（生物化学与分子生物学专业论文）酿酒酵母hsp33蛋白的晶体结构解析.pdf

中国科学技术大学学位论文相关声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究 工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的 同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权， e p ：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和电子版，允许论文被查阅或借阅，可以将学位论文编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：拉筮 川年 月2 日 中国科学技术大学颂l ：学位论文 摘要 酿酒酵母的h s p 3 3 y o r 3 9 1 c p 蛋白是氧化应激反应中的重要蛋白之一。通过 同源性分析，推测其可能具有水解酶蛋白酶活性，或行使分子伴侣功能。 在本论文中，我们收集到了分辨率达2 7a 的h s p 3 3 晶体衍射数掘，并将 数据进行了处理。用分子置换法获得了结构的初相位解析。完成了结构的精修， 获得了r 和r - f r e e 分别为0 2 1 和o 2 8 的结构。分析了结构，并试图对结构的 小分子做了鉴定。将h s p 3 3 的结构与其同源蛋白做了比较。 关键词：热休克蛋白，晶体结构 2 中国科学技术大学硕i 学位论文 a b s t r a c t h s p 3 2o fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei so n eo ft h ee s s e n t i a lp r o t e i n s i n v o l v e di nt h er e s p o n s et oo x i d a t i v es t t e s s t h er e s u l ti n f e f r e df r o m s e q u e n c es i m i l a r i t ys u g g e s t st h a th s p 3 2i sap o s s i b l eh y d r o l a s e p r o t e a s e m o r e o v e eh s p 3 2m a yf u n c t i o na s ac h a p e r o n e d i f f r a c t i o nd a t a w i t ht h eh i g h e s tr e s o l u t i o no f2 7a w a sc o l l e c t e da n d p r o c e s s e d w eg o tt h ei n i t i a lm o d e lu s i n gm o l e c u l a rr e p l a c e m e n tm e t h o d t h e ns t r u c t u r ew a sr e f i n e d t h ef i n a irf a c t o ra n dr f r e ew e r e0 2 1a n d0 2 8 r e s p e c t i v e l y w ea t t e m p t e dt oi d e n t i r yt h el i g a n db i n d i n gt oc y s l3 8 t h e s t r u c t u r eo fh s p 3 3w a sc o m p a r e dw i t hi t sh o m o l o g s k e y w o r d ：h s p s c r y s t a ls t r u c t u r e 中困科学技术大学坝i j 学位论文 第一章文献综述 第一节热体克蛋白 热休克蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i n s ，h s p s ) ，又称热应激蛋白( h e a ts t r e s s p r o t e i n s ，h s p s ) ，是指在休克( s t r e s s ) 状念下动物机体细胞新合成或合成数量 增加的一类蛋白质。h s p s 的基本功能为帮助蛋白质的正确折叠、移位、维持和 降解，作为分子伴侣( m o l e c u l a rc h a p e r o n e ) ，h s p s 的表达增加能增强机体和细 胞对多种休克原的耐受能力。它是一组分子量不等的酸性蛋自( p h 5 o - 6 5 ) ， 并普遍存在于从原核细胞生物到高等真核细胞生物的整个生物晃，而且在同一 生物体的不同组织内均有表达。 h s p s 具有高度保守性及应激性，热休克蛋白家族是迄今为止发现的最为保 守的蛋白家族之一。以h s p 7 0 为例，不同来源的真核生物同源性可达6 0 0 o - - 7 8 。 