（分析化学专业论文）毛细管电泳激光诱导荧光检测方法及应用研究.pdf

摘要 摘要 毛细管电泳( c e ) 是高效、快速、样品和试剂消耗少的一种分离技术，存 在的主要缺点之一就是检测灵敏度低，提高检测灵敏度是目前c e 研究的热点之 一。激光诱导荧光( l i f ) 检测是c e 最灵敏的检测方法之一，不仅可以提高检 测灵敏度，还可改善选择性，极大地拓展了c e 的应用，特别在生物样品方面具 有广阔的应用前景。柱前衍生检测需要额外的操作步骤，并且要求衍生产物具有 一定的稳定性，对具有多重标记位点的分析物会出现多重峰。对此，柱后衍生 l i f 检测此时是更好的选择，而且特别适合于高速在线衍生检测。另一方面，c e 的检测灵敏度受限于毛细管较短的检测光程，而且毛细管管壁也容易产生散射 光，增加背景噪音。无窗检测池可以增加检测光程降低背景噪音，提高信噪比。 本论文综述了c e 灵敏的检测方法和技术，c e l i f 检测原理、仪器结构， 荧光衍生方法和柱后衍生反应器。本论文的主要研究内容包括组装了简便的c e l i f 检测系统，发展了一种简单易于制作的c e l i f 柱后反应器，并应用于牛 奶和动物样品中卡那霉素类抗生素残留的分析检测，另外还提出c e 无窗式检测 的新方法。论文的主要内容和研究成果具体如下： l 、组装了一台毛细管电泳激光诱导荧光检测系统。采用共线型光学结构组 装激光诱导荧光检测系统，利用核黄素作为分析样品，对影响系统检测性能的光 学器件如光阑孔径、光电倍增管的工作电压条件进行了优化，并讨论了进一步提 高检测灵敏度的措施。核黄素的浓度检出限达到9 0 1 0 习m o l l ( 3 4 1 0 。6g l ) ， 质量检出限为1 8a m o l ，在3 o 1 0 一一1 o 1 0 巧m o l l 浓度范围内成呈良好的线性 关系，方法的相对标准偏差( r s d ) 为2 4 。 2 、研制了一种毛细管电泳激光诱导荧光检测的共轴一间隙柱后反应器。采 用毛细管聚酰亚胺涂层套对接和准直分离和反应毛细管，衍生试剂从涂层套和分 离毛细管之间的环隙，以及两根毛细管之间的间隙引入反应管中，实现高效分离 和快速衍生反应。设计了衍生反应池的加压及冲洗装置，从而解决了柱后衍生反 应通道堵塞的问题。氨基酸的检出限为8 l o 一1 o 1 0 。6m o l l ，在两个多数量 级浓度范围内呈线性关系，其中甘氨酸线性范围为5 1 0 1 l l o 4m o 儿，分 离效率i 3 5 1 0 5 1 6 7 1 0 5 理论塔板数，并成功地应用于香醋样品中的游离氨 基酸的测定。该反应器结构简单，易于制作，无需显微操作，可以采用短的反应 距离适用于快速和产物易分解的衍生反应。在毛细管电泳分析中，毛细管的准直 耦合以及在柱试剂引入方面将会具有广泛的应用前景。 3 、提出毛细管电泳柱后衍生激光诱导荧光测定卡那霉素类抗生素方法。利 摘要 用共轴一间隙柱后反应器，以酸性乙酸钠盐缓冲液，在反向电渗流和负高压下分 离卡那霉素类抗生素，再与碱性硼酸钠盐缓冲液中的衍生试剂柱后衍生反应，用 激光诱导荧光检测。该柱后反应衍生方法避免了分离缓冲液和衍生缓冲液两种不 同缓冲体系的相互干扰，提高了分离度和检测灵敏度。氨基糖苷的检出限为3 6 1 0 6 5 2 1 0 弓g l ，线性范围为1 1x1 0 4 5 o 1 0 之g l 。该法用于牛奶和动物 组织中的卡那霉素类抗生素残留的测定，回收率为8 1 6 9 5 3 ( n = 4 ) 。 4 、提出一种毛细管电泳激光诱导荧光无窗式检测方法。利用聚酰亚胺涂层 套准直两段毛细管制作了无窗检测池，利用显微成像监测检测池间隙距离和电泳 分离电压对无窗检测池外形的影响，考察了分离电压对荧光检测信号的影响，理 论分析和实验验证了无窗检测的可行性。在优化的实验条件下，比较了无窗式检 测和在柱检测的性能，结果表明采用无窗检测池，荧光信号增强，背景噪音减小， 检出限降低，其中核黄素的检测灵敏度甚至提高了1 5 倍。线性范围达到两个数 量级以上，其中r f 的线性范围为5 0 l o 9 1 ox 1 0 巧m o l l ，无窗检测分离效率 为1 o 1 0 5 2 4 1 0 5 理论塔板数，r s d ( n - 5 ) 在3 7 5 8 范围。用无窗式检 测方法成功测定了实际样品菠菜和莴苣叶中三种黄素类化合物的含量。鉴于无窗 检测池易于制作，没有在柱检测管壁出现吸附污染的缺点，该检测模式扩大了毛 细管电泳分析的应用范围。 关键词：毛细管电泳；激光诱导荧光；柱后衍生；柱后反应器；氨基糖苷类抗 生素；无窗式检测 v a b s t r a c t a b s t r a c t c a p i i j a 巧e j e c t r o p h o f e s j s ( c e ) j sap o w e r f u ls e p a r a t i o nt e c h n j q u ew i t hf a s t s e p a r a t i o ns p e e d ，h i g hs e p a r a t i o ne f 玎c i e n c ya n dl o ws a m p i ec o n s u m p t i o n f o ri t s s h o r t o p t i c a lp a t h a n ds m a l l s a m p l ev o i u m e ， t h ed e t e c t i o n s e n s i t i v i t y o f u l t f a v i o l e t - v i s i b l e ( u v v i s )s p e c t r 。