（化学工艺专业论文）太湖水华蓝藻中藻蓝蛋白的富集分离.pdf

摘要 摘要 摘要：太湖水华蓝藻主要由铜绿微囊藻、水华鱼腥藻和水华束丝藻等藻类组成，是太湖流 域的夏季主要污染物之一。从水华蓝藻中提取蛋白质、多糖等有价值物质，为治理提供了 一条变废为宝、提高综合治理效益的新的有效途径。藻蓝蛋白是蓝藻捕光色素复合体中重 要的成分之一，可作为天然色素、荧光标记物，还具有一定的药用价值。 本论文以太湖水华蓝藻为对象，以其中的藻蓝蛋白为提取目标，系统研究了富集分离 过程，主要研究内容如下： 1 采用单因素扫描和全因子设计响应面优化方法获得薄层层析微囊藻毒素m c l r 、 m c r r 的展开剂体系，溶剂比例为三氯甲烷：甲醇：水= 6 5 ：2 5 ：2 。m c l r 、m c r r 的展开斑 点通过碘蒸气显色的目测检出最低浓度为1m g l 。薄层色谱扫描法检出的m c l r 、 m c r r 最低浓度为0 0 0l m g l 。m c l r 、m c r r 的色谱扫描峰面积与其浓度在0 0 5 1 0 m g l 以浓度范围内呈线性关系，检测准确度达9 5 以上。 2 破碎蓝藻细胞的最适方法为反复冻融法，所需的最佳条件为：每0 1g 蓝藻细胞( 干 重) 加1 5m l 水，于2 0 和3 7 。c 间反复冻融5 次，获得的蛋白含量为1 4 。蛋白沉淀的 最适经典方法为硫酸铵盐析沉淀法，条件为两步盐析，破壁上清液先用2 0 饱和度的硫酸 铵盐析，离心取上清。然后再用6 0 饱和度的硫酸铵盐析，离心取沉淀，复溶后蛋白得率 为7 8 3 2 ，光谱纯度达到0 3 2 。盐析后的蛋白质溶液经薄层层析检测出微量的微囊藻毒素 m c l r ，m c r r 。 3 静态吸附实验表明实验室自制的j d n 3 型树脂在吸附蛋白和选择性吸附藻蓝蛋白的 性能上较市售的7 1 7 ，7 3 2 树脂和羟基磷灰石好。j d n 3 型树脂性能较稳定，有良好的重复 使用性能。离子交换层析实验表明用0 2m o l l 。1 n a c l 以0 5m l m i n o 的流速洗脱能将吸附 在j d n 3 型树脂上的藻蛋白较为充分的解析下来，并能提高藻蓝蛋白的光谱纯度。 关键词：太湖水华蓝藻，藻蓝蛋白，微囊藻毒素，吸附树脂，富集分离 a b s t r a c t a b s t r a c t c y a n o b a c t e d ab l o o mi nt a il a k e ，m a i n l yc o m p o s e do fm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a , a n a b a e n a f l o s a q u a ea n da p h a n i z o m e n o nf l o s a q u a e ，i so n eo ft h em a i np o l l u t a n t si nt a il a k ei ns u m m e r h o w e v e r , t h ep r o t e i n s ，p o l y s a c c h a r i d e sa n do t h e rc o m p o n e n t sc o n t a i n e di nc y a n o b a c t e r i aa r e v a l u a b l e f o re x a m p l e ，p h y c o c y a n i n ，o n eo ft h ec o m p o n e n ti nc y a n o b a c t e r i ab l o o mi sa l i g h t - h a r v e s t i n gc o m p o n e n tw h i c hc a nb eu s e da sn a t u r a lp i g m e n t ，f l u o r e s c e n tm a r k e ra n di s v a l u a b l ei nm e d i c i n et r e a t m e n t ，n l es u c c e s s f u ls e p a r a t i o no ft h e s ev a l u a b l ec o m p o n e n t sf r o m c y a n o b a c t e f i ab l o o mi st h e r e f o r es i g n i f i c a n tf o rc h a n g i n gt h ew a s t e t ov a l u a b l em a t e r i a l s i nt h i ss t u d y , t h es e p a r a t i o no fp h y c o c y a n i nf r o mc y a n o b a c t e r i ab l o o mi nt a il a k eh a db e e n i n v e s t i g a t e ds y s t e m a t i c