h s p s 在进行过程中的高度保守性，说明他们具有普遍存在的重要生理功能。 h s p s 的另一特征是应激状态合成增加。而且h s p s 增加速度很快，而其它的蛋 白质合成则减少。 第二节热休克蛋白的分类 h s p 种类繁多，目前已经发现的有l o 多种，广泛存在于自然界的原核及真 核生物中。以分子量为分类基础，h s p 主要分为4 个家族：h s p 9 0 家族( 分子 量约为8 3 1 1 0 k d a 、h s p 7 0 家族( 分子量约为6 6 7 8 k d a ) 、h s p 6 0 家族以及 小分子量s m h s p 家族( 分子量约为1 2 4 3 k d a ) 。 h s p 9 0 为组成型表达的蛋白，包括旺和d 两种分子，是h s p 家族中为数不多 的合有内含子的成员之一。h s p 9 0 作为特异分子伴侣与类固醇激素受体( 包括 g r ，p r ，e r ，r a r ，v d r 等) 及信号传导途径中的酪氨酸蛋白激酶及丝氨酸苏 氨酸蛋白激酶等分子结合，调节它们的生物活性，防止蛋白质的变住和聚集。 4 中固科学技术人学颂i 学位论文 h s p 7 0 家族是一类最保守和最重要的h s p 家族，包括分子量6 8 ，7 2 ，7 3 ，7 5 ， 7 8 k d a 等的二十多种蛋白。此外在哺乳动物细胞中还发现了一类广泛存在的 h s p 7 0 家族的一个亚族h s p l l 0 。h s p 7 0 家族蛋白具有相同的等电点和相似 的胰蛋白酶肽谱，在几乎所有生物的应激细胞中都经常高度地被诱导，广泛参与 各种保护机体和细胞的功能。 h s p 6 0 家族成员包括分子量6 0k d a 上下的多个蛋白质。微生物的h s p 6 0 是优势蛋白，感染微生物的人体中有4 0o a t 细胞应答是针对这一蛋白质的，而且 该蛋白质与人类h s p 6 0 相当，已经检出至少与人类1 9 个已知自身抗原的氨基酸 序列有相似性。并与相应自身免疫的发生有关。 s m h s p 是热胁迫诱导蛋白，能防止热诱导的蛋白质聚集、促进变性蛋白质的 复性和不可逆转的受伤蛋白质的降解。h s p 2 7 是s m h s p 亚家族中的重要一员， 主要参与微丝的稳定和细胞因子信号转导等，保护细胞免受各种应激因素的损 伤。 第三节热休克蛋白的生物学功能 热休克蛋白在细胞生长，发育、分化、基因转录、蛋白质合成、折叠、分 解、细胞骨架功能等方面发挥重要生理作用。目前有关h s p s 的研究主要从h s p s 的保护细胞作用、h s p s 与自身免疫的关系、h s p s 与肿瘤、h s p s 作为新型疫苗 的载体分子等方面进行的。其中与肿瘤疫苗的研制是h s p s 未来的主要方向。热 休克蛋白的研究已经成当今世界生命科学的热点和富有希望的领域。h s p 主要 发挥着如下四个基本功能。 一、分子伴侣 分子伴侣( m o l e c u l a r c h a p e r o n e s ) 是一类与其它蛋白的不稳定构象相结合并 使之稳定的蛋白，它们通过控制结合和释放来帮助被结合多肽在体内的折叠、 组装、转运或降解等。它们作为一种蛋白质分子构象的协助者在一系列生命活 动中担任重要角色，它们本身不包括控制j 下确折叠所需要的构象信息，而只是 5 中田科学技术大学硕i 学位论文 阻止非天然态多肽链内部或相互问的非正确折叠，或者说它们给处于折叠中间 肽的多肽链提供了最多的正确折叠机会。蛋白质合成和跨膜转运是从低等细菌 到高等人类一切生物的基本细胞过程，现已证明帮助新合成和去折叠蛋白正确 折叠合成功组装、维系转运蛋白前体构象能力的分子伴侣，多数都是h s p 。 h s p 的分子伴侣作用主要取决于其a t p 结构域或与肽链结合过程中起重要 作用的c 末端的e e v d 序列( h s p c 末端与调节蛋白相连接的高度保守序列) 。 h s p 与多肽的结合与解离和h s p 与a d p 或a t p 的结合有关。当h s p 与a d p 结合，它可以与肽或变性蛋白紧密结合；当h s p 与a t p 结合时，肽链就释放。 所以随着机体a t p 的水解，相对稳定的a d p h s p 复合物也随即形成。 二、胚胎发育 在胚胎发育期，特别是早期胚胎发育时期，细胞基因转录活跃、蛋白质大 量合成，这个时期的h s p 变化和作用表现得非常突出，其表达具有时间顺序性 和组织特异性。例如。h s p 9 0 植入前的小鼠胚胎中有表达，至囊胚发育中期表 达广泛主要位于中枢神经系统及骨骼形成区。h s c 7 0 位于星体、纺锤体及中 心体等有丝分裂装置，在细胞有丝分裂过程中起一定的作用。h s p 2 2 和h s p 2 3 与胚胎形态分化有关。h s p 在胚胎发育中作用的研究表明h s p 通过参与细胞分 裂、神经分化等，而在胚胎发育中具有看家基因的功能，此外热休克蛋白作为 分子伴侣，通过介导新合成的或可逆变性的蛋白质正确折叠、装配、转动及促 进不需要的或不可逆变性的蛋白质降解，参与胚胎的正常发育和保护胚胎不受 不良刺激的影响。 