（应用化学专业论文）表面活性剂与DNA相互作用研究.pdf

摘要 在酊人对d n a 与阳离子表面活性剂相互作用研究工作的基础上，选取不同种类 的新型表面活性剂或表面活性剂复配体系，对其与d n a 的相互作用进行了研究。分 别选取具有特殊结构的阳离子表面活性剂、无毒易生物降解的非离子糖基表面活性 剂，阳离子非离子复配体系以及两性表面活性剂对这些表面活性剂体系与d n a 相互 作用进行从宏观层面到微观层面的考察，并分别以相行为，荧光光谱法，表面张力， 平衡渗析，透射电镜等方法进行了研究，以期获得d n a 与表面活性剂相互作用分子水 平的信息，并得出其中规律性的因素。研究发现非离子糖基表面活性剂烷基多糖苷 ( a p g ) 可以和d n a 发生较强的相互作用，其作用远强于一般的非离子表面活性剂。 a p g 是通过其头基上的多羟基结构以氢键与d n a 相互作用的，作用过程可分为两阶段， 第一阶段多苷依靠其大量的羟基结构与d n a 形成动力学稳定的复合物，第二阶段由于 空间位阻效应，头基较小的单苷将与d n a 形成热力学稳定的复合物。通过对 d n a c t a b a p g 三元体系浊度及相行为的研究发现，d n a 与表面活性剂相互作用的与其 浓度有关，在高d n a 浓度区，d n a 与表面活性剂相互作用是静电推动过程，a p g 的加 入对体系无明显影响，而盐的加入将使体系内相互作用减弱；在低d n a 浓度区，d n a 与表面活性剂相互作用为疏水推动过程，a p g 的加入可使体系浊度提前，即加强d n a 与c t a b 的相互作用，盐的加入亦有类似效果。 通过对d n a 与十六烷基三乙基溴化铵( c t e a b ) 相互作用的研究，并对比d n a 与c t a b 研究结论，发现阳离子表面活性剂的头基越小，电荷密度越高其与d n a 相互 作用越强，且形成的复合物也越稳定。盐的加入超过一定浓度时复合物会发生解离， 解离时表面活性剂以胶束形式还是以单体形式解离，取决于表面活性剂头基性质以及 表面活性剂相对d n a 的浓度。通过研究d n a 与两性表面活性剂相互作用发现，两性表 面活性剂在其c m c 前后与d n a 作用方式不同，在其c m c 之前，与d n a 作用较弱仅能使 d n a 构象略为缩拢，而在c m c 后，与d n a 相互作用较强，且该作用强度可以通过对体 系p h 值及离子强度进行调节而加以控制。 关键词：d n a ；表面活性剂：键合；胶束；复合物；协同效应；c m c ：c a c a b s t r a c t b a s e d0 np r e v i o u sr e s e a r c hr e s u l t so nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n a a n dc a t i o n i c s u r f a c t a n t ，i n t e r a c t i o n sb e t w e e nd n a a n ds u r f a c t a n t so fs p e c i a ls t r u c t u r ew e r es t u d i e d f r o mm a c r o s c o p i ct om i c r o s c o p i cs c a l e s u c hr e s e a r c ht e c h n i q u e sa sp h a s eb e h a v i o r , f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y , s u r f a c e t e n s i o n ，e q u i l i b r i u md i a l y s i s ，t e m ，e t c ，w e r e e m p l o y e d t o g a i n a i n s i g h t i n t ot h em o l e c u l a r - l e v e li n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n d s u r f a c t a n t s e x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o wt h a t s u g a r - b a s e d s u r f a c t a n t a l k y l p o l y g l u c o s i d e ( a p g ) h a s as t r o n gi n t e r a c t i o nw i t hd n a ，m o r es i g n i f i c a n tt h a no t h e r n o n i o n i cs u r f a c t a n t