（生物化学与分子生物学专业论文）用原位合成微流体芯片鉴定甘蔗microrna及其表达差异.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 摘要 m i c r o r n a ( m i r n a ) 是一类在真核生物中广泛存在的长约2 2n t 的非编码小r n a ， 它通过抑制靶标r n a 的翻译或对靶标r n a 的剪切使靶基因转录后沉默，在植物生长发 育过程中对基因表达起着重要的负调控作用。截至2 0 0 6 年，s a n g e rm i r b a s e 数据库 ( r e l e a s e7 1 ) 共报道了拟南芥等8 种高等植物的7 3 1 条m i r n a 序列，分布于6 8 个保守 的m i r n a 家族中。 甘蔗，为禾本科( g r a m i n a c e a e ) 甘蔗属( s a c c h a r u m ) 多年生高光效的c 4 植物，是 当前国际上急待开发的重要能源作物。然而，尽管植物m i r n a 的研究领域取得了突 破性进展，但甘蔗中m i r n a 的研究进展相对缓慢，仅有d e z u l i a n 等根据n c b ie s t 数据库中收录的甘蔗e s t 序列预测得到1 6 条m i r n a ，且尚未进行实验验证，因此对 甘蔗开展m i r n a 研究有着重要意义。基因芯片技术发展时间虽不过短短数年，但因 具有操作便捷、快速高效、灵敏度高、高度平行性及高通量检测等特征，近来被广泛 应用于m i r n a 的发现、鉴定及功能研究等领域。 本研究根据植物m i r n a 的保守特性，将s a n g e r 数据库中收录的拟南芥、大豆、 首蓿、水稻、毛果杨、高粱、甘蔗和玉米等8 种高等植物中的7 3 1 条前体m i r n a 序 列和1 1 5 条拟南芥m i r n a 互补序列( m i r n a * ) 进行比较，去除冗余序列后获得2 3 2 条成熟m i r n a 序列和1 0 4 条m i r n a * 序列。根据以上特异序列设计探针，并采用原 位合成技术制作植物m i r n a 微流体芯片。利用该芯片首次对我国能源植物甘蔗中表 达的成熟m i r n a 和m i r n a * 进行了检测，并进一步分析了甘蔗不同时期差异性表达 的m i r n a 。根据芯片杂交结果，在甘蔗中共检测到1 1 4 条成熟m i r n a 和3 9 条m i r n a * 序列，检出率分别为4 9 1 4 和3 3 9 1 。其中9 条成熟m i r n a 对应于d e z u l i a n 等( 2 0 0 5 ) 根据e s t 序列推测存在于甘蔗中的1 6 条前体m i r n a 中的1 5 条，在甘蔗幼苗中被检 测到；在成株中检测出7 条成熟m i r n a 对应其中1 0 条前体序列。另外1 0 5 条在其它 植物上报道的成熟m i r n a 在甘蔗中首次被发现。通过芯片杂交实验，我们获得了1 1 4 条甘蔗保守性m i r n a ，它们分属于3 2 个保守m i r n a 家族，其中，9 0 条m i r n a 在甘 蔗生长发育过程中发生了差异性表达，m i r l 6 0 、1 6 6 、1 6 9 、3 9 4 、3 9 9 、4 0 8 、4 7 6 、4 7 8 和4 8 1 等9 个家族的成熟m i r n a 在甘蔗幼苗中特异性表达；在成株中，m i r 3 1 9 和 m i r 3 9 7 家族被发现特异性表达。其余2 1 个m i r n a 家族在甘蔗幼苗和成株中均有表 达，但存在表达量的差异。同时，本研究另检测到3 9 条m i r n a * ，其中5 条m i r n a * 浙江理工大学硕士学位论文 发生了差异性表达。通过比较分析该1 1 4 条成熟m i r n a 在其它7 种物种中的检出率， 其结果显示了m i r n a 在高等植物具有高度保守性和普遍分布，这与前人的研究报道 相一致。本研究工作涉及建立植物m i r n a 芯片高通量检测方法和甘蔗m i r n a 的首次 实验报道，并为基因组信息缺乏的物种中快速发现和鉴定m i r n a 提供一种新手段。 关键词：甘蔗；m i c r o r n a ；鉴定；表达差异；微流体芯片 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t m i c r o r n a s ( m i r n a s ) h a v eb e e ni d e n t i f i e da si m p o r t a n tn e g a t i v er e g u l a t o r so fg e n e e x p r e s s i o n i nb o t hp l a n t sa n da n i m a l s 。