三、细胞凋亡 细胞内h s p 尤其是h s p 7 0 和h s p 2 7 可抑制应激激活蛋白激酶，抵制细胞 凋亡信号转导中的蛋白水解酶和氧自由基生成，并抑审t j p 5 3 介导的细胞凋亡， 从而可在热休克、氧化应激、电离射线等引起的细胞凋亡中起保护作用 1 7 ，1 81 。另外在线粒体参与的胞浆程序化死亡的途径中，表达在线粒体上的 h s p 7 0 一方面可能通过对变性的细胞凋亡抑制蛋白如b c l 2 2 加以修复或防止其 被降解，恢复其凋亡抑制功能；另一方面通过直接抑制自杀激活因子如细胞色 6 中国科学技术人学硕i ：学位论义 素c 的释放，从而保护线粒体进而抑制细胞凋亡的发生。 四、免疫应答 在免疫中h s p 表现多种作用模式。首先表现非保守的h s p 是富含b 和t 细胞位点的有效免疫原，可作为经典外源抗原，引起宿主细胞免疫及在体液免 疫中激发强烈的t 细胞依赖性抗体效应，产生应答抗体i g g 。其次是机体针对自 身h s p 可发生自体免疫。一般情况下，h s p 位于细胞内，当细胞表面有异常表 达时，该相应细胞会成为免疫应答对象。引发自身免疫病，如类风湿性关节炎， 系统性红斑狼疮。强直性脊椎炎等患者体内都能检测到自身h s p 抗体。此外h s p 在免疫系统识别抗原中扮演重要角色，参与外源抗原肽段的加工、处理和呈递， 协助产生针对外源抗原的免疫反应。 第四节热休克蛋白表达调控 鉴于h s p 在细胞分裂、分化、凋亡等生命基本过程中的关键作用，大量研 究集中于h s p 及其基因表达的反应调节。 目前对原核生物应激反应调节机制的研究成果表明，在ec o l i 体内存在热 休克。因子，在枯草杆菌( b a c i h u s su b t i l i s ) 中热休克基因的表达则受到一个重复 d n a 序列的可逆的顺式负调节( n e g a t i v ec i s 2 a c t i n g c o n t r 0 1 ) 。而人们对真核生物 应激反应调节机制的研究要更为深入，透彻。通过资料分析，可以看出真核生 物h s p ( 以h s p 7 0 为例) 表达调控基本是围绕三个关键步骤进行：其一，内外界 因素的变化改变h s f 的活性；其二，活化的热休克因子( h e a ts h o c kf a c t o r ，h s f ) 识别并结合热休克基因的热休克元件( h e a ts h o c ke l e m e n t ，h s e ) ：其三，热休克基 因的转录活化区域开放，促进转录。 一、热休克蛋白生成诱因 引起真核生物热休克应答的各种因素，无论来自体内还是体外，其作用机 制及效应都是通过改变h s f 活性，进一步诱导h s p 的合成。外界多种物理化学 因素如热休克、p h 变化、紫外线照射、表面活性剂、蛋白合成抑制剂( 如环己 7 中国科学技术大学硕l 学位论文 烷) 等及其它多种物理因素及化学试剂作用于细胞后，均可造成细胞内的非币 常蛋白( 如：未诋常折叠蛋白、该降解而未降解的蛋白、蛋白碎片、蛋白多聚体、 变性蛋白等) 浓度过高，降低游离h s p 浓度，从而激活h s f 。而内环境发生的 生理或病理改变，如细胞周期、细胞分化、生长因子、激素刺激、病原侵染、 发烧、炎症、自身免疫等也都可通过直接或间接的途径激活h s f 。此外在影响 h s f 活性的内环境多种因素中，h s p 是重要的双重调节因素，游离h s p 浓度的降 低可激活h s f ，高浓度的h s p 能抑制h s f 的活性，降低h s f 与d n a 的结合，但目 前还不清楚h s p 是以直接还是间接的方式抑制h s f 。 二、热休克因子( h s f ) h s f 本质上是具有转录调节活性的蛋白质，可在热休克基因的表达过程中 与相应启动子结合，启动基因的转录过程，最终促进h s p 的表达。目前在人、番茄、 酵母等多种生物体内已发现了多种h s f 。不同h s f 可在不同的条件下调控h s p 转录：比如，人体内的h h s f l 是热激的作用物；h h s f 2 在生长、分化和发育时期激 活h s p 的基因表达；而h h s f 4 似乎是通过减少h s e 结合位点，抑铝i j h s p 的基因 表达。从而控制应激反应的动态平衡。 研究发现，各种h s f 虽种类、分子量大小和功能各不相同，但其结构却极 为相似，都具有两个进化上高度保守的结构域，即一个d n a 结合区( d n ab i n d i n g d o m a i n ) 和一个三聚化区( t r i m e r i z a t i o nd o m a i n ) 。d n a 结合区为转录激活的功能 区，位于h s f 的n 末端，长约1 0 0 个氨基酸残基，由3 个螺旋( h i 、h 2 和h 3 ) 和 4 个反向平行的p 2 片层0 3 2 s h e e t ) ( p l 、p 2 、p 3 和b 4 ) 组成。具有d n a 结合蛋白 特征性的螺旋转角螺旋片层模体( h e l i x t u r n h e l i xm o t i f ) 。