s ，i th a sb e e nf o u n dt h a ta p gi n t e r a c t sw i t hd n at h r o u g hh y d r o g e n b o n d i n g t h ei n t e r a c t i o np r o c e s sc a nb ed i v i d e di n t ot w os t a g e s a tt h ef i r s t s t a g e ， p o l y g l u c o s i d ed e p e n d i n g i t sm u l t i - h y d r o x y ls t r u c t u r ef o r m sw i t hd n a a k i n e t i c a l l ys t a b l e c o m p l e x d u et o t h es p a c i a lh i n d r a n c e ，m o n o g l u c o s i d ew i t hs m a l l e rh e a d g r o u pf i n a l l y f o r m sw i t hd n aa t h e r m a l l y s t a b l e c o m p l e x t u r b i d i t y a n d p h a s e b e h a v i o rf o r d n a c t a b a p gs y s t e ms h o wt h a tt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n ds u r f a c t a n td e p e n d s h e a v i l y o nd n ac o n c e n t r a t i o n ，a th i g hd n ac o n c e n t r a t i o n s ，t h ei n t e r a c t i o ni sa s t a t i c d r i v e np r o c e s s ，a p ga d d i t i o np r o d u c e sl i t t l ei n f l u e n c ea n ds a l ta d d i t i o nl e a dt od e l a y o f t u r b i d i t y a tl o w d n a c o n c e n t r a t i o n s ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n a a n ds u r f a c t a n ti sa h y d r e p h o b i c i t y d r i v e np r o c e s s ，a p ga d d i t i o nc a l ls t r e n g t h e nd n a s u r f a e t a n ti n t e r a c t i o n ， a n ds a l ta d d i t i o nl e a d st os i m i l a rr e s u l t s r e s e a r c ho nd n a c t e a bs y s t e ms h o w st h a t c a t i o n i cs u r f a c t a n tw i t hs m a l l e rh e a d g r o u pw i l li n t e r a c ts t r o n g e rw i t hd n aa n df o r m sa m o r es t a b l e c o m p l e x a d d i t i o n o fs a l tw i l ll e a dt od i s s o c i a t i o no ft h e c o m p l e xa n d s u r f a c t a n t sa r ed i s s o c i a t e df r o md n ab a c k b o n ee t h e ra sm i c e l l eo ra si n d i v i d u a l s u r f a c t a n t sd e p e n d i n go ns u r f a c t a n t sh e a d g r o u p p r o p e r t i e sa n d i t sc o n c e n t r a t i o nr e l a t i v et o d n a r e s e a r e ho nd n aa n dz w i t t e r i o n i cs u r f a c t a n ts h o w st h a tz w i t t e r i o n i cs u r