m i r n a sa r e s i n g l e - s t r a n d e dr n a s ，2 2 n u c l e o t i d e s ( n t ) i nl e n g t h i th a sb e e nr e p o r t e dt h a tt h e r ea r et w ow a y st od o w n r e g u l a t et a r g e t m r n a s b ym i r n a s t h eo n e i st oa t t e n u a t et h et r a n s l a t i o no ft a r g e tt r a n s c r i p t i o n s ，t h eo t h e r i st or e p r e s sg e n ee x p r e s s i o np o s t t r a n s c r i p t i o n a l l yb yg u i d i n gc l e a v a g e t h et a r g e to fp l a n t m i r n a so f t e nb e l o n gt of a m i l i e so ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r si n v o l v e di nt h ec o n t r o lo f d e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e s t h es a n g e rm i r b a s ed a t a b a s e ( r e l e a s e7 1 ) h a sr e c o r d e d7 3 1 m i r n ap r e c u r s o rs e q u e n c e sa c r o s s8s p e c i e s ，s u c ha sa r a b i d o p s i st h a l i a n a ，w h i c h c o r r e s p o n dt o6 8c o n s e r v e dm i r n a f a m i l i e s s u g a r c a n e ，b e l o n g e dt os a c c h a r u m ，g r a m i n a c e a e ，i sak i n do fp e r e n n i a lc 4p a i n tw i t l l l l i 曲p h o t o s y n t h e t i ce f f i c i e n c y , a n di ti se m e r g e n tt od e v e l o pi ta si m p o r t a n te n e r g ys o u r c e s i nt h ew o r l d n o w a d a y s ，w i t ht h eh i g hs p e e dd e v e l o p m e n to ft h em i r n ar e s e a r c hi nt h e p l a n tk i n g d o m ，h o w e v e r , s t u d yo ns u g a r c a n em i r n a i sr e l a t i v e l yl a c ko f , o n l ye x i s t i n g16 m i r n a sp r e d i c t e db yd e z u l i a ne ta l ，b a s e do ni t se s ts e q u e n c e sr e c o r d e db yn c b i d a t a b a s e ，w h a t sm o r e ，m e ya r el a c ko fe x p e r i m e n t a lv e r i f i c a t i o n s ，s o ，i ts e e m st h a tc a r r y i n g o u ts t u d yo ns u g a r c a n em i r n ai si m p o r t a n t i nr e c e n ty e a r s ，s i n c eg e n ec h i pt e c h n o l o g y h a v ec o n s p i c u o u sf e a t u r e ss u c ha sc o n v e n i e n to p e r a t i o n , f a s tp r o d u c t i o n , s e n s i t i v i t y , p a r a l l e l i s ma n dh i g ht h r o u g h p u t ，a n di sa p p l i e dw i d e l yi nm a n yo fm i r n a sd i s c o v e r y , i d e n t i f i c a t i o na n df u n c t i o nr e s e a r c hf i e l d s c o m p a r i s o no f7 13m i r n ap r e c u r s o r si n8p l a n ts p e c i e sf r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n a ， g l