3 个a 2 螺旋构成一 个紧密的疏水核心，4 个p 2 折叠反向平行排列，将疏水核心区封闭。三聚化区 为h s f 活化时相互结合形成三聚体的区域，位于h s f 的c 末端，由3 个以脂肪 族疏水氨基酸组成的七肤为重复单位组成的短序列( h y d r o p h o b i ch e p t a dr e p e a t a r r a y ) 构成，每个七肽重复单位的第一和第四个疏水氨基酸残基是螺旋型卷曲 嫘旋结构( h e l i c a lc o i l e d c o i ls t r u c t u r e ) 所特有的，可用于形成亮氨酸拉链 ( l e u c i n ez i p p e r ) 。 8 中国科学技术犬学硕上学位论文 根据h s p 7 0 具有与变性蛋白和h s f 均能结合的能力，a b r a v a y a 提出了一 个h s f 活化的反馈调控模型；在非应激细胞中，h s f 以无活性的单体形式与 h s p 7 0 结合，应激条件下，增加的变性蛋白竞争性地结合h s p 7 0 ，。导致h s f 从 h s f h s p 7 0 复合体中解离，随后解离的h s f 被蛋白激酶c 或其他丝氨酸苏 氨酸激酶磷酸化形成同源三聚体，暴露出d n a 结合区和n l s ( 核定位序列) ，在 n l s 介导下，经主动转运过程，h s f 三聚体进入胞核，通过d n a 结合区结合 h s p 基因启动子内的特定区域开启h s p 的转录；当h s p 7 0 转录过量时又与 h s f 结合，h s f 恢复单体结构，封闭d n a 结合区和n l s ，这样使h s p 的合成 处于动态平衡。 三、热体克元件( h s e ) h s p 基因启动子内与h s f 特异性结合的区域就是热休克元件( h s e ) ，h s f 同h s e 的结合是热休克转录必需的。h s e 也是高度保守的d n a 序列，其基本 结构特征就是有一个保守的五核营酸序列“n g a a n ”，其中n 代表保守程度较 低的核苷酸，h s f 单体与“n g a a n ”结构以l 比l 的比例结合。h s e 上 “n g a a n ”结构的数目对h s f 与h s e 亲和性有很大的影响。一个完整的h s e 结构上通常有3 个“n g a a n - ”结构，而完整的h s f 也是以三聚体的形式与h s e 结合，这样的结合具有最大的亲和力。若h s e 上只有2 个“- n g a a n - ”结构，两 者的亲和力只能达到中等水平。天然热休克蛋白基因调控区内常含有多个短 h s e 或一个长h s e 。例如，果蝇h s p 7 0 基因上游调控区含有4 个h s e ，每个h s e 由3 5 个核心序列组成：而果蝇h s p 8 3 基因上游调控区内仅有一个h s e ，但 其为由8 个核心序列构成的长h s e 。这些短的h s e 之阍及长h s e 内核心序列b j 在与h s f 三聚体结合时有转录活化协同效应，相邻2 个h s f 结合位点( 需3 个核 - t l , 序列) 上，第一个h s f 三聚体的结合将使下一个三聚体的结合能力增j j l l 20 0 0 倍以上：如对果蝇h s p 7 0 基因上游调控区傲缺失突变，仅保留最近端的一个h s e 时，其热休克诱导的表达活性比保留两个h s e 时的活性低1 0 0 倍；而对果蝇 h s p 8 3 基因上游调控区做缺失突变，保留可供两个h s f 三聚体结合的核心序列 区( 6 个核心序列) 时比仅保留可供一个h s f 三聚体结合的核心序列区( 3 个核心 9 中国科学技术人学颂l 学位论文 序列】时诱导性表达显著商出许多。此外，h s e 还具有增强子的一些特性。当把 这些h s e 接在其它基因5 上游时，该基因同样可以获得热休克蛋白的诱导性。 第五节热休克蛋白研究意义 一、h s p 与热耐力 h s p 可提高机体的热耐力这一点是人们发现生物体内存在h s p 后最早认 识到的，主要表现在生物体在接触亚致死温度后对致死性高温产生耐受性，以 提高机体在致死高温下的生存能力。例如太平洋长牡蛎饲育在远高于其适温的 3 7 下，预处理2h 后，热休克蛋白h s p 7 0 在其鳃部大量堆积，而这些牡蛎在 4 4 这一通常的致死温度下，生长期延长了3 周。人们通过各种实验证实h s p 与动物机体热耐力有关。将h s p 7 0 的单克隆抗体作细胞内注射，再将细胞于4 5 条件下培养2 0m i n ，结果细胞死亡：而未注射h s p 7 0 单抗者，细胞存活率超过 9 0 。当细胞一个或几个编码h s p 的基因不表达，细胞抗热休克能力减弱或消 失。s a n c h c z 通过抑制或灭活细胞的h s p l 0 4 基因的表达发现细胞耐热力降低 【2 8 】。在动物发育的不同阶段，若h s p 表达缺乏时，生物对热敏感，若h s p 表 达时，热耐力增强。