f a c t a n t h a v et w od i f f e r e n tc o m p l e xm a n n e r s b e f o r ei t sc m c ，t h e i ri n t e r a c t i o ni sw e a ka n dc a n o n l yl e a dt op a r t i a lc o m p a c t i o no f d n a b a c k b o n e ，w h i l e a f t e ri tc m c ，s t r o n g e ri n t e r a c t i o n w i t hd n at a c k sp l a c ea n dt h es t r e n g t ho ft h ei n t e r a c t i o nc a nb ea d j u s t e db y c h a n g i n gp h a n di o n i cs t r e n g t ho f t h ee n v i r o n m e n t k e yw o r d s ：d n a ；s u r f a c t a n t ；b i n d i n g ；m i c e l l e ；c o m p l e x ；c o o p e r a t i v i t y ；c m c ，c a c 创新性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的科研成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以 明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：尘鳌壶 日期： ，t 矿野占 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国日化院有关保留、使用学位论文的规定，同意日化院保留或向 国家有关部门或机构送交论文复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅：本人授权中 国日化院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本论文所取得的研究成果属中 国日化院，其他任何个人或集体未经中国日化院授权不得使用。 论文作者签名罐茎牵导师签名 期：丝苎 本论文创新点 1 首次对d n a 与糖基非离子表面活性剂相互作用进行了研究，阐明了该表面 活性剂与d n a 相互作用的途径及模式，分析了其与d n a 相互作用强度远强 于其它种类非离子表面活性剂的原因。 2 首此采用阳离子月 离子表面活性剂复配体系对其与d n a 相互作用进行了研 究，发现了复配体系在一定d n a 浓度区间与d n a 的作用强于单纯阳离子表 面活性剂体系，并借助对二者的比较进一步揭示了d n a 与表面活性剂相互 作用的规律。 3 通过对具有较大头基十六烷基三乙基阳离子表面活性剂与d n a 的相互作用 研究发现，表面活性剂头基对其与d n a 的作用方式及生成复合物的稳定性 有明显影响，并对其进行了解释。 4 选取两性表面活性剂对其与d n a 相互作用的方式进行了研究，发现两性表 面活性剂在其c m c 前后与d n a 作用方式及强度不同，在c m c 之后其与d n a 之间的相互作用可以通过对体系的离子强度及p h 条件而加以控制。 中国日用化学工业研究院研究生论文敬登伟 1 i 前言 第一章d n a 与表面活性剂相互作用研究进展 聚合物与表面活性剂在水溶液中的相互作用由于其在科研和生产很多领域中的应用 而被广泛研究1 “】。d n a 由于每个核酸单元上都连有负的磷氧基而可被视做高度负电性 的聚合物。它与表面活性剂相互作用形成沉淀可用来对d n a 进行分离、纯化【7 】，形成的 复合物在基因材料的控制传输上更具实用价值【8 1 。但与其它聚合物相比，d n a 与表面活 性剂之间的相互作用研究得较少。 聚合物和表面活性剂相互作用的研究传统上可分为两大类，即低浓度聚合物和高浓 度聚合物与表面活性剂的相互作用研究，并依据两组分的电荷分类研究【9 】。低浓度下聚 合物与表面活性剂的相互作用，主要研究表面活性剂对单个大分子构象的影响，称其为 分予水平研究；高浓度下聚合物与表面活性剂之间的相互作用如沉淀，絮凝等相分离现 象，多研究多分予间的相互作用，故称之为宏观水平研究。一般认为，聚合物与离子表 面活性剂相瓦作用丰要有静电作用和疏水作用两种途径，而前者往往占主导地位【1 0 】。因 此，带反电荷的阳离子表面活性剂与d n a 之间的相互作用研究得较多。有报道已通过 键合等温线的测定证明烷基三甲基溴化物浓度达到临界聚集浓度( c a c ) 时将以协同方式 与d n a 的相瓦作用，这种现象和表面活性剂与合成大分子之间的作用类似 卜5 1 。