y c i n em a x , m e d i c a g ot r u n c a t u l a ，o f y z as a t i v a ，p o p u l u st r i c h o c a r p a ，s o r g h u mb i c o l o r , s a c c h a r u mo f f i c i n a r u ma n dz e am a y s ，a n d115m i r n a 宰f r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n a r e p o r t e db ys a n g e rd a t a b a s eb a s e do np l a n tm i r n ac o n s e r v a t i o n , t h e nr e m o v et h e r e d u n d a n ts e q u e n c e s ，s h o w i n gt h e mc o r r e s p o n d i n gt o2 31m a t u r es e q u e n c e sa n d10 4 m i r n a 木s e q u e n c e s t h e r e f o r e ，w eh a v ed e s i g n e du n i q u ep r o b e s ，d e v e l o p e dam i c r o f l u i d i c m i c r o a r r a yi ns i t us y n t h e s i st h a ts u i tf o rd e t e c t i o no fp l a n tm i r n a s a n du s e di tt op e r f o r m t h ef i r s te x p e r i m e n ta n a l y s i so fs a c c h a r u mo f f i c i n a r u mm a t u r em i r n a sa n dm i r n a 拳， m e a n w h i l e ，a n a l y z ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o np r o f i l e so fm i r n af r o md i f f e r e n tg r o w t hp e r i o d m i r n ae x p r e s s i o np r o f i l er e v e a l st h a tt i s s u ei nw h i c h11 4m a t u r em i r n a sa n d3 9 m i r n a 掌e x p r e s s e d 。d e t e c t i o n r a t ea r e4 9 1 4 a n d3 3 9 1 s e p a r a t e l y o ft h e c o r r e s p o n d i n g114p r o b e sd e t e c t e d , 9p r o b e sc o r r e s p o n d i n gt o15s a c c h a r u mo f f i c i n a r u m 浙江理工大学硕士学位论文 m i r n a p r e c u r s o r si n c l u d e db y16m i r n ap r e c u r s o r sp r e d i c t e db yd e z u l i a nb a s e do ne s t s e q u e n c e ，a r ed e t e c t e di ns u g a r c a n es e e d l i n g ，7p r o b e sc o r r e s p o n d i n gt o1 0s a c c h a r u m o f f i c i n a r u mm i r n ap r e c u r s o r sa r ed e t e c t e di n f i e l ds u g a r c a n e ，t h e10 5n o v e lm a t u r e m i r n a sa r e i d e n t i f i e d 114s u g a r c a n er n i r n a sb e l o n 西n gt o3 2c o n s e r v e dp l a n tf a m i l i e s w e r ei d e n t i f i e d ，a m o n g s t ，9 0m i r n aw e r ed i f f e r e n t l ye x p r e s s e da tt h ed i f f e r e n ts t a g e so ft h e s u g a r c a n ed e v e l o p m e n t ，9s p e c i f i cf a m i l i e si n c l u d i n gm i r l 6 0 ，1 6 6 ，1 6 9 ，3 9 4 ，3 9 9 ，4 0 8 ，4 7 6 ，4 7 8 a n d4 81a r ed e t e c t e di ns u g a r c a n es e e d l i n g ，9s p e c i f i cf a m i l i e s ，m i r 319a n dm i r 3 9 7a r e d e t e c t e di nf i e l ds u g a r c a n e 。