g i u d i c e 等 2 9 】比较不同发育阶段海胆胚胎热休克后的发育 状况，结果从受精卵到囊胚胎期间的任何阶段都未发现h s p 的诱导合成，此期 胚胎死亡及异常达9 9 ；但当囊胚期及其以后，热休克可以诱导h s p 合成，胚 胎成活及正常发育率达9 9 以上。 当细胞受到热效应刺激对，增加合成的h s p 可与变性蛋白或异常蛋白相结 合，减少产生不溶性聚集物的危险性并解离无法修复的某些蛋白质，另外通过修 复错误折叠蛋白加快正常蛋白的恢复，使热休克时由于蛋白质变性而造成的蛋白 质量的减少得到补充，从而保持细胞自稳定，保护细胞免受蛋白变性和降解变性 蛋白的损害。因此h s p 的诱导产生可形成机体抗热的保护作用，其广泛的生理和 病理意义已成为当今生命科学研究的热点。 二、h s p 与疾病免疫 中国科学技术大学顾l 学位论文 如前所述h s p 由于其自身具有的免疫原性而在许多感染和自身免疫病参 与引发强烈的细胞和体液免疫。据报道，已知有2 4 种感染性疾病的免疫应答是 针对h s p 的，如结核病、麻风病等。其中对h s p 6 0 的免疫应答最多，如分歧杆 菌的交叉反应性蛋白质抗原作为转基因表达时，产生的保护性大致相近，只有 h s p 6 5 显示出更强的保护性。这为构建以细菌h s p 基因为基础的核酸疫苗奠定 了基础。总之，h s p 在免疫中作为佐剂、抗原和抗原载体，均可提高专一性免 疫效果，利用h s p 的抗原性。其在疾病免疫中的应用前景诱入。 第六节y o r 3 9 1 c p h s p 3 3 酵母中的y o r 3 9 1 c 基因编码一个含有2 3 7 个氨基酸，分子量大约为2 5 5 k d a 的蛋白，属于d j 1 t h i j p f p i 超家族。y o r 3 9 1 c 有两个很相似的同源物：9 9 5 同 源性的y p l 2 8 0 w ( 一个氨基酸有差别) 和y m r 3 2 2 c ( 两个氨基酸有差别) 。另外， y o r 3 9 1 c 与托卯3 c 有6 9 的同源性和2 1 的相似性。基于y d r 5 3 3 c p 和ec o i l 中h s p 3 1 的结构和预计功能的相似性，以及后面三个蛋白的高度同源性。这四个 蛋白，y d r 5 3 3 c p ，y p l 2 8 0 w p ，y o r 3 9 1 c p ，和y m r 3 2 2 c p 分别被重命名为h s p 3 1 ， h s p 3 2 ，h s p 3 3 ，和h s p 3 4 。ec o i l 中h s p 3 1 的晶体学结构揭示了一个在 d j 1 c r h i j p f p i 超家族中常见的催化三联体，因此推测h s p 3 1 是一个分子伴侣和 蛋白酶。它的普适的氨肽酶活性得到了证实，但是没有相关的明显的蛋白酶活 性报道。 中囝车 学技术人学颂h 学位沦文 第二章h s p 3 3 蛋白的克隆、表达和纯化 第一节质粒构建及检测 说明：重组质粒的构建由唐雅瑁完成 y o r 3 9 1 c 基因以s c e r e v i s i a e $ 2 8 8 c 为模版，以p e t 2 8 a 为载体进行p c r 扩 增。酶切位点为n d e l n o t l 。在5 端加入了六个h i s 的编码序列。 载体d 2 8 的抽捉 ；僦基因的i l ， ：i ：! ：囊露d e i 雾n o 甚t 髑d 和 和t i 酶切，w 台匹配酶切壁赢蜱目的基因片断和- - - 4 载体连接 巷茧产物转 化到d 呱a j p c r 和双酶胡鉴定 图2 1y o r 3 9 1 c 基因的简单克隆流程图 第二节h s p 3 3 的表达和纯化 说明：蛋白的表达和纯化由周叶云完成 1 h s p 3 3 的表达 构建好的h s p 3 3 p e t 2 8 a 转) k e c o l ir o s e t t a ( d e 3 ) f n o v a g e n ) 。转化后的细菌装入 2 x y t 培养液中，= j ：2 2 0r p m ，3 7 c 培养至o d 6 0 0 达到0 6 0 8 。以o 2 5m mi p t g i 秀 导，继续培养2 8 小时后，离心收集菌体。 2 h s p 3 3 的纯化、脱盐和浓缩 1 2 中圆科学技术大学硕i j 学位论丘= 离心后的菌体加入l y s i sb u f f e r 1 0 m l3 0 0 r a mn a c i ，2 0 m mt r i sp h 6 1a n d 2 0 m m3 - m e r c a p t o e t h a n o l 】，于冰上进行超声波破碎，离心取上清液。上清液缓 慢通过已经预先经处理并用l y s i sb u f f e r 平衡过的2 5m l 的n i 2 整合亲和层析 柱( a m e r s h a mb i o c i e n c e s ) 。先用同样的b u f f e r ，加入1 0m m i m i d a z o l e 洗柱子， 然后用加入2 5 0m m i m i d a z o l e 的原b u f f e r 冲洗，结合的h s p 3 3 在此过程中沈脱。 洗脱液将在凝胶过滤中进一步纯化。 