p h o t o m e t r y i sn o ts a t i s f i e d l a s e r - i n d u c e d n u o r e s c e n c e ( l i f ) i so n eo ft h em o s ts e n s i t i v em e t h o d st ob eu s e di nc ed e t e c t i o n i t c a nb o t he n h a n c et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i 妙a n di m p r o v et h es e i e c t i v i t y s o ，i te x t e n d s t h ea p p l i c a t i o no fc e ，e s p e c i a l l yf o rb i o l o g i c a la n dm e d i c a ls 锄p l e s p r e c o l u m n d e r i v a t j z a t i o nn e e d sa d d i t i o n a lm a n i p u i a t i o n sa n ds t a b j ed e r i v a t i v e s m o r o v e r ，i n p r e - c o l u m nd e r i v a t i z a t i o no fl i f ，a na n a l ) ，t em o l e c u l ew i t hm o r et h a no n el a b e l e ds b n l a yr e s u 】ti nm u l t i p l es e p a r a t j o np e a k s h o w e v e r ，t h ep r o b l e mo fm u m p l ep e a k sc 肋 b ea v o i d e dw i t hp o s t c o l u m nd e r i v a t i z a t i o nm e t h o d ，b e c a u s et h es e p a r a t i o ni sb a s e d o nt h en a t i v ea n a l y t e s t h ep o s t c o l u m nl i fm e t h o di sa l s os u i t a b l ef o rh i g hs p e e d o n l i n ed e r i v a t i z a t i o nd e t e c t i o n o nt h eo t h e rh a n d ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i 锣s u f r c r s f 而mt h es h o r to p t i c a ld e t e c t i o np a t h ，a n dt h es nr a t i od e c r e a s e sw i t ht h el i 曲t s c a 戗e r i n ga n db a c k g r o u n de m i s s i o n 行o mt h ew a l l o fac o n v e n t i o n a lo n c o l u m n o p t i c a ld e t e c t i o nc e l l aw i n d o w l e s sf l u o r e s c e n c ec e l lc a nr e s o l v et h ep r o b l e m so f s c a t t e r i n ga n db a c k g r o u n de m i s s i o nf - r o mt h ec o n v e n t i o n a ic e nw a l l s ，a n de x p a n dt h e o p t i c a lp a t hl e n 垂h t h ea u t h e rr e v i e w st h es e n s i t i v ed e t e c t i o nm e t h o d so fc e n u o r e s c e n c ed e t e c t i o n p r i n c i p l e ，i n s t r u m e n t a l 鼬m c t u r e ，d e r i v a t i z a t i o nd e t e c t i o nm e t h o d sa n dp o s t c o l u 瑚 d e r i v a t i z a t i o nr e a c t o r so fc e l i f t h em a i nt a s k so ft h et h e s i sa r et oa s s e m b l ea s i m p j ec e l i fs y s t e m ，t od e v e l o