t h er e s t21c o n s e r v e df a m i l i e sd i f f e r e n t l ye x p r e s s e d ，a tt h es a m e t i m e ，5m i r n a e x p r e s s e dd i f f e r e n t l y c o m p a r i s o no ft h ed e t e c t i o nr a t i oo f11 4s u g a r c a n e s m a t u r em i r n a si nt h eo t h e rs e v e np l a n ts p e c i e s ，t h er e s u l t ss h o wt h a tm i r n ah a v eh i l g h c o n s e r v a t i o na n dd i v e r g e n c ei np l a n t s ，w h i c ha r ec o n s i s t e n tw i t hp r e v i o u s l yr e p o r t s t h e s t u d i e si n v o l v ei ne s t a b l i s h m e n to fh i g ht h r o u g h p u td e t e c t i o nm e t h o d si np l a n tm i k n a m i c r o a r r a y ，a n da r et h ef i r s te x p e r i m e n t a lr e p o t s ，a tt h es a m et i m e ，i tp r o v i d e san e w p a t h w a yt of a s td i s c o v e ro rv e i l f ym i r n a i ns p e c i e sl a c ko fg e n o m ei n f o r m a t i o n k e y w o r d s ：s u g a r c a n e ；m i r n a ；i d e n t i f i c a t i o n ；d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n ；m i c r o f l u i d i cm i c r o a r r a y 浙江理工大学硕士学位论文 t u r n a 嗽 n c r n a r r n a r t p c r c d n a p c r n t b p d e p c 信使r n a 转运r n a 略语表 m e s s a g er n a t r a n s f e rr n a 非编码r n an o n c o d i n gr n a 核糖体r n a r i b o s o m a lr n a 逆转录一聚合酶链式反应 r e v e r s e 劬n s c r i p t i o n - p o l y m e m s ec h a i nr e a c t i o n 互补d n ac o m p l e m e n t a r yd n a 聚合酶链式反应p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n 碱基 n u c l e i o t i d e 碱基对 焦炭酸二乙酯 d e p c - h 2 0d e p c 处理水 e s t r i s c d d h 2 0 表达序列标签 r n a 诱导沉默复合体 双蒸水 b a s ep a i r d i e t h y p y r o c a r b o n a t e d i s t i l l e dw a t e rt r e a t e dw i t hd e p c e x p r e s s i o ns e q u e n c et a g r n a - i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人 在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内 容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。 论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本 人承担。 靴敝储繇亏翰 日期：五粥年3 月m ) l t 浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权 浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 学位论文作者签名： 保密口，在年解密后适用本版权书。 