a l l ya n dt h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n sc o u l db ed r a w n ： 1 i nt h e i n v e s t i g a t i o n o fd e t e c t i o no f m c l r ( m i c r o c y s t i n l r ) a n dm c r r ( m i c r o c y s t i n r r ) b yt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y , t h eo p t i m u md e v e l o p i n gs o l v e n tw a sf o u n d t 0b eam i x t u r eo ft r i c h l o r o m e t h a n e m e t h a n o la n dw a t e ri nav o l u m er a t i oo f6 5 ：2 5 ：2b ys i n g l e f a c t o rt e s t i n ga n dr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s b yv i s u a lo b s e r v a t i o nt h el o w e s tc o n c e n t r a t i o no f m c l ra n dm c i 之ru s i n gi o d i n ed e v e l o p m e n tc o u l db ed e t e r m i n e da slm g l ，w h e r e a su s i n g t l c - s c a n n i n g i tc o u l db ea sl o wa s0 0 01m g l t h el i n e a rr e l a t i o n sb e t w e e nt h ep c a ka r e a so f c h r o m a t o g r a p h i cs c a n n i n gf i g u r e sa n dt h ec o n c e n t r a t i o n so fm c l ro rm c r rw e r ef o u n dt ob e l o c a t e di nt h er a n g eo f0 0 5 10m g l t 1 1 ea c c u r a c yo ft h ed e t e c t i o nw a sa b o v e9 5 2 i tw a sf o u n dt h a tt h em o s ts u i t a b l em e t h o df o rd i s r u p t i n gc y a n o b a c t e r i ac e l lw a s f r e e z i n g t h a w i n g t l 忙o p t i m a lp r o c e d u r ew a sa sf o l l o w i n g ：p u to 1gc y a n o b a c t e r i a ( d r yw e i g h t ) i l l1 5m lw a t e rf o l l o w e db yf r e e z i n gt h em i x t u r ea t 2 0 a n dt h a w e da t3 7 r e p e a t e d l yf o rf i v e t i m e s t h ep r o t e i ni ns u p e m a t a n tw a sd e t e r m i n e dt ob ea p p r o x i m a t e l y14 ( d r yw e i g h t ) o ft h e c y a n o b a c t e r i aa d d e d as i m p l em e t h o dt oa b s t r a c tc y a n o b a c t e r i ap r o t e i nf r o mt h es u p e r n a t a n ti s s a l t i n g - o u t i n t ot 1 1 es u p e r n a t a n ta m m o n i as u l f a t ew a sa d d e dt oas a t u r a t i o nd e g r e eo f2 0 f o l l o w e db y c e n t r i f u g a t i o n a n dr e m o v i n gt h e p r e c i p i t a t ew h i c hw e r em o s t l yi m p u r i t i e s a f t e r w a r d ，m o r ea m m o n i as u l f a t ew a sa