pas i m p l ea n dc o n v e n i e n tp o s t - c o l u m nr e a c t o rf o r c e l i f ，w h i c hc a nb ea p p l i e dt oa n a l y z et h ek a n a m y c i nr e s i d u e si nf o o d s t u 瓯s u c h a sm i i ka n da n i m a l t i s s u e i na d d i t i o n ，aw i n d o w i e s sf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nm e t h o di s a l s op r o p o s e d t h er e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u i t so ft h et h e s i sa r ea sf o i l o w s ： 1 as i m p i ec e l i fs y s t e mw a sa s s e m b l e d t h ed e t e c t i o ns y s t e mw a sb a s e do n t h ec o l l i n e a ro rc o n f o c a lo p t i cc o n g u r a t i 。n8 r f a n g e m e n t t h ee x p e f i m e n t sw e r e 0 p t i m i z e db ym ee f 诧c t so fd i a p h r a g ma n dp m tv a l t a 喀eo nd e t e c t i o np e f f o 咖a n c e t h ed i s c u s s i o nw a sm a d ea b o u tt km e t h o do fi m p r o v et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i 够t h e c o n c e n t r a t i o nd e t e c t i o nl i m i t ( c l o d ) a n dm a s sd e t e c t i o nl i m i t ( m l o d ) o ft h e r i b o f l a v i na n dw a s9 o 1 0 。9m o 儿( 3 4 l o 西g l ) a n d1 8 锄o l ，r e s p e c t i v e l y t 1 1 e a b s t r a c t l i l l 韶rc a l i b r a t i o nr a n g e 、a s3 o 1 0 一1 oxl o 。5m o l 几n er c i a t i v es t a n d a r d d e v i a t b s ( r s d ) o f t h em e t h o dw a s2 4 ( n = 5 ) 2 ap o s t c o i u m nr e a c t o rw i t hc o a ) 【i a l 唱a pm o d ew a sd e v e l o p e df o rl i fi nc e t h er e a c t o rc o u l db ea l s s e m b i e d s i m p l y a n d c o n v e n i e n t i y w i t h o u t a n y m i c r o m a n i p u l a t i o n ，i nw h i c hat h i np o l y i m i d 专s l e e v eo flo - m ml e n g t l lo b t a i n e df r o m t h cc a p i l l a 巧c o a t i n gw a su s e dt 0a l i g na 1 1 dc o n n e c tt h es e p a r a t i o na n dr c a c t i o n c a p i l l a 黟w i t ha10 - 2 0p mg a p n a p h t h a l e n e 一2 ，3 一d i c a r b o x a l d e h y d eo d a ) 锄d 2 一m e r c a p t o e t h a n o i ( 2 一m e ) w e r eu s e da sd e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t sa n dd e l i v e r e di n t ot i l e r e a c t i o nc a p i l l a 巧t h r o u g ht h ea n n u l u sb e 铆e e nt h es c p a r a t i o nc a p i l l a 叮a n dp o l y i m i d e s l e e v ea n dt h eg a po f 铆oc a p i l l a r i e sb yg r a v i 够ar