不保密口。 亏呜屿 日期：埘年3 月瑚 指导教师签咄 ? 节 日期：臃3 月群日 浙江理工大学硕士学位论文 1 1 基因芯片 第一章文献综述 基因芯片( g e n e c h i p ) 又称d n a 芯片( d n ac h i p ) 、d n a 微阵列( d n a m i c r o a r r a y ) ，是2 0 世纪9 0 年代发展起来的一项前沿生物技术。基因芯片技术于 1 9 9 1 年首次在s c i e n c e 杂志上被提出【l 】，是生物芯片的一种，指采用原位光导合 成或合成后微点样等方法，将大量的d n a 片段如基因、p c r 产物、人工合成的寡 核苷酸等有序地固定在载体表面上，形成储存有大量序列信息的d n a 微阵列。基 于核酸互补杂交的原理，通过检测样品与芯片杂交信号从而快速、准确、大规模 地获取样品核酸序列信息，以对其基因表达量及特性进行分析【2 1 。随着人类基因 组计划的逐步实施和分子生物学的飞速发展而产生，是当今世界高度交叉、高度 综合的前沿科学与研究热点。基因芯片因其具有高密度、高灵敏度、快速( 实时) 检测、经济、自动化和高度平行性等特点【3 】，而广泛应用于不同的研究领域。基 因芯片一出现即引起科研学术界的广泛关注，并日益成为遗传作图、d n a 测序、 基因表达、突变检测、基因诊断等基因分析最重要的技术平台【4 5 1 。 1 1 1 基因芯片的工作原理和技术流程 基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法相一致，利用已知核酸序列 作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分 析。基因芯片在一微小的基片( 玻璃片、硅片等) 表面集成了大量的分子识别探 针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大规模信息量的筛选与检测分 析【6 1 。基因芯片主要技术流程包括：芯片的设计与制备、靶基因的标记、芯片杂 交与杂交信号检测。 1 1 2 基因芯片的制备方法 芯片制备方法主要包括两种类型【7 】：( 1 ) 点样法：首先是探针库的制备，根据 实验目的从相关的基因数据库中选取特异的序列进行p c r 扩增或人工合成寡核 苷酸序列，然后通过计算机控制的三维坐标工作平台在玻璃及其它固相片基表面 将探针溶液逐滴点样，通过特殊的物理和化学方法使之固定，该方法技术灵活， 适用于制备点阵规模适中的基因芯片。( 2 ) 原位合成法：是指直接在玻璃等硬质 表面合成寡核苷酸序列探针，该技术关键之处在于高空间分辨率的模板定位技术 和高合成产率的d n a 化学合成技术，目前应用的主要有去光保护合成法，压电 浙江理工大学硕士学位论文 打印合成法等，适合制作大规模、高密度的基因芯片【8 】。 1 1 3 基因芯片的分类 根据功能基因芯片可分为基因表达谱芯片和d n a 测序芯片两类1 9 】：基因表 达谱芯片可以将克隆的成千上万个基因特异的探针或其c d n a 片段固定在一块 d n a 芯片上，对来源于不同的个体、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、 生理病理、刺激条件下的细胞内基因表达情况进行检测分析，从而对这些基因的 个体特异性、组织特异性、发育特异性、分化特异性、病变特异性、刺激特异性 的变化特征和规律进行描述，极大地加快这些基因功能的确定【1 0 1 1 】；测序芯片是 最早出现的生物芯片，基于杂交测序技术与待测样品进行杂交，根据杂交结果推 测出d n a 序列的全长。 根据所用探针的类型不同，基因芯片可分为c d n a 微阵列芯片和寡核苷酸芯 片两大类。根据应用领域不同可将制备的基因芯片称为各种专用型芯片，如毒理 学芯片、病毒检测芯片、诊断芯片、测序芯片等【1 2 】。 i i 4 基因芯片的应用 基因芯片技术伴随人类组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ，h g p ) 的顺利实施 应用而生，尽管发展时间不过短短数年，但因具有操作便捷、快速高效、灵敏度 高、高度平行性及高通量检测等特征，克服了传统方法技术复杂、自动化程度低、 检测分子数少等不足之处，得以蓬勃迅速发展，目前已经广泛应用于大规模d n a 测序、基因表达谱分析、肿瘤诊断、基因突变分析、环境微生物研究等f 1 3 ，1 4 1 诸多 领域：芯片技术中杂交测序技术( s e q u e n c i n gb yh y b r i d i z a t i o n , s b h ) 是一种新的 高效快速测序方法，通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行序列测定进而重组 出靶核酸的序列；f a v i s 等1 5 】用寡核苷酸芯片结合多重p c r 和连接酶检测反应 ( 1 i g a s ed e t e c t i o nr e a c t i o n , l d r ) ，能有效区分小片段的插入或缺失引起的基因突 