d d e dt ot h es u p e r n a t a n tu n t i lat o t a ls a t u r a t i o nd e g r e eo f 6 0 ，a n dt h es u p e r n a t a n tw a sc e n t r i f u g e da g a i nf o rc o l l e c t i n gt h ep r e c i p i t a t e dp r o t e i n 1 1 1 e r e c o v e r yb yt h es a l t i n g o u tm e t h o dw a s7 8 3 2 a n dt h ep u r i t yr e a c h e d0 3 2 t h em c l ra n d m c r ri nt h ec o l l e c t e dp r o t e i nw a sd e t e c t e db yt l ct ob en e g l i g i b l e 3 t h es t a t i cs t a t ea d s o r p t i o ns t u d yi n d i c a t e dt h a tj d n 3r e s i nw ep r e p a r e di nl a bs h o w e da h i g h e ra d s o r p t i o na n ds e l e c t i v i t yt op h y c o c y a n i nt h a n7 17r e s i n , 7 3 2r e s i na n dh y d r o x y a p a t i t e m o r e o v e r , t h ej d n 一3r e s i nh a das t e a d yp e r f o r m a n c ea n dag o o dr e u s a b i l i t y i o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h yi n v e s t i g a t i o ni n d i c a t e dt h a tp r o t e i n sa d s o r b e do nj d n - 3r e s i nc o u l db ee l u t e d s u f f i c i e n t l yu s i n g0 2m o l l _ n a c la ta ne l u t i n gr a t eo f0 5m l m i d1 k e y w o r d s ：c y a n o b a c t e r i ab l o o mi nt a il a k e ，p h y c o c y a n i n , m i c r o c y s t i n s ，a d s o r p t i o nr e s i n s ， s e p a r a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 细厂年7 , 目t gn 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：盅遣导师签名： 日期：k 7 ，年7 月i 日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 藻蓝蛋白 1 1 1 藻胆蛋白 藻胆蛋白是一类捕光色素复合体，它主要存在于红藻、蓝藻、隐藻和少数一些甲藻中， 在光合作用中扮演重要角色；在红藻和蓝藻中它还可以作为储藏蛋白。在氯源不足时分解 以提供氮源，维持生存。 目前已有报道的藻胆蛋白主要可分为4 类，叩藻红蚩白、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白和别 藻蓝蛋白。根据蛋白来源的不同，又可以分为若干个小类，每一小类前面冠以b 、c 和r ， 用来表示各种藻胆蛋白的来源 i “，藻胆蛋白在不同藻类中种类、含量均有所不同。藻胆蛋 白是一类多亚基蛋自质，基本结构单元是和b 亚基，亚基的分子量大约在1 7k d a 至2 2k d a 之间。r _ 和b 藻红蛋白中还存在少量的y 亚基，其分子量约为3 0k d a 。每种亚基是由开链 四毗咯结构的色基和脱辅基蛋白构成，开链四毗咯结构的色基通过硫醚键与脱辅基蛋白的 半胱氨酸残基相联。 1 _ 1 2 藻蓝蛋白在藻胆蛋白中的位置和分类 藻胆蛋白的基本结构被形象的称为棒一核结构。其中，藻蓝蛋白外侧与位于藻胆体杆外 侧的藻红蛋白( p e ) 相连，组成藻胆蛋白的棒结构i 藻蓝蛋白内侧与藻胆体核( 由别藻蓝 蛋白( a p c ) 和别藻蓝蛋白b ( a p c b ) 形成的核结构) 相连，如图1 - 1 所示p l 。藻蓝蛋白 是二级捕光色素，在藻细胞光合作用中有重要作用。它由开链四吡咯发色团经硫醚键和脱 辅基蛋白共价交联而成，在光合作用中，能以接近1 0 0 的效率把光能优先传递给光系统 1 ir 3 , 4 1 。