e a c t i o nd i s t a n c ef b mt h eg 印t 0 d e t e c t i o np o i n tc o u l db es h o r t e n e dt 05m m f o r l ep o s t - c o l u m nr e a c t o ro fc b l i f ， s e v e r a ic o n g u r a t i o np a r a m e t e r sw e r e9 p t i m i z e d ，i n c l u d i n gl i q u i dl e v e ld i f f e r e n c e b e 俩e e nt h ed e r i v a t i z a t i o ns o l u t i o na n do u t l e tb u 任b r a r u l u l a rd i m e n s i o nb e t w e e nt 1 1 e e t c h e ds e p a r a t i o nc a p i l l a 拶a n dp o l y i m i d es l e e v e ，a n dr e a c t i o nd i s 伽c ee t c f o r 锄i n o a c i d s ，t h ed e t e c t i o nl i m i t s 豫n g e d 舶m8 o l o 8t 01 o l o 西m o l la n dl i n e a r c a l i b r a t i o nr a n g e sw e r em o r e 也a n 铋oo r d e r so f m a g n i t u d e ，e g 5 1 0 - 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i n d u c e d f l u o r e s c e n c e d e t e c t i o n ； p o s t c o i u m nd e r i v a t i z a t i o n ；p o s t c o l u m n r e a c t o r ；锄i n o g i y c o s i d ea n t i b i o t i c s ； w i n d o w l e s sd e t e c t i o n 缩写 a c e a g b g s c c d c e c e c c g e c 、f c i t p c l c l i a c l o i d c m c c t a b c z e d n a e c d e c l e d t a e 认 e o f f a s s f i f i a f i n f i t c 缩写 a 衢n i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s( 亲和毛细管电泳) a m i n o g l y c o s i d e 柏t i b i o t i c s ( 氨基糖苷类抗生素) b a c k 垂r o u n ds o l u t i o n ( 背景溶液) c h a 唱ec o u p l e dd e v i c e ( 电荷耦合器件) c a p i l l a 叮e l e c 拍p h o r e s i s ( 毛细管电泳) c 印i l l a 拶e i e c t r o c h o 肌a t o g r 印h y( 毛细管电色谱) c a p i l l a r ) ，g e le l e c t r o p h o r e s i s( 毛细管凝胶电泳) c a p i l l a 黟i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ( 毛细管等电聚焦) c a p i l i a 叮j s o t a c h o p h o r s i s ( 毛细管等速电泳) c h e m i l u m i n e s c e n c e ( 化学发光) c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y 。( 化学发光免疫分析) c o n c e n t r a t j o nl i m i t so f d e t e c t i o n( 浓度检出限) c r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t m t i o n ( 临界胶束浓度) c e t ) ，it r i m e t h y l 锄m o n i u mb r 6 m i d e( 十六烷基三甲基溴化铵) c 印i l l a 巧z o n ee l e c t l 0 p h o r e s i s( 毛细管区带电泳) d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( 脱氧核糖核酸) e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ( 电化学检测) e l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e( 电致化学发光) e t h y l e n