酶q 1 0 ( 英文名：c o e n z y m eq 1 0 ，u b i q u i n o n el o t 商品名：u b i d e c a r e n o n e ， n e u q u i n o n ，下文简写为c o q l 0 ) ，又叫癸烯醌、泛醌，为脂溶性醌类化合物，化学 名称：2 , 3 2 - - 氧基2 5 2 甲基2 6 2 癸异戊烯基苯醌i 埘。 辅酶q l o 是一种醌类化合物。系黄色或淡黄色结晶。无臭、无味。易溶于氯仿、 苯、四氯化炭，溶于丙酮、石油醚及乙醚：微溶于乙醇；不溶于水和甲醇。遇光 易分解成微红色物质，对温度和湿度较稳定，熔点为4 9 0 c 儿j 。 o ) i ，h 图1 1c o q l o 结构式 图1 2 c o q l o 结构转化 f i g 1 1s t r u c t u r ef o r m u l ao fc o q i of i g 1 2 s t r u c t u r et r a n s f o r mo fc o q t o 辅酶o 。o 具有醌的性质，其侧链含有1 0 个异戊二烯单元，其结构式如图1 1 ， 其功能作用主要来自于醌基的氧化还原化学特性与侧链的物理特性。醌分子中虽 2 然存在着碳碳双链间的共轭体系，但x 射线分析证明醌环不是芳香烃，不属于芳 香族化合物。它具有典型的烯烃和羰基化合物的反应性能，可以进行多种形式的 加成反应与氧化还原反应。辅酶q 1 0 在氧化条件下以醌的形式存在，在无氧条件下， 可还原为对苯二酚，具有可逆的氧化还原特性。其结构的转化如图1 2 。 1 4 辅酶q l o 的作用 辅酶q 1 0 参与细胞氧化磷酸化及a t p 生产过程。是一种氧化还原酶，是线粒 体酶的辅酶：如n a d h ：c o q l o 还原酶：琥珀酸：c o o l o 还原酶；电子传递黄素蛋 白：c o q l o 还原酶；还原的c o q l o ：细胞色素c 还原酶等1 1 2 1 。 i a 1 生化作用 辅酶q 1 0 广泛存在于各种组织细胞尤其是心肌细胞中的线粒体中，是组织细胞 内具有重要作用的活性酶，在细胞线粒体呼吸链即电子传递系统中起递氢体作用， 是细胞呼吸链的重要组成部分，参与a t p 的合成，它也是一种公认的氧自由基清 除剂，如果线粒体中辅酶q 含量不足，则多种酶活力均明显下降1 1 3 j 。 在人体内辅酶q 。o 主要集中于线粒体，是线粒体中不同作用物氧化呼吸链的汇 合点。人体研究表明，辅酶q l o 处于n a d h 、琥珀酸脱氢酶和细胞色素b 之间， 是重要的氧化还原组分。辅酶q l o 可以从复合物i 及接受氢后，将质子释入线粒 体基质内，电子则传递给细胞色素【。因此辅酶q l o 能促进氧化磷酸化反应及离子 的主动转移，是细胞代谢及细胞呼吸的激活剂。 c 锄- r 叩妫o m c r 州w m 叫 图1 3c o o l o 循环 f i g 1 3t h ec y co fc o q l o 3 辅酶q 。o 能在膜中自由扩散，在内膜c 侧，还原型辅酶q l o ( 氢醌) 将一个 电子交给f c s 一细胞色素c 1 一细胞色素c ，被氧化为半醌，并将一个质子释放到 膜间隙，半醌将电子交给细胞色素b 5 6 6 - * b 5 6 2 ，释放另外一个质子到膜问隙。细 胞色素b 5 6 6 得到的电子为循环电子，传递路线为：半醌一b 5 6 6 一b 5 6 2 一辅酶q 1 0 。 