在阳离 子表面活性剂浓度很低的情况下，会使长链d n a 分子发生从线圈型向小球型的构象转 变。而当阳离子表面活性剂浓度相对较高时，则其与d n a ( 多选短链d n a 或长链d n a 片段) 之间的相互作用一般都会导致宏观相分离 “叫3 1 。一般认为，d n a 分子链的刚性 会阻止局部区域d n a 链对表面活性剂聚集体的包裹，因此只有当各d n a 与表面活性剂 形成的复合物之间相互作用形成沉淀后短链d n a 才会发生构象缩拢【1 4 叫5 1 。 对于阴离予表面活性剂，因其和d n a 都带负电荷，它们之间的静电斥力使得二者 几乎不发牛作用【l “。非离子表面活性剂与d n a 之间的相互作用与有机溶剂对d n a 的影 响相类似，即通过溶液的极性、粘度及介电常数来影响d n a 的构相，也有人认为是通 过氢键相瓦作用。一般认为只有在很高浓度的情况下非离子表面活性剂才能对d n a 构 中国日用化学工业研究院研究生论文敬登伟 象产生影响【”】。目前国际上对d n a 与表面活性剂之间的相互作用研究主要可以分为两 部分，一部分是以相行为为基础的宏观研究，另一部分是单分子水平的微观研究，本综 述将对相关的研究进展进行逐一介绍。 1 2 表面活性剂与d n a 在水溶液中的相行为 1 2 1 基本相图介绍 对于阳离子表面活性剂研究较多为烷基三甲基溴化铵系列，如水溶液中十六烷基三 甲基溴化铵( c t a b ) 、十四烷基三甲基溴化铵( t t a b ) 及十二烷基三甲基溴化铵( d d a b ) 与d n a 相瓦作用。t h a l b e r g 等提出，对聚电解质与反离子表面活性剂的水溶液体系 应当把其各自反离子组成的无机盐也看作一独立组分，以反应体系中实际存在的离子强 度的变化，并推荐使用正四棱锥相图来准确反映体系相行为。不过，正四棱锥相图绘制 较为烦琐且不直观，因此一般选用该相图的一个截面，即拟三元相图来研究，此时无机 盐不看作一个独立组分。由于忽略了这一组分，故在采用拟三元相图时两相区结线有时 并不落在该截面内。这可能是一些拟三元相图与实际情况出现偏差的原因。 图1 1 聚电解质表面活性剂水体系两种相分离示意图 f i g u r e1 - 1d i a g r a mo f p h a s es e p a r a t i o no f p o l y e l e c l r o l y t e s u r f a c t a n t w a t e rs y s t e m 对于聚电解质表面活性剂水体系而言有两种相分离情况，如聚电解质和表面活性剂 之间存在着强烈的吸引作用，则当出现两相区时，一相中含有大量的聚电解质及表面活 2 中国日用化学工业研究院研究生论文敬登伟 性剂而另一相为稀溶液，如图i - l ( a ) 称其为缔合相分离。如果聚电解质和表面活性剂 之间不存在1 】及, 3 1 作用，则当出现两相区后，一相含有较多的聚电解质，另一相含有较多 的表而活性剂，如图1 1 ( b ) 称为隔离相分离。 1 2 2 阳离子表面活性剂d n a 水三元相图 d i a s 等1 利用上述拟三元相图对不同链长的烷基三甲基溴化铵同系物( c t a b 、 t t a b 、d t a b ) 与d n a 在水溶液中的相行为进行了研究，考察疏水作用对d n a 与表 面活性剂相行为的影响。如对d n a d t a b 水体系得到三元相图1 - 2 a ，在研究中选短链 表面活性剂可以使体系较快达到平衡，并且到较高的浓度时表面活性剂仍能以胶束形式 存在”】，这样使得实验可进行到较高的表面活性剂浓度以考察沉淀是否会因过量表面活 性剂的加入而溶解。 图1 2 ( a ) d n a c t a b 水体系拟三元相图，( b ) 三元相图( a ) 的水顶角的扩展视图 分别为d t a b 两相区内外界线，为t t a b 两相区界线，为c t a b 两相区界线 f i g u r e1 - 2 ( a ) p s e u d o t e m a r yp h a s ed i a g r a m f o rd n a c t a b w a t e r s y s t e m ( b ) e x p a n d e d v i e wo f t h ew a t e rc o m e r o f f i g ( a ) 图1 - 2 ( a ) 中虚线以上由于体系粘度极高无法测定，故未给出。由相图得出以下结 论：1 ) d n a 与阳离子表面活性荆是以缔合方式发生相分离的，沉淀现象说明二者作用 非常强烈，阳离子表面活性剂中和了d n a 链上磷酸根的负电荷，使得各d n a 链间斥力 减小，最终导致其聚沉。2 ) 沉淀并不因为加入过量的表面活性剂加入而溶解，这与其它 dleo 中国日用化学工业研究院研究生论文敬登伟 种类聚电解质与表面活性剂之间的相互作用不同【2 0 捌。3 ) 沉淀在极低表面活性剂浓度 下产生，远低于它们的临界胶束浓度( c m c ) ，说明d n a 的加入有利于表面活性剂缔合 并与d n a 形成聚集体2 3 1 。