ed i 锄i n e t e n aa c e t i ca c i d( 乙二胺四乙酸) e n z y m ei m m u n o a s s a y ( 酶免疫分析) e l e c t r o o s m o s i sn o w ( 电渗流) f i e i d - a n l p l i f i e ds a n l p l es t a c k i n g( 场放大样品堆积) f l o wi n i e c t i o n ( 流动注射) f l u r o s c e n c ei n l n l u n o a s s a y ( 荧光免疫分析) f l o wi n j e c t i o ni m m 蚰o a s s a y ( 流动注射免疫分析法) f l u o r e s c e i l li s o t h i o c y a n a t e ( 荧光素异硫氰酸盐) 缩写 g c h p l c i a i d i t p l c w l i f l o d l p m e l v s s m c i m 2 m e m 匣k c m i p m l o d m s m s p d n a n a c e n d a o p a o d p g d p m t p t f e r i a s d s s f e s p a d g a sc h r o m a t o g r a p h y ( 气相色谱) h i g hp e r f o r n l a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y( 高效液相色谱) i m m u n o a s s a ya n a l y s i s ( 免疫分析法) i n s i d ed i a m e t e r ( 内径) i s o t a c h o p h o r s i s ( 等速电泳) l i q u i d c o r ew a v e g u i d e ( 液芯波导) l a s e ri n d u c t e dn u o r e s c e n c e ( 激光诱导荧光) l i m i t so f d e t e c t i o n ( 检出限) l i q u i d - p h a s em i c r o e x t r a c t i o n( 液相微萃取) l a 唱e v o l u m es a m p l es t a c k i n g( 大体积样品堆积) m o v i n gc h e m i c a lr e a c t i o nb o u n d a 叮( 移动化学反应界面) 2 m e r c a p o e t h a n o l ( 2 一巯基乙醇) m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc 1 1 r o m a t o g r a p h y ( 胶束电动毛细管色谱) m o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r ( 分子烙印聚合物) m a s sl i m i t so fd e t e c t i o n ( 质量检出限) m a s sc h r o m a t o g r a p h y( 质谱) m a t r i xs o l i dp h a s ed i s p e r s i o n ( 基质固相分散) n u m e r i c a la p e n u r c ( 数值孔径) n o n - a q u e o u sc a p i l l a 叫e l e c t r o p h o r e s i s( 非水毛细管电泳) n a p h t h a l e n e 一2 ，3 - d i c a r b o x a l d e h y d e( 萘二甲醛) d - p h t h a l a l d e h y d e ( 邻苯二甲醛) o u t s i d ed i a m e t e r ( 夕 径) p o t e n t i a lg r a d i e n td e t e c t i o n ( 电势梯度检测) p h o t o m u l t i p l i e rt u b e( 光电倍增管) p o i ) ，t e t r a f l u o r o e t h y l e n e( 聚四氟乙烯) r a d i o i m m u u n o a s s a y ( 放射免疫分析) s o d i u md o d e c y ls u l 蠡l t e ( 十二烷基硫酸钠) s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ( 超临界流体萃取) s i n g l ep h o t o na v a l a n c h ed i o d e s ( 单光子雪崩型光电二极管) 缩写 s p e s p m e t l c u v v i s s o i i dp h a s ee x t r a c t i o n ( 固相萃取) s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ( 