在内膜m 侧，辅酶q l o 可被复合体i ( 复合体i i ) 或细胞色素b 5 6 2 还原为氢醌。一 对电子由辅酶q 1 0 到复合物i i i 的电子传递过程中，共有四个质子被转移到膜间隙， 其中两个质子是辅酶q l o 转移的1 1 5 】。因此辅酶q 1 0 能促进氧化磷酸化反应及离子的主 动转移，是细胞代谢及细胞呼吸的激活剂。 i a 2 药理作用 辅酶q 。o 具有促进氧化磷酸化反应和保护生物膜结构完整性的功能。辅酶q l o 在体内呼吸链中质子移位及电子传递中起重要作用，它是细胞呼吸和细胞代谢的 激活剂，也是重要的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂。 1 4 2 1 自由基清除作用 n a y l e r 在动物实验中发现辅酶q l o 与s o d 有类似作用，能够明显改善心室功 能，清除过量的自由基。l a n g e n d o r f f 方法研究证实了辅酶q1 0 可明显降低线粒体 氧耗，减少细胞三磷酸腺苷消耗。超微结构检查证实，辅酶q 。o 能维持细胞线粒体 结构的完整性，防止细胞水肿，细胞膜破裂，以及线粒体溶解与肌纤维的紊乱性 排列【1 6 1 。 近几年来许多实验均证实辅酶q 1 0 可明显降低心肌血再灌注后丙二醛( m d a ) 的生成，减轻线粒体肿胀，保持细胞膜结构的完整性，缩小心肌缺血范围。这些 均表明辅酶q 。o 具有抗氧自由基，维持细胞结果的完整性从而达到保护心肌的作用 1 1 7 1 。 孙晓芳等【1 8 l 研究了辅酶q 。o 抗衰老小鼠的脂质过氧化作用。证明辅酶q 1 0 可使 肾、肝、睾丸组织超氧化物歧化酶的活性升高，过氧化脂质的分解产物含量下降。 因此证实，辅酶q l o 可增强这些器官对自由基的清除能力，抑制脂质过氧化，起到 保护这些器官的作用，从而可以对抗d 一半乳糖所致衰老退行性病变。 1 4 2 2 稳定细胞膜维持钙离子通道完整 由于心肌缺血、缺氧，细胞膜就会收到损伤，这会导致膜内p h 下降，并失去 了结合c a 2 + 以丛状形式沉积于线粒体，即造成了所谓的c a 2 + 负荷过重。同时，辅 酶q 。o 能增加a t p 合成，具有直接保护细胞膜，稳定细胞内外环境的作用。有的 学者认为，辅酶q 。o 对缺血时心肌细胞线粒体畸变的防止作用，也是辅酶q l o 维持 钙离子通道完整的佐证1 1 9 j 。 1 4 2 3 免疫增强作用 4 b l i z n a k o v 等曾以细菌或白血病病毒感染小鼠，发现辅酶q l o 可增强小鼠的免 疫反应及白细胞的吞噬能力，提高宿主对感染的防御机能，并可延长其存活时间 【加1 。 1 4 2 4 药动力学研究 口服辅酶q 1 0 l o o m g 后，血浆药物浓度在5 1 0 h ( 平均6 5 h ) 达峰值，血浆平 均浓度为( 1 0 0 4 + - 0 3 ) m g l ，一日3 次，每次服用1 0 0 r a g 后的平均稳态血药浓度 为5 4 m g l ，血浆半衰期为( 3 3 9 + - 5 3 2 ) h ，显示该药代谢及消除均缓慢。辅酶 q 1 0 从胃肠道吸收后被乳糜微粒摄取，大部分积存于肝内并转化为极低密度脂蛋白 ( v u ) l ) ，此后在体内某些器官如肾上腺、肝、肺、肾和心肌组织中分布。多数 患者用药后2 4 h 血浆浓度出现两次峰值，推测为肝脏摄取的辅酶q 1 0 向外周血循环 释放再分布所致。辅酶q l o 从胆道排泄，由粪便排出体外旧。 