4 ) 随着阳离子表面活性剂的链长增加，沉淀所需要的表面活 性剂量减小，即表面活性剂与d n a 之间的相互作用加强，说明疏水作用有利于表面活 性剂与d n a 复合物的形成。 c 盯 h d n a ( b ) 图1 3 ( a ) 沉淀量与c d t a b c d n a 关系图；( b ) w ( 水) 与c d t a b c d n a 摩尔比关系图 f i g u r el - 3 ( a ) c o r r e l a t i o n b e t w e e n p r e c i p i t a t i o na n dc d t a b c d n a ( b ) m a s sf r a c t i o no f w a t e r i ns u p e m a t a n tv s c d t a b c d n a d i a s 等j 又以沉淀量对d t a b 和d n a 的摩尔比作图( 图l 。3 ( a ) ) ，图中，在d n a 与d t a b 摩尔比为1 ：1 即等电点附近，沉淀量增长出现一个平台，随后仅有少量的增 长。上层清液中水含量也在该点附近达到最大，随后水量变化为一直线且平行于初始态 水占整个体系的质量分数对应的直线。d i a s 等据此认为，在等点电以后继续加入的d t a b 都存在于上清液中而不参与复合物的生成，等电点后沉淀量的增加归因于残存在沉淀中 的上清液，因在处理沉淀时很难将上清液完全除尽，其中残存的表面活性剂导致了沉淀 量的少量增加。笔者认为图1 3 ( a ) ，( b ) 中直线交叉点对应c d t a b c d n a = 1 3 说明，等 电点后d t a b 在沉淀物上仍可能有少量疏水聚集，从而导致等电点后沉淀量有小幅增加。 显然，d n a 与表面活性剂相互作用以静电作用为主导，但疏水作用也对缔合过程起着重 要的辅助作用，即先以亲水头基与d n a 链上的负电荷相互作用，再以疏水链的疏水作 用将其它表面活性剂引入该区域即发生协同效应。 4 9 0 7 6 5 4 3 2 i o t ；d ) 7654 卟，吖 2o 中国日用化学工业研究院研究生论文敬登伟 1 2 3 外加盐对水溶液中相圈的影响 d i a s 等增察了盐对d n a 阳离子表面活性剂体系两相区的影响。发现盐的存在使 得两相区面积减小。根据w a n g 等【2 4 】的理论，聚电解质和表面活性剂相互作用释放出如 b r 。、n a + 等小的无机离子，另外表面活性剂与聚电解质键合的过程也会从胶束聚集体的 栅栏层中释放出其结合的水分子，这两个效应都使体系的熵显著增加，补偿了聚电解质 和表面活性剂相互作用产生相分离所造成的熵损失。而当外加盐时熵补偿效应受到抑制 2 5 1 ，使得聚电解质和表面活性剂相互作用减弱：另外盐的存在也会对d n a 与表面活性剂 静电作用产生屏蔽最终促使两相区面积减小。值得一提的是，在d i a s 等【1 1 】在实验中还发 现，尽管盐的存在使两相区整体缩小，但对于低d n a 浓度区，尤其是在使用c t a b 时， 两相区却略有增大，作者未能对此现象作出解释，对该现象的解释，也是我们今后工作 的一个研究方向，以期进一步揭示d n a 与表面活性剂相互作用的规律及本质。 1 2 4 表面活性剂与d n a 在有机溶剂中的相行为 由前面介绍可知，在c d t a b c d n a = i ：1 附近，d n a 与d t a b 形成的复合物呈电中性， 此时复合物不溶于水，近几年有人发现该复合物可以溶于低极性溶剂【2 6 】，这使得对等电 点附近复合物在溶液中的物化性能研究成为可能。近来使用紫外光谱及圆二色光谱研究 还发现与表面活性剂形成非水溶性复合物的d n a 在有机溶剂中依然保持着双链螺旋结 构，即其二级结构并未发生变化【2 ”。更重要的是，d n a 在有机介质中的溶解可以看作 是对綦因转染过程中d n a 通过细胞膜的模拟，因为细胞膜的内部环境正是低极性的【2 8 1 。 以上这些都使得对d n a 与表面活性剂在有机溶剂中的相行为研究具有重要意义。 在有机溶剂中，不会发生表面活剂碳链之间的疏水作用所导致得对d n a 的协同键 合【2 “。表面看来，有机溶剂可将表面活性剂与d n a 形成的复合物溶解甚至完全解离， 但事实是d n a 复合物在低极性有机溶剂中依然保持着复合物形态，这说明在有机溶剂 中复合物内的离子键依然保持完好，此时的复合物的行为与处于良溶剂中的梳形聚合物 类似。如聚( n 乙基4 乙烯基吡啶) 即p v p 和十二烷基硫酸盐的复合物在氯仿中亦有 类似行为【3 0 。s e r g e y e v 3 1 1 等通过研究发现，d n 表面活性剂复合物溶于有机溶剂的关 键在于复合物的干燥度，即复合物内痕量水的存在不利于其溶解于有机溶剂中。