根据光谱的特征吸收，藻蓝蛋白( p c ) 可分为c 藻蓝蛋白( c p c ，6 2 0n m 有吸收 峰) ，藻红蓝蛋白( p e c ，5 7 0n m 有吸收峰) 和r _ 藻蓝蛋白( r p c ，5 4 6n m 和6 1 4n m 有 吸收峰) 1 5 ，它们在结构、性质、功能等方面不尽相同。 图1 - 1 蓝藻藻胆蛋白棒一核结构 f i g1 1r o d - c o r es t 埘c t l l eo f p h y c o b i l i p r o t e i n s 江南大学硕士学位论文 1 1 3 藻蓝蛋白的结构 不同来源的藻蓝蛋白，基本的构成单元均为( 0 【p ) 单体，并且它们的仪一亚基，p 一亚基 的氨基酸序列有很高的同源性。仅亚基和p 亚基通常以六聚体( 0 c p ) 6 的形式存在，但目前对 于亚基的分子量大小说法也不尽相同【6 】。组成藻胆蛋白的d 一亚基的8 4 位、1 5 5 位和仪一亚基 的8 4 位均连接一个发色基团。目前发现的发色基团有藻紫胆素( p v b ) ，藻蓝胆素( p c b ) ， 藻红胆素( p e b ) 和藻尿胆素( p u b ) 。不同的藻胆蛋白连接的发色基团种类不同，在c p c 中，所连接的三个发色团均为p c b ；在p e c 中，其旷亚基8 4 位连接的是p v b ：在r - p c 中，其d 一亚基1 5 5 位连接的是p e b ，其余的两个色团均为p c b 。特别值得关注的是，在藻 蓝蛋白属中，所有的藻胆蛋白的d 一亚基8 4 位所连接的发色基团均为p c b l 5 j 。 1 1 4 藻蓝蛋白的性质及应用 1 光学与荧光性质 由于结合发色团的位置、类型以及数量上的不同，藻蓝蛋白分子的光学性质也不尽相 同。两种主要的藻蓝蛋白的光学特征如下：r p c 在6 1 5 6 2 0n m 处有最大吸收峰，最大荧 光发射峰在6 3 5 6 4 0n m 之间；c p c 在6 1 5 6 2 5n m 处有最大特征吸收峰，最大荧光发射峰 在6 3 5 6 4 8n m 之间。 俞丽君等t t j n 定藻蓝蛋白在6 2 5n m 处有最大吸收峰，其荧光发射峰位于6 4 8r i m 。王 广策等【8 】运用荧光光谱法研究了c p c 分子内不同基团间的能量传递。结果显示，c p c 分 子在2 4 0 2 4 5n m 处的荧光激发峰由二硫键产生，它能将吸收的能量传至色基；c p c 分子 内的芳香族氨基酸残基能将能量传至与脱辅基蛋白共价交联的色基，从而使色基产生相应 的荧光。由于不同来源和种类的藻蓝蛋白存在一定的差异，且各研究人员采用的藻蓝蛋白 样品的光谱纯度有差异，因此已报道的藻蓝蛋白的光谱性质也不尽相同。 2 藻蓝蛋白的稳定性及影响因素 许多环境因素如p h 值、温度、金属离子等能够影响藻蓝蛋白以及其亚基上连接的色 素基团的稳定性。张以芳等【9 】研究表明，在p h4 0 - 8 5 之间藻蓝蛋白能稳定存在。在 p h 5 0 6 0 时，藻蓝蛋白稳定性最好，离开这个范围越远，其稳定性越差。由于来源不同和 种类的差别，目前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论，但都在3 4 4 8 之间。当温度 在4 0 以下时，藻蓝蛋白及色素基团皆能稳定存在；加热温度达至6 0 时，色素降解 速度加快；而超过7 0 时，在3 0m i n 内蓝色素全部变为绿色。当环境中有铁离子和锌离 子存在时，蓝色素会出现沉淀。随着铁离子和锌离子强度的增大，色素由蓝色变绿后转为 黄色；钾离子和钙离子对色素基本没有影响。蔗糖的存在几乎对色素没有影响；葡萄糖的 存在会使藻蓝色素的降解加快，产生绿色沉淀。此外，添加剂中的酸味剂柠檬酸、抗坏血 酸、抗氧剂h 2 0 2 、尼泊金酯、防腐剂山梨酸等也会影响色素的稳定性，使色素变色、降解 或沉淀。因此，保持藻蓝蛋白及色素基团的稳定性是在研究中必须注意的问题。 3 抗炎性 藻蓝蛋白对活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) 有清除行为。它的抗氧化和氧自由基属 性可能与它的抗炎症活性有关。在各种体外和体内实验模型中，藻蓝蛋白通过清除羟基、 2 第一章绪论 烷氧基和过氧化物等活性氧物质来实现抗炎症活性【l 们。另外，在葡萄糖氧化酶诱导的老鼠 发炎的实验中，藻蓝蛋白降低了水肿指数【1 1 】。 4 抗癌及提高机体免疫系统活性 体外培养实验发现，藻蓝蛋白对h e l a 细胞( 子宫颈癌细胞) 有较强的抑制生长作用。 随着培养体系中藻蓝蛋白浓度从1 0m g l d 升高至5 0m g l ，抑制率逐步提高，从3 5 升 至3l 。对活细胞的细胞周期用流式细胞技术( f c m ) 进一步进行检测发现，在藻蓝蛋白 作用下，h e l a 细胞由s ，g 2 ，m 期向g i 期转变和积聚( 即由合成期和有丝分裂期向间隙 期转变积聚) ，初步认为这可能是藻蓝蛋白抑制癌细胞生长的机制【1 2 1 。