第三节h s p 3 3 的生化性质鉴定 通过凝胶过滤发现h s p 3 3 的洗脱体积基本茅t l h s p 3 1 的一致，见图2 2 。h s p 3 1 被 证明是在溶液中以二聚形式存在( g r a i l l ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。因此，h s p 3 3 也应以二 聚形式在溶液中存在。 中困科学技术人学侮 i 学位论史 图2 2 h s p 3 1 ( 上) 和h s p 3 3 ( 下) 的凝胶过滤曲线图 1 4 中国科学技术大学硕士学位论文 第三章h s p 3 3 的结晶及晶体结构解析 第一节h s p 3 3 蛋白质的结晶晶体筛选及优化 说明：晶体的筛选和优化由周叶云完成 一、h s p 3 3 结晶条件的初步筛选 h s p 3 3 蛋白溶液使用晶体生长试剂盒 t h ec r y s t a ls c r e e nia n di ik i t s ( h a m p t o nr e s e a r c h ) ，用悬滴气相扩散法生长晶体。在经硅化洁净玻片上加2 山 蛋白样品和2 | | l 的母液，外液3 0 0 p 1 ，进行晶体初步筛选。晶体于2 2 c 条件下生长， 2 4 4 , 时后在4 # 和1 5 # 的条件，显微镜下可观察微小晶体出现。 图3 1 初筛( 左) ，和优化后( 右) 的晶体 二、晶体生长条件的优化 在原有的长出晶体的条件下进行优化。分别以p e g 浓度梯度，p e g 种类， p h 梯度进行网格式筛选。同时尝试了加入各种金属离子，有机小分子。长时间 的优化后得到了适合进行x r a y 衍射分析的晶体。 条件为2 1 的蛋白溶液( 1 0m g m 1 ) 与2 m 母液( 5 g l y c e r o l 。1 8 p e g 3 0 0 0 。2 0 0 m m ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，1 0 0m m t r i s o d i u mc i t r a t ed i h y t r a t e ，p h5 6 ) 混合并以3 0 0 m l 夕b 液 平衡。放置在2 2 的常温环境中7 1 5 天后，晶体大小达到o 2m i l lx0 2 m mx 中固科学技术大学硕j - 学位葩文 2 0 m m 。 第二节h s p 3 3 蛋白质晶体的衍射、数据收集和处理 一、晶体的衍射、数据收集 为了防止晶体迅速被液氮冻络，将甘油浓度提高到3 0 。因此冷冻保护液 的成分为：3 0 g l y c e r o l ，1 8 p e g 3 0 0 0 ，2 0 0m m ( n h 4 ) z s 0 4 ，1 0 0m m t r i - s o d i u m c i t r a t ed i h y t r a t e ，p h5 6 。用本实验室光源( r a - m i c r 0 7 ，r i g a k u ) ，在m a r r e s e a r c h ( ；卒如m ) 像板衍射数据收集系统收集- j h s p 3 3 的晶体衍射数据。每收集一张回 摆角度为1 0 ，曝光时间为3 0 分钟。总共收集了5 4 张衍射图。 图3 2 晶体的x 射线衍射图样 1 6 二、晶体衍射数据的初步处理 , q a u t o m a r m a r r e s e a r c hg m b h 】对衍射数据进行处理。衍射数据达到了 2 3a ，但由于2 3 2 7a 的衍射点较不明显，r m e r g e 过高，在做数据处理时舍弃 了这一部分数据。 表3 1 ：各壳层的数据完整度和误差 r e s 0 1 r a n g ec o m p l e t e n e s sr f i n m f 5 8 28 7 06 8 0 5 8 2 4 6 29 2 76 1 8 4 6 2 4 0 49 4 46 0 3 4 0 4 3 6 79 5 77 4 9 3 6 7 3 4 19 6 59 4 6 3 4 1 3 ，2 19 6 91 1 4 8 3 2 1 3 0 49 7 01 4 4 l 3 0 4 2 9 1 9 7 81 7 3 7 2 9 1 2 8 09 8 01 8 9 0 2 8 0 2 7 0 9 7 92 2 8 4 2 7 0 2 5 39 9 12 9 3 0 2 5 3 2 4 09 9 63 5 5 5 2 4 0 2 3 09 9 34 1 0 1 i n f - 2 7 09 5 4 9 0 0 中闻科学技术大学硕l 学位论文 表3 2 ： 衍射数据的统计参数 r e s o l u t i o n ( a ) 3 0 o 一2 7 w a v e l e n g t h ( a ) 1 5 4 1 7 9 s p a c eg r o u p 尸4 3 2 1 2 u n i tc e l lp a r a m e t e r s ( a ，o ) a = b - - 9 6 4 3 ，c = 1 3 2 2 2 ，a = b r = 9 0 t o t a ln u m b e ro f r e f l e c t i o n s 6 7 ，4 2 0 t o t a ln u m b e ro fu n i q u er e f l e c t i o n s 2 6 ，3 4 9 r m e r g e ( 呦9 0 0 ( 2 2 8 4 ) c o m p l e t e n e s s ( ) 9 5 。