这是因 中国e l 用化学工业研究院研究生论文敬登伟 为d n a 以及阳离子表面活性剂的亲水头基在形成复合物后其水化程度依然很高，形成 复合物颗粒后尽管不带电，但内部仍可能结合少量的水，使得整个复合物与疏水溶剂不 匹配，因此只有将水从复合物中完全除尽才能使复合物溶于有机溶剂中【3 2 1 。另外d n a 的链长也对沉淀溶解有影响，如实验发现大的d n a 片段( t 4d n a ， 一d n a ) 与阳离 子表面活性剂生成的沉淀在室温下不溶于有机溶剂【3 l l 。这可能与d n a 和表面活性剂形 成的复合物结构有关，因为短链d n a 链的刚性导致其不易弯曲而使其链上的磷酸根被 表面活性剂包裹的较紧密，可与有机溶剂较好的匹配，而长链d n a 链形成球状复合物 后表面活性剂疏水链倾向于插入复合物内部使较多得d n a 电荷暴露于复合物与溶剂的 界面使其与非极性溶剂不匹配。 s e r g e y 研究了c t a b 、t t a b 、d t a b 与t 4d n a 形成的复合物在低极性溶剂中及在 不同温度下的溶解t 勒2 t 3 ： 1 ( 如表1 ) 。表1 中“+ ”表示复合物可溶，“”表示复合物不 溶于有机溶剂。从表l - l 可以看出干燥的和湿的d n a 复合物其溶解性截然不同。另外 表1 1 中氯苯和甲苯增溶复合物的效率较高，这可能与它们都是聚烯类的良溶剂有关， 而此处阳离子表面活性剂的烷基链取代基也可看作是近似于短链的聚烯类化合物。这种 近似于化学溶剂的“相似相溶原理”的现象对于d n a j 表面活性剂复合物控制基因传输 研究尤为重要，即要求表面活性荆的化学结构对组成细胞膜的组分有较高的化学亲合性 这样利于提高转染效率【3 “3 2 1 。 表1 - 1 不同温度下t 4d n a 一表面活性剂在低极性溶剂中的溶解情况 溶剂 d d a b - d n a d d a b - d n a ( 水c t a b d n ac t a b d n a ( 水 ( 干燥)溶液)( 干燥) 溶液) 氯苯 甲苯 氯仿 环己烷 氯苯 甲苯 氯仿 环己烷 2 5 6 5 - 6 + + 一 十+ + + 中国日用化学工业研究院研究生论文敬登伟 v l a d i m i r 等【2 9 1 研究了d n a 与c r a b 形成的复合物在不同比例水和醇的混合溶剂中 的溶解情况，发现在高极性溶剂中复合物为小球状且不溶，在中等极性时复合物解离， d n a 以舒展线圈构相在体相中自由的布朗运动，而在低极性溶剂中球状复合物重新形成 且完全溶解，原因是此时球状复合物的界面上的c t a b 的疏水链朝向溶剂中，降低了表 面能，增加了复合物的疏水性。一个有趣的现象是短链d n a 的沉淀向溶解转变与长链 d n a 的小球向线圈的构象转变对应的醇的浓度一致，这也说明非极性溶剂对d n a 与表 面活性剂的宏观相行为及微观构象变化的影响之间存在着一定的联系。 1 3d n a 表面活性剂水三元体系沉淀形成边界的光散射及浊度研究 一 b 芑 裔 岛 n ( c t a b ) ：r l ( d n a ) r b = 盛 一 f i ( c t a b ) ：r l ( d n a ) 图1 - 4 光散射强度对n ( d t a b ) n ( d n a ) 作图 f i g u r e1 - 4r e p r e s e n t a t i o no f s c a t t e r i n gi n t e n s i t yv s n ( d t a b ) n ( d n a ) 如上所述，由于一般在极低的阳离子表面活性剂浓度下d n a 就会发生沉淀，这就 使得对沉淀区的边界确定变的相当困难。s p i n k 等f 孙埽d 用光散射法准确确定了沉淀的边 界( 图1 4 ) 。在该实验中s p i n k 等采用了同种链长但不同摩尔浓度的d n a ( 图1 - 4 a ) ： 不同链长仙总浓度相同的d n a ( 图1 - 4 b ) ，用这两种样本的散射光强度对d t a b 与d n a 磷酸根数的胯尔比作图。由图可看出对于两种样品，都在c d t a b c d n = o 8 附近散射光强 度达到最大。在陵点之前散射光逐渐增大是因为d n a 与表面活性剂相互作用形成的复 合物颗粒不断变大而使光散射加强，到复合物粒径达到开始出现沉淀后，由于溶液中的 复合劬开始减少而使得散射光强度又开始下降。所以c d t a b c d n a = o 8 即为沉淀开始出现 中国日用化学工业研究院研究生论文敬登伟 的点。图1 - 4 中两种样品的沉淀边界基本相同，说明复合物的沉淀行为与d n a 的链长及 浓度无关，仅与d n a 和阳离子表面活性剂所带的正负电荷比例有关，这进一步证明了 静电作用对d n a 和表面活性剂相互作用起着主导作用。 d a n i l o 等【”1 使用紫外分光光度计对体系的浊度进行测定也证明在等电点附近浊度 最大( 对应较浓溶液的沉淀量最大) 。