变；s v a r e n 等【1 6 1 用寡核苷酸芯片研究了e g r l 基因反式作用因子在前列腺中的调 控作用，鉴定出几种与神经内分泌相关的基因；m a y a n i l t l 7 1 等利用基因芯片技术 发现了p a x 3 基因的下游靶标，研究显示在一些有显著变化的基因的启动子中含 有成对的与p a x 3 类似的同源结构域；n a s e d k i n a 等设计了寡核苷酸微阵列， 结合复合r t - p c r 准确快速地检测出了一些重要白血病；a f f y m e t r i x 公司已将彤3 基因的全长序列和已知突变的序列制成探针集成在芯片上，可对与p 5 3 基因突 2 浙江理工大学硕士学位论文 变相关的癌症进行早期诊断；w e n 等【1 9 l 利用基因芯片技术鉴定1 0 8 例卵巢癌肿 瘤样本中的筇3 基因突变，结果得到d n a 测序分析的证实，检测准确率高达9 4 ，表明基因芯片是一种相当有效的突变检测手段；c o l l e r 等【2 0 】采用标有6 1 4 6 个基因和表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) 的寡核苷酸微阵列技术， 发现了与细胞生长、细胞周期、信号传导和细胞黏附等作用的调节有关的基因； c h i z h i k o v 等 2 1 】利用芯片技术能够迅速而可靠地检测所有轮状病毒分离毒株，并 能鉴别其亚基因组，优于传统的r t - p c r 方法。t a r o n c h e r - o l d e n g u r g 等【2 2 】成功应 用7 0 m e r 的寡核苷酸芯片监测并量化环境氮循环中的功能基因多样性。 基因芯片技术的发展势头十分迅猛，在生命科学的各个领域得到广泛地应 用，但其存在的缺陷也是相当明显的。首先是成本的问题，其次在芯片实验技术 上还有多个环节尚待提高，如在探针合成方面，如何进一步提高合成效率及芯片 的集成程度是研究的焦点。而样品制备的简单化与标准化则芯片应用进一步普及 的前提。虽然芯片技术还存在这样或那样的问题，但其在基因表达谱分析、基因 诊断、药物筛选及序列分析等诸多领域已呈现出广阔的应用前景，随着研究的不 断深入和技术的更加完善基因芯片一定会在生命科学研究领域发挥越来越重要 的作用，可以预见，基因芯片将为我们展示一个革命性的前景。 1 2m i c r o r n a 相关研究 m i c r o r n a ( m i r n a ) 是一类在真核生物中广泛存在的大小约2 2m 的非编码 小分子单链r n a ，它可以通过对靶标r n a 的剪切或抑制靶标r n a 的翻译从而 对靶标基因的表达进行调控 2 3 , 2 4 】。早在1 9 9 3 年，l e e 掣2 5 】首先在线虫中发现l i n 4 基因的转录产物中有一个长度为2 2n t 的小分子非编码r n a ，在幼虫的l 1 后期 表达，通过碱基互补配对的方式与1 i 1 1 1 4 的m r n a3 末端非翻译区( u n t r a n s l a t i o n a l r e g i o n ，u t r ) 相结合，从而抑制l i n - 1 4 的表达，使线虫由l 1 期向l 2 期转化。 2 0 0 0 年，另一促进幼虫向成虫转变的基因l e t 7 也被发现【2 6 1 ，其转录产物为具有 类似调节功能、长度为2 1m 的小分子r n a 。由于其具有时序调节功能，起初把 这类小分子r n a 命名为小时序r n a t 2 7 1 ( s m a l lt e m p o r a lr n a , s t r n a ) 。随后， m i r n a 在生物界存在的普遍性和重要性逐渐为人们所认识。2 0 0 2 年，m i r n a 的 发现被美国科学杂志评为年度十大科技突破第一名。截至目前，在m i r n a 数据库( r e l e a s e1 0 1 ) s a n g e rm i r b a s e 2 8 ，2 9 1 ( h t t p ：m i c r o r n a s a n g e r a c u k 浙 i ：珲l 人学硕十学什论文 s e q u e n c e s i n d e xs h t m l ) 中j _ j ：册的m i r n a 已达5 3 9 5 余种以上m i r n a 主要是根 据m i r n a 结构特征通过生物信息学方法进行预测或用，e 物化学方法直接克隆得 到。m i r n a 分布广泛，存包括线虫、果蝇、家鼠、人体以及拟南芥等生物中普 遍存在l3 0 3 5 。研究发现，m i r n a 在调节基因表达、调控生物体正常发育等生理 过程中扮演着重要角色o “j 。 1 2 1m i r n a 的生物合成 m i r n a 作为一种新近发现的小分子调控r n a ，其在生物体内起着十分重要 的调控作用。动物m i r n a 的生物合成过程已初步得到诠释1 3 7 - 3 9 i 。