固相微萃取) t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( 薄层色谱法) u l t r a v i o l e t ( 紫外) v i s i b l es p e c t r o m e t 叮( 可见光谱) l 中国科学技术大学博士学位论文 中国科学技术大学学位论文原创性和授权使用声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谓 的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：鲤 妒髀占其( 7 d 日 第一章综述 1 1 研究背景 第一章综述 1 1 1 毛细管电泳简述 毛细管电泳( c e ) 是高效、快速、样品和试剂消耗少的一种分离技术，c e 以 高压电厂为驱动力，以毛细管为分离通道，样品中的组分按淌度或( 和) 分配系 数的差异而得以分离。毛细管电泳仪器装置通常包括高压电源、毛细管、检测器 和缓冲液贮瓶，如图1 1 所示【1 】。 图1 1 毛细管电泳仪器结构装置【l 】 c e 分离模式主要包括毛细管区带电泳( c z e ) 【2 】、毛细管凝胶电泳( c g e ) 【3 】、 胶束电动毛细管色谱( m e c c ) 【4 】、毛细管等电聚焦( c i e f ) 【5 】、毛细管等速电泳 ( c i t p ) 【6 】、毛细管电色谱( c e c ) 【7 】、亲合毛细管电泳( a c e ) 8 】和非水相毛细管电 泳( n a c e ) 【9 】等。 基础理论研究主要涉及区带展宽 1 0 ，l l 】，分离度优化【1 2 1 ，电渗流 ( e o f ) 【1 3 ，1 4 】，热效应 1 5 】，管壁吸附效应【1 6 】等，这些问题的深入研究使c e 技 术迅速成熟和发展推广。 c e 广泛应用于生物、医药、化工、食品、环境、司法等领域【1 7 2 1 】，从无 机小离子到生物大分子，从带电粒子到中性分子，几乎涉及到国民生产生活的各 个领域。 1 1 2 毛细管电泳研究趋势 在生物医学等多方面巨大的应用价值，是c e 目前成功的关键。微型化的芯 片电泳是c e 仪器发展的重要趋势，毛细管阵列电泳极大地提高了工作效率，缩 第一章综述 短了样品的分析周期。单细胞检测从细胞水平上去探寻生命的奥秘，单分子检测 从单个分子水平上为开展化学动力学、反应动力学等研究提供了可能。这些工作 均面临着高灵敏检测的挑战【2 2 】。由于c e 检测通道小和柱容量低，实现灵敏的 检测需要发展高灵敏的检测器或检测方法，c e 仪器装置简单，其面临的最大挑 战是高灵敏的检测方法和检测器的发展 2 3 】。 1 1 3 发展灵敏的激光诱导荧光检测的意义 激光诱导荧光( l i f ) 检测器是c e 最灵敏的检测器之一 2 2 ，2 4 】。l i f 不仅提高 了检测灵敏度，还可增加检测的选择性，仅对产生荧光或被选择性荧光标记的分 子产生响应，可有效消除基体成分的干扰，在痕量生物样品和环境监测方面应用 广泛。既可以使用小孔径的毛细管，处理更少的样品，得到更高的分离效率，具 有更广阔的应用领域。由于大多数分析对象没有荧光基团，通常需要进行荧光标 记，恰当地选择激发波长和荧光衍生试剂对检测灵敏度的提高具有重要的现实意 义。l i f 检测系统存在的主要问题是通用性差、体积大、价格贵、光学结构比较 复杂等，由于商品化的仪器 2 5 2 7 价格较贵往往难以满足实验需求，目前大多 自行组装 2 8 3 0 。 1 2 提高毛细管电泳检测灵敏度方法 。c e 采用内径很小的毛细管，样品负载能力小，而且在常规u v - v i s 检测中检 测光程短，导致灵敏度相对较低，这也是目前c e 面临的最大问题之一。为了扩 大c e 的应用范围，提高其检测灵敏度，可通过两种途径实现【3 l 】。 一、增加样品负载量，主要有色谱富集技术和电动富集方法。 二、提高检测器的灵敏度，主要有增加检测吸收光程，降低荧光背景噪音， 采用l i f ，c l ，m s 等灵敏的检测方法。 1 2 1 样品富集技术 1 2 1 1 色谱富集技术 色谱富集技术是先将富集柱和c e 毛细管连接或者将吸附固定相内置于毛细 管，分析物溶液流经固定相后吸附，再用洗脱液将分析物从固定相洗脱下来，该 方法的检测灵敏度通常能提高2 3 个数量级，个别甚至达到4 个数量级。 固相萃取预富集毛细管电泳分离装置由进样毛细管、萃取管和分离毛细管组 成，萃取管一般用内径与分离毛细管外径相匹配的石英毛细管【3 2 ，3 3 】、t e f l o n 管 2 第一章综述 3 4 或聚乙烯管 3 5 3 7 】管内填充c 1 8 或c 8 固定相填料，填料两端用玻璃纤维膜 【3 2 - 3 5 】或聚醚砜膜 3 6 】封住，再用两段毛细管分别从萃取管两端插入，分别作为 进样管和分离毛细管，然后用环氧树脂密封固定。相似的膜富集装置采用色谱固 定相键合过的膜置于两毛细管之间【3 8 】。 在线富集过程包括缓冲液平衡、压力进样、分析物富集、洗脱和分离，检测 灵敏度可提高3 4 个数量级。另外还有在少量高纯石英毛中加入大量2 0p m 的 多孔石英熔珠，涡旋使多孔熔珠和石英毛缠绕，并作为预富集材料嵌入t e f l o n 管中构成预富集装置 3 9 】。该装置易于制作、反压低，不需柱塞。 f i s p e c e 富集技术 4 0 】采用f i c e 接口，将含有离子交换树脂的微柱用于 离子交