张成武等【1 3 】运用 m t t 法和半固体琼脂培养法，测定了螺旋藻藻蓝蛋白对体外培养的人白血病细胞株k - 5 6 2 ， h l 一6 0 ，u - 9 3 7 生长的影响，研究表明，对这三种白血病细胞，藻蓝蛋白均有不同程度的抑 制作用，且这种抑制作用存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用强。 藻蓝蛋白具有较高的促红细胞生成素( e p o ) 活性，有刺激骨髓造血的功效【m 】。藻蓝 蛋白能帮助经c 0 y 射线照射的小鼠提高粒单系祖细胞生成，恢复其造血功能，临床上可 用各种血液疾病的辅助治疗【1 5 1 。体外实验表明，藻蓝蛋白有促进体外培养的人r m i n i8 2 2 6 细胞生长的作用。i i j i m a 等的研究表明藻蓝蛋白具有提高免疫系统的活性的作用，这一结 果由日本t o h o k u 大学牙科学院的研究进一步证实【1 6 】。细胞实验结果显示【6 】：r 藻蓝蛋白通 过促进b 淋巴细胞增殖提高免疫功能，而c 藻蓝蛋白不具备这种功能。这可能是由于两 种蛋白质在空间结构上的差异引起的，如果能进一步解释两者结构上的不同，则可以为研 究r 藻蓝蛋白提高免疫功能的机理提供依据。 5 免疫荧光技术 藻胆蛋白能够发射强烈的荧光，相比于常用的荧光素，其荧光强度强3 0 倍左右。藻胆 蛋白具有优良的荧光性质：( 1 ) 其它生物物质不能自发猝灭藻胆蛋白所发荧光：( 2 ) 吸光 度和荧光量在较大的p h 值范围内子产率高，对灵敏度的提高有促进作用；( 3 ) 水溶性较好， 非特异性结合对其发射荧光影响小；( 4 ) 液体或固体状态存在时都极为稳定，适合长期保 存；( 5 ) s t o k e s 位移较大，有较高的可靠性和灵敏度；( 6 ) 藻胆蛋白表面存在较多的活 性基团，如一n h 2 基、- - s h 基等，它们易于与其它分子交联形成结合体，可用于多色标记， 实现多组分的同时测定。这些显著的特点克服了常用荧光标记物在检测中的易猝灭、可靠 性和稳定性低、荧光背景大等缺点，并有利于激发光的选择，使荧光检测的敏感性大大提 耐1 7 j 。以藻胆蛋白作为诊断试剂和荧光标记物的研究日益受到人们的关注，藻胆蛋白的安 全性和荧光特性使其成为独特的新型荧光标记物，目前已研究应用于荧光免疫分析、免疫 组化诊断等领域。 1 1 5 藻蓝蛋白的分离纯化 目前，藻蓝蛋白的分离纯化还处于实验室研究阶段，由于成本等因素制约无法进行大 规模的工业生产。藻蓝蛋白的提取纯化分为三个阶段：( 1 ) 破壁，使藻蛋白溶解于提取液 中。现在普遍使用的细胞破碎方法有：超声波法、反复冻融法、化学试剂处理法、溶胀法 和组织捣碎法5 种，在实际操作中，经常是几种方法混合使用，以使藻蓝蛋白尽可能地溶 出；( 2 ) 蛋白沉淀，在沉淀提取过程应保持蛋白的活性。蛋白质沉淀方法有：盐析法、结 3 江南大学硕士学位论文 晶法、等电点沉淀法和超滤法等4 种；( 3 ) 分离纯化，精制已经提取出的粗蛋白，提高其 光谱纯度。传统的方法有：羟基磷灰石柱层析法、凝胶层析法、离子交换法及较少使用的 硅藻土柱层析法等。在实际应用中常常是两种或两种以上的方法同时使用才能收到较好的 效果。 藻蓝蛋白的光谱纯度是以氏2 0 a 2 8 0 的吸收率比值来评定的，食品级的光谱纯度是0 7 ， 反应级是3 9 ，大于等于4 0 才具有实际应用价值。传统的提取纯化步骤较为烦琐，成本高 昂，并且得到的光谱纯度并不高，大部分方法只能生产出食品级或反应级的光谱纯度。因 此，想要进一步研究、生产、应用藻蓝蛋白，就需要开发出更简便，更高效，低成本的提 出纯化方法。 根据国内外的文献报道，提取藻蓝蛋白的的原料基本都是螺旋藻，在粗提阶段大多采 用反复冻融法或超声破碎法进行藻细胞破壁，然后用硫酸铵盐析沉淀。纯化部分报道的方 法各有不同：李冰等【1 8 】将藻蓝蛋白粗提液经过两次羟基磷灰石柱( h a ) 层析和s e p h a c r y l h r - 2 0 0 凝胶层析对其进行纯化，光谱纯度达到4 1 7 。韦萍等【1 9 】将藻蓝蛋白粗提液分别通过 d e a e s e p h a d e x 和两次羟基磷灰石柱，然后经g 1 5 0 柱纯化，光谱纯度可达4 9 6 。b a d r i s h s o n i 2 0 l 将蛋白粗提液先过g 1 5 0 柱，合并含p c 的洗脱液上d e a e 阴离子交换柱纯化，光谱 纯度可达3 3 1 。g a n a p a t h ip a t i l 2 l 】采用双水相提取和离子交换柱联用的方法，经双水相提取 后，光谱纯度达5 2 2 。再经过离子交换柱d e a e s e p h a d e x 纯化，光谱纯度可达6 6 9 。可以看 到，纯化部分全部采用商品级的离子交换剂作为填料，成本高昂，操作繁琐，不利于大规 模制备。因此如何开发出成本低廉，操作简便的生产工艺将会是今后研究中的热点。 1 2 蓝藻毒素 水华现象是指水库、池塘、湖泊和河流中流入过多的氮和磷等富营养物质，导致水体 的生态结构与功能发生变化，使藻类特别是蓝藻出现的异常生长繁殖现象，一般在在夏秋 气温升高时出现。水华蓝藻污染所带来的主要危害，是能代谢产生毒素的蓝藻细胞破裂后 向水体中释放多种不同类型的藻毒素。