首先，m i r n a 基因的转录初产物( p r i m i r n a ) 在细胞核中被r n a s ed r o s h a 切割成为m i r n a 前体( p r e m i r n a ) ，然后在转运蛋白e x p o r t i n - 5 的作用下由细胞核内转运王胞质 中【删，经另一种r n a s ei i id i c e r 议别进一步剪切成m i r n a ：m i r n a * t 叉体，接着 在解旋酶( h e l i c a s e ) 的作用f 加工成成熟的译链m i r n a 。这些成熟的m i r n a 与其他蛋白质一起组装成r i s c ( r n a - i n d u c e ds i l e n c i n g c o m p l e x ) 复合体“”，通 过与靶m r n a 特异性的碱基配对引起靶m r n a 的降解或者抑制其翻译从而对 摹罔进行转求后水平调控( 网i1 ) 。 r 1 ) 一j ：# i a t l 一- i o r e r a 围l _ 1 动物中m i r n a 的形成途径 f i g u r ei ia n i m a l sm i r n am a t u r a t i o np a t h w a y 植物m i r n a 的成熟过程与动物有所不同，因为植物中没有d r o s h a 的同源类 浙i j = 理l ：入学硕t 学忙论文 似物m i r n a 的转录初产物在核内由d c l i ( d i c e r - l i k ep r o t e i n ) 切割成 p r e m i r n a ，p r e m i r n a 很不稳定，在核内直接在d c l i 的作用f 进步切割， 形成m i r n a ：m i r n a 。般体t 经h e n l 甲基转移酶对m i r n a ：m i r n a 双体3 1 端的尿嘧啶进行甲基化，然后由h a s t y ( e x p o r t i n 5 的同源蛋白) 负责转运出 细胞核，同样在解旋酶的作片i 下加工成成熟的m i r n a ，通过与靶m r n a 不h 程 度的序列互补进而对靶基因的表达进行负调控心4 ”( 图l2 ) 。 “r # 。1 cu n d t 【t 。# 1 1 ) n 。j l 。”。” 卫d 栅：3 、i 蛐t ! 乜砸哑 ) 气 卜“ l nh i 、( 皿十“￥l u _ p c r i d e g r a d a t i o nf t l a t i o n f a r g e trn 图1 2 植物中m i r n a 的形成途径 f i g u 阡1 2p l a n t s m i r a s ；a m a t u r a t i o np a t h w a y 1 2 2m i r n a 的特征及作用机制 目前已发现的m i r n ak 度分布在2 2n t 是一个基本特征。m i r n a 的另一 重要牛 征是具有能形成莘珂，结构的前体【4 ”。在动物中，前体的长度一般在6 0 8 0n t ，而在植物中前体的长度变化较大，可以从几十到数百n t 【“】。m i r n a 基因 咀单拷p l 、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组巾，且主要分布于基因间隔 区( i n t e r g e n i cr e g i o n ，i g r ) 。绝大多数m i r n a 从前体的条侧臂上力工而来， 浙江理工大学硕士学位论文 是m i r n a 的又一特征，只有极少数是从前体的两条侧臂上同时产生m i r n a 。 m i r n a 的表达具有时间和组织特异性，如线虫的l n 4 【2 5 1 在时序上的表达量就表 现出较为明显的差异。在植物拟南芥中，m i r l 5 7 在幼苗中高表达，m i r l 7 1 则在 花组织中高表达【4 2 1 。m i r n a 存在保守特性，部分m i r n a 家族不仅在被子植物 中存在，也在蕨类、苔类和裸子植物中找到其同源序列【4 6 1 。在已知的鼠和人类的 m i r n a 中有5 3 与f u g ur u b r i p e s ( p u f f e r f i s h ) 或d a n i or e r i o ( z e b r a f i s h ) 同源【4 7 】。 m i r n a 种类的普遍性、表达方式的多样性及进化上的保守性预示它在生物界中 具有广泛的功能。 m i r n a 与目的基因的作用方式主要有两种：其一，成熟的m i r n a 与目的基 因的m r n a 序列的3 u t r 互补配对，抑制其翻译进而调控目的基因的表达【4 8 】； 其二，m i r n a 与目的m r n a 某段序列配对后引起目的片段特异性断裂，进而导 致基因沉默【4 9 1 。m i r n a 的作用方式和m i r n a 与目的基因的配对程度有关。 m i r n a 与目的基因某段序列完全配对时，就可能引起目的片段在互补区断裂而 导致基因沉默，反之，m i r n a 就以抑制目的基因表达方式作用。研究发现，多 数动物m i r n a 与靶m r n a 不完全配对以抑制其翻犁5 们，而植物的m i r n a 通常 采取与靶m r n a 完全配对的作用方式从而导致m r n a 的降解【5 1 1 。 1 2 3m i r n a 在植物中的功能 m i r n a 可通过与靶基因转录的m r n a 互补配对来调节靶基因的表达【州。