1 5 本论文选题依据及主要研究内容 1 5 1 本论文选题依据 辅酶q 1 0 的功能与其结构有关，但是对辅酶q 1 0 的结构与功能的关系、溶液构象 等方面的研究报道尚不多见。因此，在分子水平上探寻辅酶q 。o 必定会对揭示线粒 体疾病病理起重要作用。如果从辅酶q l o 与模拟生物膜的相互作用以及在溶液中构 象入手，有可能为辅酶q l o 在生物膜中的位置、生物利用度等热点问题提供线索。 1 , 5 , 2 本论文主要研究内容 本研究运用醇碱皂化法从猪心肌线粒体中提取辅酶q 。o ，运用多种物理手段 ( 紫外光谱、红外光谱、核磁共振) 进行鉴定，然后将其装配到模拟生物膜中， 用l b 膜技术研究其与生物膜( 磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺，胆固醇) 的相互作用， 同时用原子力显微镜技术( 蛆m ) 探测其在溶液中的构象以及与许多生物分子 ( g m 、s u l f a t i d a s e 、c h o l e s t e r o l 、p e ) 的相互作用和脂质体形貌、粒度等。 5 第二章辅酶q l o 的提纯与鉴定 2 1 引言 辅酶q l o 的制备方法有：动植物细胞提取法、植物细胞培养法、化学合成法和 微生物发酵法1 2 1 i 。 2 1 1 提取法 2 1 1 1 皂化法 分为醇碱皂化法、碱皂化法。将氢氧化钠一乙醇溶液或氢氧化钠溶液加入含 有辅酶q 1 0 的组织或细胞溶液中，再经过一系列后处理如硅胶吸附、石油醚洗脱等 工序，最终获得辅酶q 1 0 产品。 表1 辅酶o l o 在各种动植物组织中的含量 t a b 1t h ec o n t e n to f c 0 0 1 0i nv a r i o u st i s s u e 动物植物 名称 牛肝 牛心 猪肝 猪心 羊心 羊肉 含量( n m o g ) 4 0 8 5 3 5 9 8 2 0 0 2 8 0 名称 烟叶 大豆 菠菜 罗望子叶 棉籽 麸皮 含量( n m o g ) 2 1 4 0 3 5 4 9 4 5 6 4 6 3 ( 1 ) 醇碱皂化法l 冽将含有辅酶0 1 0 的组织称重后加入7 ( w w ) 的焦性没食子 酸，搅匀。缓慢加入1 3 1 5 倍量1 0 的氢氧化钠一乙醇溶液搅拌，置水浴加热回 流3 0 m i n 。迅速冷却至室温，加入1 1 0 体积的石油醚，用无水硫酸钠将石油醚提 取液脱水浓缩，经硅胶吸附柱层析、石油醚洗脱、除杂。再以5 ( v v ) 乙醚一 石油醚洗脱，分段收集，减压蒸馏除尽溶剂，得黄色油状物。以无水乙醇结晶， 即得橙黄色结晶。此法是经典的提取脂溶性物质的方法，方法较简单。 ( 2 ) 碱皂化法l 冽在酸性水溶液中将含有辅酶q l o 的原料细胞破碎，9 0 0 c 加热 3 h 后，加入氢氧化钠，9 0 0 c 下皂化1 h 。皂化液用乙烷加异丙醇的混和溶剂萃取， 浓缩萃取液，冷析除沉淀胆固醇，上硅胶层析柱，收集含有辅酶q 。o 的溶液，浓缩， 用无水乙醇结晶，获得辅酶q 1 0 。 2 1 12 溶剂萃取法 将原料与1 5 倍量的丙酮、乙醇、乙醚或乙醇：乙醚( 3 ：1 ) 的混和溶剂回流 6 1 5 - - 2 0 r a i n ，冷却至室温，过滤。滤渣再反复提取两次，提取液用石油醚( 汽油) 萃取，浓缩萃取液得油状物。用丙酮在低温下析除杂质后，硅胶层析纯化，无水 乙醇结晶，得辅酶q l o 结晶粉末田l 。