4 i o ( i ) 4 5 ( 2 2 、 县砷哦曲柏睁 r 。r 旷毛i - f 统l i 浮慨el i i st h e a v e r a g ei n t e n s i t y 矾髓 s y m m e t r y e q u i v a l e n tr e f l e c t i o n s 第三节h s p 3 3 的结构解析 一、分子置换法得出i n i t i a lm o d e l 1 c e l lc o n t e n ta n a l y s i s 用c c p 4 里的c e l lc o n t e n ta n a l y s i s 程序进行分析，发现一个不对称单位罩 有可能含有两个蛋白质分子，也有可能含有三个蛋白质分子。具体数据见表。 结合h s p 3 3 蛋白在溶液中的聚合状态，很可能是含有两个蛋白质分子。 表3 3 ：c e l lc o n t e n ta n a l y s i s n m o l a s y m m a t t h e w sc o e f f s o l v e n t l5 8 07 8 8 0 22 9 05 7 ，6 1 3l ，9 33 6 4 l 41 4 51 5 2 2 中周科学技术大学硕士学位论文 2 分子置换法求解 h s p 3 3 与已知的h s p 3 1 结构有6 8 的同源性。因此用h s p 3 l 的结构( p d b c o d e - i q v z ) 为模板，用c c p 4 罩的m o l r e p 程序进行分子置换法求解。 从旋转函数表可以看出，有两个相对突出的峰。然后作平移变换的时候， 这两个峰都有一个彼此相差不大，但对于其他峰较突出的解。这进一步证实了 一个不对称单位里含有两个分子。 当把m o l r e p 程序里寻找不对称单位中的分子数设成2 时，就能得到一个很 突出的解了。 表3 4 ：旋转函数结果统计 t h e t a p h i e h i a l p h a b e t a g a m m a r f r f s i g m a s o ir fl9 7 5 01 0 9 2 35 4 2 21 5 4 1 5 3 7 23 3 6 9 51 2 11 7 0 2 s o lr f23 1 2 67 3 0 91 7 8 2 4 7 2 0 66 2 5 l1 0 5 8 81 0 5 5 6 1 2 s o lr f39 1 1 49 6 9 65 2 1 86 4 05 2 1 73 5 2 4 87 1 0 84 1 2 s o ir f41 4 8 8 l - 1 0 5 4 9 1 6 3 0 48 4 3 96 1 6 211 5 3 86 9 7 94 0 5 s o ir f 51 4 9 5 9 一1 0 3 2 71 6 2 5 88 6 8 16 0 0 5i1 3 3 46 9 1 74 0 i s o ir f61 7 1 0 5 1 5 4 7 71 0 5 1 46 3 0 01 4 2 01 9 2 5 46 7 0 8 3 8 9 s o lr f 72 8 5 29 5 9 91 0 9 5 95 7 2 24 5 9 24 5 2 56 3 6 43 6 9 s o lr f86 3 1 4 9 4 9 97 9 8 52 5 7 06 9 8 61 5 7 26 2 5 53 6 3 s o ir f91 1 0 5 91 6 0 9 0 8 7 2 85 2 3 68 0 4 82 7 0 5 66 0 1 i3 4 8 s o lr fl o1 3 8 3 9 1 3 5 8 51 4 0 2 86 9 9 47 7 3 01 6 i 6 35 9 7 93 4 7 s o lr fll1 4 7 6 8 1li 8 0 1 5 9 8 08 0 1 06 3 5 i1 2 3 7 05 9 7 i3 4 6 s o ir f1 2 1 1 2 1 91 2 8 1 34 5 7 32 9 ，0 84 2 1 83 1 2 8 25 9 2 13 4 3 s o lr f 1 31 4 3 1 3 11 3 0 21 4 8 2 38 6 5 67 0 4 9 1 3 2 6 0 5 8 6 9 3 4 0 s o lr f1 41 1 7 1 7 1 7 4 0 2 1 0 0 4 96 7 2 28 6 3 02 3 5 2 55 8 3 23 3 8 s o lr f1 5 1 3 2 8 81 6 7 0 56 1 7 55 4 9 14 4 1 82 6 0 8 