目 前，许多m i r n a 的功能还尚待深入研究，但从已知的m i r n a 来看，其作用主 要为调节动植物的生长发育。如线虫的l i n - 4 和l e t 7 是线虫幼虫发育过程中主要 的调节因子。在植物中已发现m i r n a 参与了植物器官的形态建成、分生组织特 征维持、叶片极性建立和形态发育、花器官特征决定、信号转导等多种发育过程 5 2 , 5 3 1 。关于m i r n a 对植物生长发育作用的研究可以从m i r n a 的形成和m i r n a 所调控的目的基因这两方面入手。在植物中，m i r n a 的形成借助于一种称为 d c l l 的r n a 核酸酶。研究发现，d c l l 的突变体会引起拟南芥分生组织的过度 增殖、花期的推迟、胚芽囊胚细胞的过度增殖等生理缺陷，同时m i r n a 水平下 调明显，m i r n a 作用的靶基因呈现出异常表达【5 4 1 。另一方面，植物中的m i r n a 靶标基因大多是编码控制植物发育阶段的转录因子，这些转录因子与细胞的分 裂、器官的分离、器官的极性、分生组织的特性相关【5 4 , 5 5 】。第一个被实验证明作 6 浙江理工大学硕士学位论文 为m i r l 7 1 靶标的s c a r e - l i k e 家族基因就是一类植物特异转录因子，含有3 个成 员即s c l 6 i i 、s c l 6 i i i 和s c l 6 【4 2 ，5 6 1 ，该家族蛋白成员控制多个发育过程， 包括根的放射状生长【5 7 1 和信号转导【5 8 】等。随后发现，拟南芥中控制叶片形态发 育的t c p s 转录因子受到基因组中 j a w 座编码的m i r n a 调控j 高表达m i r j a w 造成叶片弯曲并呈锯齿状【5 3 】。m i r l 7 2 的靶标a p 2 基因控制花的发育，过量表达 m i r l 7 2 造成类似a p 2 缺失突变的花型，如心皮螺旋状卷i 擅 5 1 , 5 9 1 等。以上研究表 明了m i r n a 在植物生长发育过程中扮演着重要角色。 m i r n a 的发现为功能基因和复杂的基因调控网络的研究提供了新的契机。 虽然m i r n a 的研究已经取得了很大的进展，但毫无疑问的是这只是冰山一角， 仍然存在大量未知序列及其生理功能、作用形式有待去探索。 1 3 甘蔗研究 甘蔗，又名薯蔗、糖蔗等，为禾本科( g r a m i n a c e a e ) 甘蔗属( s a c c h a r u m ) 多 年生高光效的c 4 植物，原产于热带、亚热带地区，是我国制糖的主要原料。我 国甘蔗栽培历史悠久，早在公元前四世纪就有种植甘蔗的历史记载，许多研究表 明，中国是甘蔗的起源中心之一。甘蔗味甘，性寒，具有清热解毒、生津止渴、 和胃止呕、滋阴润燥、止咳化痰等功效。现代医学研究表明，甘蔗中富含多种对 人体新陈代谢有益的维生素、氨基酸及微量元素等营养成分。 1 3 1 甘蔗的分布特征及经济价值 目前，甘蔗的分布主要在北纬3 3 0 至南纬3 0 0 之间。我国的主产蔗区分布在 北纬2 4 0 以南的热带、亚热带地区，包括广东、台湾、广西、福建、四川、云南、 江西、贵州、湖南、浙江、湖北等1 1 个省、自治区，近2 0 年来迅速向广西、云 南等西部地区转移，甘蔗已经成为西南山区脱贫致富的重要经济作物。此外，甘 蔗具有广泛的综合利用价值，目前常用的酒精生产原料可以分为两类，即淀粉质 原料和糖质、纤维质原料，前者如玉米、木薯等粮食作物，后者包括废糖蜜、甘 蔗及蔗渣等。甘蔗光合强度大，生物产量高，是目前国际上作为生物能源开发的 重要能源作物。 1 3 2 甘蔗的基础研究现状 当前，巴西对甘蔗全基因组测序工作正在进行中，其中，很多重要细胞信号、 产糖途径关键酶的基因和叶绿体全基因组已经报道。国内对甘蔗的基础研究主要 7 浙江理工大学硕士学位论文 侧重于筛选近缘植物与甘蔗杂交提高种质、分子标记确定重要功能基因、基因枪 转基因方法辅助育种等，还未深入到甘蔗功能基因组和发育分子生物学水平。 1 3 3 甘蔗m i r n a 的研究进展 近年来对植物m i r n a 的研究已经取得了突破性进展，有大量的m i r n a 序 列得以报道。根据s a n g e rm i r b a s e 数据库( r e l e a s e1 0 1 ) 资料显示，到2 0 0 7 年 1 2 月为止已经在水稻( o r y z as a t i v a ) 、玉米( z e am a y s ) 、高粱( s o r g h u mb i c o l o r ) 、甘 蔗( s a c c h a r u mo f f i c i n a r u m ) y ( 1 l t j , 麦( t r i t i c u ma e s t i v u m ) 等5 种禾本科重要作物中 报道r r f i r n a 共计4 5 9 条，其中，甘蔗中报道的m i r n a 共1 6 条，由d e z u l i a n 等 人【钢根据n c b ie s t 数据库中收录的甘蔗e s t 序列预测得到，但尚未进行实验 验证。 8 浙江理工大学硕士学位论文 第二章基因技术在m i r n a 研究中的应用 2 1