d a n i l o 等规定浊度最大处为1 ，小于0 4 为可溶复 合物，0 4 、0 6 、0 8 分别为极轻度絮凝、轻度絮凝及絮凝。根据浊度为l 处的表面活性 剂加入量按照每个碱基对两个负电荷即可算出d n a 的碱基对数。 1 4d n a 表面活性剂水三元体系键合等温线及恒温量热研究 为了对d n a 与表面活性剂相互作用的具体方式及过程进一步研究，m e l n i k o v t 3 5 俐 用离子选择性膜电极进行电位滴定得出c t a b 加入d n a 水溶液中，体系的电位变化， 如图1 5 。由电动势和溶液浓度的关系可以计算出体系中游离态的c t a b ，进一步可得出 参与d n a 键合的c t a b 的质量百分数即键合度。以该键合度对溶液中游离表面活性剂 浓度的对数作图即可得出该体系的键合等温线( 图1 6 ) 。由图中可看出键合曲线显示s 形，说明c t a b 与d n a 的键合是以协同方式进行的。键合起始点为临界聚集浓度( e a c ) ， 此处c a c 的临界聚集浓度比c t a b 单独存在的e m c 小两个数量级。 图1 6 中键合等温线键合度最高仅为0 7 6 左右，由前面光散射结论知，对浓溶液其 后将出现沉淀。该现象可以归于以下两种效应的综合作用：( 1 ) m a n n i n g 的反离子凝聚效 应理论；( 2 ) 表面活性剂键合诱导d n a 链的高度有序结构发生转变【3 6 q 7 1 。根据m a n n i n g 的理论由于几何构型的原因键合度不能达到1 ，又由h a y a k a w a 3 8 1 的空间填充模型估计烷 基三甲基铵离子的头基尺寸约为6 9 a ，b 型双链螺旋d n a 上负电荷之间的最小距离为 5 a ，因此可以推测空间位阻对表面活性剂对d n a 的键合度上限起着关键的作用。将相 行为结果( 最大沉淀准确说来出现在c t r r , c d n a = 1 3 ) 与最大键合度o 7 6 比较，可以猜 测，在这个c t a b 浓度区间内，d n a 链已经被饱和( 实验证实，每个c t a b d n a 复合 物中仅含一个d n a 分予【8 】) ，所加入的c t a b 似乎更多的在复合物之间起了桥梁作用即 加强了复合物与复合物之间结合直至沉淀，而也正是这部分缔合架起了微观构象变化和 宏观相行为的桥梁。d n a 与表面活性剂生成复合物及沉淀的能量变化可以恒温滴定量热 ! 垦旦旦些兰三些旦塞堕堑塞生笙兰：墼兰堡 来研究【3 ”。因为一般胶束聚集体形成为吸热过程而解离为放热过程，因此从d n a 表面 活性剂体系的热量浓度图中热量突跃可判断键合的开始，根据突跃的大小可计算出表面 活性剂刺d n a 的键合热”】。不过，在对复合物进行量热研究时应预先对表面活性剂 单独进行量热，测定其稀释热r 并选取其c m c 以前的一段浓度进行研究( 溶液中仅有表 面活性剂存在时，其c m c 以前的吸放热可以忽略) ，这样经过校正后的量热曲线才能用 来分析表面活性剂与d n a 的c a c 及键合热等热力学参数3 9 “o l 昌 、一， 回 l o g c i 图1 5 电动势对c t a b 总浓度作图 f i g u r e1 - 5e l e c t r o m o t i v ef o r c ev s t o t a lc r a b c o n c e n t r a t i o n i 5d n a 表面活性剂复合物形成过程中反离子释放的理论证明 由以上讨论知，静电作用对d n a 与表面活性剂相互作用起着关键作用，且由相图 研究知道等电点附近复合物的沉淀量最大。w a g n e r 等利用非线性p b 方程对该现象 进行了理论证明。在该研究中，w a g n e r 等选取形成液晶的表面活性剂与d n a 相互作用 为研究对象，将体系分成k 个单元晶格并给出下式： f ：丝：；l _ 丝竖! 盟( 1 ) n + + 州一n + m 一 式( 1 ) 中n + 为单位体积内阳离予表面活性剂分子数，m 为体系中d n a 所带的负电荷 密度，an o 为单位体积内复合物形成前后自由反粒子浓度变化，m + 。和m 。分别为单元晶 格内反离予的过剩量。在该式前个等式可通过实验测量，后一个等式可使用p b 理论 中国日用化学工业研究院研究生论文敬登伟 进行计算，这样就可以将理论与实验相互比较。对形成沉淀前的溶液及沉淀形成后的上 清液进行电导分析来测定反粒子的释放分数并对表面活性剂与d n a 的浓度比作图，与 理论计算相比较结果二者符合的很好( 图未给出) ，都是在等电点附近反离子释放最大即 完全释放。通过进一步对液晶相形成自由能的计算还可证明由反离子释放获得的熵增对 复合物液晶的形成能贡献最大，即该复合物的形成为一熵驱动过程。 