代谢产生的毒素包括具有神经毒性的生物碱类以及 具有肝脏毒害性和致癌性的环肽类、脂多糖和内毒素等瞄】。据文献报道，目前已经发现的 代谢产生毒素的淡水蓝藻约有1 2 属2 6 种【2 3 1 。其中，微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n ，m c ) 是一 类在水华蓝藻污染中产生量最大，出现频率最高，造成危害最严重的藻毒素种类1 2 4 】。 1 2 1 微囊藻毒素的结构与性质 微囊藻毒素是一类具有的单环七肽的生物活性物质【2 5 1 ，一般结构为( d 丙氨酸l x b _ 甲基一d 异天冬氨酸一l z a d d a - d 异谷氨酸- n m d h a ) 1 2 6 1 。其中，m d h a 是一种特殊氨基酸， a d d a ( 3 氨基9 甲氧基2 ，6 ，8 三甲基1 0 苯基4 ，6 二烯酸) 是一种特殊的2 0 个碳原子的氨基 酸，是m c s 生物活性表达所必需的基团【2 7 1 。至今已鉴定的6 5 种微囊藻毒素异构体在羟基化、 甲基化、去甲基化、差相异构化、多肽序列上都有差异。其中存在较普遍且毒性较大的是 m c r r 、m c l r 和m c y r 等，其中r 、l 、y 分别代表精氨酸、亮氨酸和酪氨酸【2 8 】。微囊 藻毒素分子结构见图1 2 。 4 第一章绪论 oc o o h 图1 - 2 微囊藻毒素结构通式 f i g 1 2s t r u c t u r e so fm o s tc o m m o nm i c r o c y s t i n s ( m c s ) 表1 1 微囊藻毒素l r ，r r 分子结构 t a b 1 1s t r u c t u r e so fm i c r o c y s t i n - l r , r r m c s 具有热稳定性，加热煮沸不易使其丧失毒性。m c s 抗p h 值变化，而且自来水处理 工艺中的混凝沉淀、过滤、加氯等处理均不能将其彻底去除。m c s 易溶于丙酮、甲醇或水， 但不能溶于非极性溶剂1 2 9 1 。虽然m c s 为多肽结构，但是蛋白质水解酶对它们也不起作用【2 4 】。 m c s 在阳光照射下非常稳定，但经紫外线照射可发生化学异构、化学键合反应甚至水解而 丧失毒性。特别当紫外线波长接近其吸收峰附近时，m c s 可被迅速降解。在色素存在的情 况下，m c s 活性降低，可被迅速降解【3 们。此外，在自然条件下，光照和温度对m c s 构型的 变化起到重要作用。不同季节，从不同水域甚至同一水域收集到的同种微囊藻毒株的毒性 表现出很大差异p 。 0 1 2 2 微囊藻毒素的毒性 s i n g h 等研究表明，浓度为5 0m g l 。1 的m c s 可使得藻细胞溶解，完全抑制鱼腥藻和灰 色念珠藻的生长。研究同时发现m c s 对光合作用和二氧化碳的吸收有不良影响【3 2 】。这表明 铜绿微囊藻通过代谢产生m c s 毒害抑制其他藻类生长，是在自然条件下保持自身为优势藻 种的重要原因。 人群中原发性大肠癌和肝癌的发病率与饮用水中m c s 的存在有很大的相关性。研究显 示，动物的肝脏是m c s 的主要靶器官。血液中的m c s 可以流动进入肝脏，临床症状表现为 肝脏肿胀充血，甚至导致肝脏出血和坏死，动物因失血过多而休克死亡【3 3 ，3 4 1 。m c s 的致毒 机理是，通过与肝细胞中蛋白磷酸酶( p r o t e i np h o s p h a t a s e ) 的丝氨酸一苏氨酸亚基结合， 蛋白磷酸酶的活性被m c s 抑制，从而诱发细胞角蛋白高度磷酸化，哺乳动物肝细胞微丝破 裂、分解和出血，肝脏表现为充血肿大。另一方面，蛋白磷酸酶的活性受到抑制，相对增 加了蛋白激酶的活力，磷酸化和脱磷酸化的平衡被打破，从而促进了肿瘤的发生【2 4 1 。d i n g 等研究表明，原代培养的大鼠肝细胞经m c s 处理后，可引起活性氧和乳酸脱氢酶释放率的 升蒯”】。h u 等研究发现，m c s 能诱导蓝藻细长聚球藻细胞产生氧化胁迫现象，从而激活藻 细胞的抗氧化系统参与抗氧化胁迫反应【3 6 】。z e g u r a 等研究表明，m c s 能诱发细胞氧化释放 5 江南大学硕士学位论文 活性氧，因而造成d n a 氧化损伤f 3 7 1 。另外，m c s 还可通过激活细胞内的核酸内切酶引起d n a 链的无规则断裂【3 8 1 。由于目前m c s 的致毒机理在分子水平上的研究还未十分深入，因此尚 且无法评估其在环境安全性方面的危害。 1 2 3 微囊藻毒素的检测 近十几年来，m c s 的检测和定量方法由简单的生物学角度检测发展为简便快捷的仪器 分析。m c s 的检测分析是研究m c s 致毒机理、在水环境中迁移和分布及藻毒素去除降解的 基础。m c s 的检测方法可以分为：色谱分析法、生物分析法、酶联免疫吸附法( e l i s a ) 、 蛋白磷酸酶抑制法和聚合酶链反应( p c r ) 分析。 1 色谱分析法 3 9 1 m c s 的色谱分析技术包括液相色谱技术( l c ) ，薄层色谱法( t l c ) ，高效液相色谱 ( h p l c ) ，质谱分析( m s ) 及毛细管电泳技术( c e ) 。