此法操作相对比较简单，但是纯化工作较困难， 且总体消耗较大，工业化生产难于推广。 2 1 1 3 吸附层析法 7 3 0 c 时用低浓度乙醇溶液萃取含有辅酶q l o 的原料3 h 。提取液通过大孔树脂 吸附，低浓度乙醇洗涤，正已烷洗脱、浓缩、去除乙醇，得含有辅酶q 1 0 的油状物 【矧。用a m b e r l i t ex a d 柱层析，再经过h i p o r c sh p - 2 0 层析柱，用9 ：1 丙酮水溶液 洗脱、浓缩，乙醇结晶，可得纯度为9 9 4 的辅酶o l o 。 2 1 2 植物细胞培养法 利用烟草细胞培养技术制备辅酶q 1 0 是植物细胞培养技术发展的产物之一， i k e d a 等从烟草培养细胞中获得辅酶q l o 结晶。但该法生产成本高，不利于工业化 生产，所以近年来此法的相关报道不多见i 刎。 2 1 3 化学合成法 目前该化合物的合成方法主要分为两类：其一是母核化合物上引入癸异戊二 烯醇基，另一种方法是首先于母核化合物上引入较短的侧链，然后再引入所期望 的长链【2 3 l 。 2 1 3 1 侧链直接引入法 1 9 5 9 年r u c g gr 等报道合成辅酶q 1 0 的路线，虽然得到了产物，但产率很低， 只有2 0 ，同时由于茄尼醇制得的烯丙基化试剂是顺、反异构体的混和物，需分 离，因此这种方法的应用受到了限制1 2 3 1 。 1 9 7 9 年n a r u t ay 等报道了将异戊二烯部分制成锡烷，利用锡烷的强亲核性与 醌反应，并以b f 3 0 e t 作催化剂，在低温条件下( 一7 8 一6 0 0 c ) 反应，最后得到 了几何构型较满意的产品，但产率也只有5 1 【矧。 从以上合成路线可以看出，此类方法都是用母核化合物与聚异戊二烯基化合 物反应，但这一关键步骤产率都不太高。 2 1 3 2 侧链延长法 1 9 7 8 年，t e r a o s 利用辅酶哂合成辅酶q 1 0 ，因原料辅酶q 7 价格十分昂贵，所 以此路线实用价值不大i “1 。m o h r im 小组对此作了大量的研究，于1 9 8 6 年报道了 他们的成果，去( 对甲基) 苯磺酸基反应中以l i h b e t 3 作还原剂，以p d c l 2 作催 化剂，差率为8 6 ，a 9 2 0 作氧化剂，产率为9 4 z 4 l 。以上两种方法类似，都先 在母核上增加一个异戊二烯，再增加一个由茄尼醇制得的化合物。 7 2 1 4 微生物发酵法 辅酶q l o 在各种微生物体内分布是不均匀的，在不需氧呼吸的细胞中无辅酶 q 1 0 ，如革兰氏阳性菌，而对革兰氏阴性菌则具有较高浓度的辅酶q l o 。由于辅酶 q 1 0 是由芳香环及异戊烯基侧链组成的，则在微生物体内必须首先合成芳香环，其 合成途径有两条，一是由莽草酸经对羟苯甲酸合成芳香环；二是由乙酸一丙酸途 径合成芳香环【四。 2 2 辅酶q l o 的制备 2 2 1 实验材料、仪器 2 2 1 1 实验材料 猪心为市场购买；硅胶( 粒度范围6 0 一1 0 0 筛孔) ；分液漏斗；绸布；焦性没食 子酸( 抗氧化剂) 、氢氧化钠、无水乙醇、石油醚、无水硫酸钠、乙醚、硫酸、氨 水等。以上试剂均为分析纯。 