l5 7 9 7 3 3 6 s o ir f 1 6 5 7 4 l 7 3 1 21 0 5 3 71 8 3 78 4 1 45 2 1 35 7 9 43 3 6 s o lr f1 71 0 5 5 41 1 9 6 3 9 1 8 71 4 1 58 7 6 23 1 4 9 05 7 2 83 3 2 9 中国科学技术大学颐l 学位论文 s o lr f s o lr f s o lr f 1 83 4 4 35 0 4 01 3 2 5 22 2 3 36 2 3 41 0 1 5 45 7 1 63 3 l 1 91 7 4 4 8 一1 5 7 2 31 0 6 5 25 9 6 48 8 51 9 4 1 05 7 1 53 3 l 2 01 5 4 ，4 5 - 1 3 2 5 01 4 3 5 4 6 7 5 5 4 8 3 71 5 2 5 65 7 1 33 3 s o l r f 2 l5 3 6 66 9 0 8i1 9 0 6 2 4 2 9 8 7 9 46 6 1 25 6 7 43 2 9 s o l r f 2 21 7 6 2 8 1 6 0 6 51 0 8 7 15 5 0 56 0 41 9 6 3 55 6 4 83 2 7 s o lr f2 31 5 8 ，7 6 1 7 0 5 4 8 2 ，4 7 6 0 2 l2 7 6 22 2 1 3 0 5 6 4 23 2 7 s o lr f s o ir f s o ii 强 s o lr f s o lr f s o lr f s o lr f 2 41 0 0 8 51 2 8 2 18 7 6 32 7 9 78 5 6 83 ii 5 65 6 0 03 2 5 2 51 3 7 ，2 0 1 2 5 4 l1 6 1 2 36 7 2 8跗1 91 3 8 1 l5 5 9 63 2 4 2 63 0 7 45 5 5 51 3 2 ，6 72 8 5 35 5 8 39 7 4 45 5 9 33 2 4 2 7 1 4 i 1 3 1 4 2 9 71 4 5 2 15 8 9 57 3 5 71 6 4 8 95 5 5 53 2 2 2 83 0 3 75 3 6 21 3 0 9 7 2 5 7 6 5 4 7 79 8 5 2 2 91 3 4 1 61 6 6 1 45 8 ，2 55 4 9 24 0 8 72 6 2 6 5 3 06 5 0 49 6 9 29 5 4 031 8 08 4 2 l1 7 9 6 5 4 7 63 1 7 5 4 3 93 1 5 5 3 7 43 1 2 表3 5 ：寻找一个分子时的平移函数结果统计 s - r f t f t h e l a p h i e h i i x t y 杞t f c n tr f a es c o r s2tl3 1 2 6 7 3 0 9 1 7 8 2 40 8 1 50 4 l s 0 4 5 6 1 2 7 20 6 0 80 2 8 0 sli29 7 5 01 0 9 2 35 4 2 20 1 3 50 3 7 90 3 9 9ii 9 20 6 1 90 2 5 2 s5 i 31 4 9 5 9 1 0 3 2 71 6 2 5 8 o 3 8 00 3 2 80 。2 8 1 2 ，4 60 6 5 50 1 5 3 s41 541 4 8 8 1 1 0 5 4 91 6 3 0 40 5 3 70 2 2 60 4 0 81 9 70 6 5 40 1 5 2 s 73 52 s 5 2 9 5 9 91 0 9 5 90 6 0 00 1 2 60 0 0 5 1 9 0 0 6 5 3 0 1 4 8 s3 l 6 9 1 1 49 6 9 65 2 1 80 5 1 50 0 9 00 0 3 11 7 70 6 5 40 ，1 4 7 s8l76 3 1 49 4 9 97 9 8 50 5 2 70 0 1 60 1 0 32 3 50 ，6 5 90 1 4 5 s1 0681 3 8 3 9 - 1 3 5 8 51 4 0 2 80 8 6 00 2 9 20 4 7 01 5 50 6 5 40 1 4 3 s6 l 91 7 i 0 5 1 5 4 7 71 0 5 1 40 7 4 00 3 8 6 0 4 8 6 1 9 50 6 6 l0 1 4 3 sl ll1 01 4 7 6 8 1 1 1 8 01 5 9 8 00 0 1 00 2 0 30 3 8 0i 0 90 6 5 90 1 4 0 s9ll l1 1 0 5 91 6 0 9 08 7 2 80 1 9 90 4 7 90 3 2 6i 4 50 6 6 00 1 3 8 中国科学技术人学硕i j 学位论文 表3 6 ： 寻找两个分子时的平移函数结果统计 & r f t f t h e m p h i c h i 挑ty t 7 t f c n tr f a cs c o r slli9 7 5 01 0 9 2 35 4 2 2 0 6 3 6 0 8 7 8