色谱分析法适应性广泛，操作简便。 2 生物分析法【4 0 】 生物分析是最简单的常规毒性分析法，一般采用动物注射或口服间接评估藻毒素的毒 性。生物分析法操作简单，可以较为直观地反映微囊藻毒素的总体毒性。以半致死剂量 ( l d s 0 i t g k g 。1 ) 来衡量毒性强弱。 3 e l i s a 分析法 酶联免疫吸附法( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 检测m c s 具有较高 的检测灵敏度和快捷的分析速度。e l i s a 分析法利用多克隆或单克隆抗体有较强的特异性 识别能力这一特点，测定水环境中m c s 时无需预浓缩样品1 4 。 4 蛋白磷酸酶抑制法 从分子水平上测定m c s 的毒性可以采用蛋白磷酸酶抑制分析法( p p i a ) 1 4 2 1 。这种方法 的优点是分析时间短，操作简便，检测灵敏度高。 5 聚合酶联反应( p c r ) 检测1 4 3 j 前面所述的四种测定方法有一个共同的缺点，即不能确定m c s 由何种藻类代谢产生。 不同藻类可能合成同一结构的m c s ，藻细胞的密度决定了m c s 的代谢释放量。p c r 技术应 用基因片断分析方法实现对藻类数量的计数和产毒藻类的识别。 1 3 本论文研究的主要内容 1 3 1 国内外提取纯化藻蓝蛋白的主要不足之处 国内外研究主要以螺旋藻等经济藻类为原料，围绕提高藻蓝蛋白得率以及光谱纯度展 开工作。文献所报道的提取纯化方法主要存在以下的不足： 1 采用的粗提取蛋白的沉淀法，如等电点沉淀，盐析，有机溶剂沉淀等，对蛋白得率 以及蛋白变性都有影响。 2 纯化时多采用柱层析，而且为了提高光谱纯度多采用两次柱层析，操作繁琐，耗时 长，成本高，只适于制备少量样品。如果想要应用于生产则必须开发操作简便，效率更高， 成本较低的纯化方法。 6 第一章绪论 1 3 2 研究内容 本课题以太湖水华蓝藻为对象，富集分离其藻蓝蛋白，为研究太湖蓝藻种类及其光合 转化效率，水华蓝藻废弃物的资源化利用提供前期研究基础。具体研究内容如下： 1 微囊藻毒素m c l r ，m c r r 的薄层层析检测方法建立。 2 分析采用溶菌酶法，反复冻融法和超声破碎法等方法对藻体细胞进行破碎，离心取 上层澄清液( 藻蓝蛋白粗提液) 比较这几种方法的破碎效果，获得最优条件。 3 考察硫酸铵沉淀法，等电点法提取蛋白质。研究改变提取条件，包括p h 值，硫酸 铵的饱和度对蛋白得率和光谱纯度的影响。 4 初步探讨了自制的j d n 3 型树脂在富集分离太湖水华蓝藻中藻蓝蛋白的应用效果。 7 第二章微囊藻毒素检测用薄层层析法研究 第二章微囊藻毒素检测用薄层层析法研究 2 1 引言 本课题以太湖水华蓝藻为对象，富集分离其藻蓝蛋白。由于水华蓝藻会代谢生成对环 境以及人体有毒害作用的微囊藻毒素，因此在富集分离藻蓝蛋白的同时要去除微囊藻毒 素。为了检测微囊藻毒素的去除情况，必须建立简便快捷的检测方法。 2 2 实验材料及仪器 表2 1 实验试剂 t l b 2 1m a t e r i a l su s e d 表2 - 2 实验仪器 t a b 2 - 2a p p a r a t u sa n de q u i p m e n tu s e d 仪器名称产地 t l cs c a n n e r3 型薄层色谱扫描仪 z k 8 2 b 电热真空干燥箱 层析硅胶薄板g f 2 5 4 瑞士c a m a g 公司 上海实验仪器总厂 浙江台州路桥四甲生化塑料厂 2 3 实验方法与步骤 2 3 1m c l r ，m c r r 溶液配制 m c l r ，m c r r 用甲醇配制成溶液，浓度范围为0 0 0 1 1 0m g l 。 2 3 2 薄层层析 取1 0 x 2 0c m 层析硅胶薄板在1 0 5 干燥3 0r a i n ，用定量毛细管点样4 皿。点样距底边1 c m ，点直径控制在2 - 3 m m ，点与点之间距离在1 5 2c m 。层析缸中预先倒入展开剂饱和2 0 m i n ，再将点样后的薄层板置于缸中上行饱合展开，展开剂距板前沿o 5c m 时停止。展开 温度为室温。 9 江南大学硕士学位论文 2 3 3 检测 碘蒸气显色：将薄层板置于碘缸中，使碘蒸气附着在板上显色。薄层色谱扫描： d i f f e r e n c e 扫描方式，扫描波长为2 3 8n m 4 4 1 。 2 3 4 蓝藻破壁 蓝藻取自太湖十八湾处水域。取藻浆1 0 0m l 离心沉降1 2m i n ，转速1 2 0 0 0r p m 。细胞 沉淀加1 5m l 蒸馏水，反复冻融5 次，在1 0 0 0 0r p m 下离心1 0m i n 取上清液分析m c l r ， m c r r 含量。 2 4 结果与讨论 本课题以太湖水华蓝藻为对象，富集分离其藻蓝蛋白。由于水华蓝藻会代谢生成对环 境以及人体有毒害作用的微囊藻毒素，因此在富集分离藻蓝蛋白的同时要去除微囊藻毒 素。为了检测微囊藻毒素的去除情况，必须建立简便快捷的检测方法。 