2 1 1 2 实验仪器 硅胶柱上海沪西分析仪器厂有限公司 旋转蒸发器上海亚容生化仪器厂r e 5 2 a a 高速组织倒碎机上海标本模型厂d s 1 电动玻璃匀浆宁波新芝生物科技股份有限公司d y 8 9 1 电动混匀器宁波新芝生物科技股份有限公司d y 8 9 i 低速大容量离心机上海安亭科学仪器厂l x j i i b 微量电子天平上海精密科学仪器公司天平厂j a 2 0 0 3 恒温磁力搅拌器杭州科学仪器有限公司7 8 h w - 1 数字显示酸度计上海康仪仪器有限公司p h s 4 c t 超净工作台苏州安泰空气技术有限公司s w - c j 1 f 高速冷冻离心机德国s i g m a 仪器有限公司s i g m a d 一3 7 5 2 0 紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司 2 2 2 实验方法 将含有辅酶q l o 的猪心残渣称重后以比例为残渣：9 5 乙醇：氢氧化钠：焦 性没食子酸= 1 ：1 3 ：0 1 3 ：0 1 2 缓慢加入，拌匀。加入1 3 i 5 倍量1 0 的氢氧化钠一 乙醇溶液搅拌，置水浴加热回流3 0 m i n 。迅速冷却至室温，用石油醚萃取3 次，取 上层，4 0 0 c 下减压浓缩至1 2 0 体积，经硅胶吸附柱层析、石油醚洗脱、除杂。再 以5 ( v v ) 乙醚一石油醚洗脱，分段收集，减压蒸馏除尽溶剂，得黄色油状物。 经纸层析后以无水乙醇结晶，即得橙黄色晶体。纸层析前后的辅酶q 。o 用紫 8 外可见分光光度计进行检测，结晶后用红外光谱、核磁共振进一步确认鉴定。 辅酶q 1 0 由动物组织法中的醇碱皂化法制备，实验流程如下： 取新鲜猪心，去脂肪、结缔组织洗净、绞碎用水漂洗 上 硫酸调p h 至4 o ，室温下搅拌2 h ，氨水调p h 至6 0 ，绸布压滤，滤渣用水漂洗至 中性，离心，去上清 工 加入焦性没食子酸、氢氧化钠乙醇溶液 l 水浴加热回流3 0 m i n ，加入适量的石油醚，合并萃取液，减压浓缩 j 硅胶柱层析，石油醚洗脱，减压浓缩，纸层析 工 紫外光显色，将相应层析斑剪下，浸入热的无水乙醇，超声振荡 l 待溶质完全溶解后，冷却至矿c ，结晶1 2 h ，滤得晶体( 黄色) j 重结晶，得辅酶q 1 0 精品a 同时对不同皂化时问( 1 0 r n i n 、2 0 m i n 、3 0 r a i n 、4 0 m i n 、5 0 r a i n 、6 0 r a i n ) 和不 同皂化温度( 3 0 。c 、5 0o c 、7 0o c 、9 0 。c 、1 0 0o c ) 下所得的辅酶q l o 产量进行比 较，寻找最佳皂化时间和皂化温度。 2 2 , 3 实验结果 2 2 3 1 纸层析法对辅酶q 进行提纯 ( 1 ) 纸层析原理 纸层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂( 与水不相混溶 或部分混溶) 作流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相 之间不断的进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而 达到分离的目的i 捌。 溶质在滤纸上移动的速率可用r f 值表示： r f = 溶质斑点中心的移动距离溶剂前沿移动的距离 r f 值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一 实验条件下，两体积比是一常数，所以r f 值决定于分配系数。不同物质的分配系 数不同，r f 值也不相同，由此可以根据r f 值的大小对物质进行定性分析。 9 ( 2 ) 操作方法 样品处理、点