2 4 1 单一溶剂展开剂层析 以单一溶剂做展开剂，碘蒸气显色，考察m c l r ，m c r r 展开比移值r ，o 结果如 表2 3 所示。 耙3 不同展开剂t m c l r ，m c r r 的足触 t a b 2 - 3t h ei n f l u e n c eo fv a r i o u sd e v e l o p i n gs o l v e n to nt h er fv a l u e so fm c - l r ，m c - r r 占( f m 。)吩 m c l rm c r r 岔介电常数 从表2 3 中可以看出，展开剂介电常数占越大，m c l r ，m c r r 的r ，值越大。从表中结 果还可以看出，m c l r 和m c r r 的尺，值接近，且样品斑点都呈长椭圆形或条带状，说明 使用单一溶剂不能分离鉴别m c l r ，m c r r 。 2 4 2 混合展开剂层析 以m c l r ，m c r r 获得较大的厨值为目标，用四氯化碳、甲醇混和溶剂作展开剂， 考察不同溶剂体积比对母值的影响，其中勘为m c l r 的比移值，勘为m c r r 的比移值， 见表2 4 。 对尺厂值和占进行线性拟合得方程勘= 0 0 0 4 1 3 + 0 0 2 4 4 e ( ，= 0 9 9 5 ，p - v a l u e = o 0 0 0 ) ， l o 第二章微囊藻毒素检测用薄层层析法研究 勋2 一o 0 3 0 6 + 0 0 2 6 0 占( ，= 0 9 8 5 ，p v a l u e - - 0 0 0 2 ) 表明母值与混和展开剂旃在很强的 线性关系。根据拟合方程预测，若使用此层析液体系达到理想的分离效果( 母值在0 5 0 9 ) ， 四氯化碳与甲醇的比例在2 0 ：8 0 到1 ：1 0 0 之间，极性相占的比例过大。 毒t 2 - 4 不同体积比的四氯化碳，甲醇作展开剂，m c - l r 和m c - l m 的母值 t a b 2 - 4e f f e c to f v a r i o u sr a t i oo f t e t r a c h l o r o m e t h a n e ，m e t h a n o lo nt h e 吩v a l u eo fm c - l 心m c r r 四氯化碳：甲醇( v v ) 矿口m 。1 ) 勘( m c l r ) 勘( m c r r ) 6 5 ：1 5 4 4 60 1 1 0 0 9 6 5 ：2 05 2 10 1 3 0 1 0 6 5 ：2 5 5 9 60 1 4 0 1 2 6 5 ：3 06 6 80 1 7 0 1 5 6 5 ：3 57 3 70 1 8 0 1 6 _ _ _ o ! o _ _ _ _ _ o o ! o _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ l l _ _ _ l o - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ l _ _ _ _ _ l _ l _ _ _ l - l - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ l - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一邝印j 句3 + c 2 6 2 3 ( e 介电常数；e 1 分别为四氯化碳和甲醇的体积比例),c2： 使用s 较大的三氯甲烷代替四氯甲烷作非极性相，考察三氯甲烷、甲醇配比不同对 m c - l r 和m c - r r 的母值影响，其中勘为m c - l r 的比移值，勘为m c - r r 的比移值，见 表2 5 。 表2 - 5 不同体积比的三氯甲烷，甲醇作展开剂，m c - l r 和m c r r 的母值 t a b 2 5e f f e c to fv a r i o u sr a t i oo ft r i c h l o r o m e t h a n e ，m e t h a n o lo nt h e 母v a l u eo fm c - l r ，m c - r r 三氯甲烷：甲醇( v v ) 矿( f m 。1 ) r f j ( m c l r ) r f e ( m c _ r r ) 6 5 ：1 57 9 70 2 3 0 2 1 6 5 ：2 0 8 7 80 4 6 0 4 4 6 5 ：2 59 5 80 6 9 0 6 5 6 5 ：3 0 1 0 3 30 8 2 0 7 8 6 5 ：3 5 1 1 0 3 1l _ _ _ _ _ _ _ _ l - i l - o ? ! ? o _ _ _ _ l _ _ - _ _ - - l l _ _ _ - _ l _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ l l - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - l l - _ - _ _ _ - _ _ l _ - _ _ _ _ _ _ _ _