装 q 量 口 _ 目 e 盆 l o g c e 图1 - 6t 4d n a c t a b 体系键合等温线 f i g u r e1 - 6b i n d i n gi s o t h e r mo f t 4 d n a c t a b s y s t e m 1 6d n a 表面活性剂在亲水及疏水固体表面的等温吸附研究 为了更深入了解沉淀以后沉淀物内部表面活性荆和d n a 相互作用的情况以及不同 链长的d n a 对产生沉淀的影响，e s k i l s s o n 等【4 2 】选取不同链长d n a 对其与c t a b 形成 的复合物在带负电的亲水固体表面及不带电的疏水固体表面的吸附及盐水导致的脱附情 况进行了研究。在该研究中e s k i l s s o n 等利用对硅及氧化硅表面处理分别得到以上两种固 体表面。研究结果表明，d n a 与表面活性剂形成的复合物的吸附情况与复合物在体相中 的状态有关。对于短链d n a ，其与表面活性剂作用虽然形成复合物但d n a 并未发生构 象凝聚，该类复合物在体相发生相分离后大量吸附于带负电的亲水固体表面，相反，发 生了构象凝聚的长链d n a 与表面活性剂复合物不易吸附于带负电的硅表面。 中国日用化学工业研究院研究生论文敬登伟 对于疏水表面，少量表面活性剂的加入使预吸附于固体表面的短链d n a 吸附层厚 度明显减小说明d n a 的构象在此时发生了缩拢。原因可以解释为短链d n a 在形成沉淀 之前虽然以复合物形式存在，但d n a 链的刚性使得其骨架并未凝聚。而当形成沉淀后， 复合物之间的作用加强使其构象缩拢。相当薄的吸附层表明，过量表面活性剂的加入并 未在吸附层形成聚集体即d n a 链被表面活性剂饱和后将不再继续与表面活性剂继续键 合，这与前面结论相符。由于生物细胞表面可以看作是亲水的带负电的吸附面，而细胞 膜内部可看作疏水表面田 ，因此研究表面活性剂与d n a 形成的复合物在以上两种固体 表面的吸附情况对d n a 向细胞内部的控制传输也是很有意义的。 1 7 关于d n a 构象变化的理论讨论 作为聚电解质的一种，由舒展线圈向致密小球的构象变化并非为d n a 所特有，许 多大分子都具有的此性质【3 5 】，m e l n i k o v 等【2 6 】利用统计物理学处理对线形大分子的自由 能使用v i r i a l 展开式得到下式： 皇盟=黑+瑚h+ncnkt8 n a 2 + 酗) ( 2 ) z 、， 、 该式中g ( n ) 为大分子的自由能，n 为同一大分子内链结数，r 为链结间分子链的最大长 度。 为大分子的持续长度，1 3 为单位体积内链结密度；b 、c 分别为第二、第三v m a l 系数。当b 0 ，由于分子内部强烈的斥力，大分子将以线圈态存在，在此情况下，忽略 ( 1 ) 式中第三项以及考虑条件粥，船；0 及n “r ，得： 乞d 芘n 5 ( 3 ) 当b i 时，该试剂分子才能诱导d n a 发生急剧的构象变化。反之，大分子链 如一般的单链d n a ，其持续长度在2 - 3 n m 之间，在外加试剂的诱导下一般会发生连续 的构象变化。 1 8 选题背景和研究内容 d n a 与表面活性剂相互作用不仅可以看作高度带负电的聚电解质与表面活性剂相 互作用，同时还可用于d n a 的抽提、浓缩及碱基对计量。近年来又有人用d n a 与表面 活性剂相互作用制各超分子膜材料 1 z 】因此研究两者的相互作用对生物、化学及材料学等 多个领域都有重要意义。以上介绍了利用各种研究方法从宏观上对d n a 与表面活性剂 相互作用进行研究，讨论了静电及疏水作用对该体系相行为的影响及相行为的驱动力并 做了理论解释。近年来，利用表面活性剂与d n a 作用形成的复合物作为基因载体的基 因疗法引起了人们的广泛关注【4 ”，但由于种种原因，目前所使用的以d n a 与表面活性 剂相互作用形成复合物作为非病毒基因载体的效率都不耐4 ”。因此对d n a 与表面活性 荆相互作用形成复合物的自组装过程及其结构的分子水平的研究是非常有必要的。 目前国际上各研究小组的工作组要的工作主要集中在高效无毒的新型表面活性剂的 选择上。但是由于表面活性剂与d n a 相互作用的机理，或者从更广的角度来说各种聚 合物与表面活性剂相互作用的机理研究还远未成熟，目前尚没有人能对二者相互作用的 过程给出完全令人信服的解释。在本论文我们的目的即是在前人工作的基础上，分别选 取具有特殊结构的阳离子表面活性荆、无毒易生物降解的非离子糖基表面活性剂，两性 中国日用化学工业研究院研究生论文敬登伟 表面活性剂以及阳离子非离子复配体系，对这些表面活性剂体系与d n a 相互作用进行 从宏观层面到到微观层面的考察，并分别以相行为、荧光光谱法、表面张力、平衡渗析、 透射电镜等方法进行了研究，以期获得d n a 与表面活性剂相互作用分子水平的信息， 并得出其中规律性的因素，从而为今后寻找理想的、可以用来进行d n a 高效转染的表 面活性剂提供理论依据。 综上所述，本论文的研究内容主要集中在一下几个方面： 1 ) 论文开始之前的试探性工作中，我们已经发现非离子糖基表面活性剂烷基多苷 ( a p g ) 系列可以和d n a 发生较强的相互作用，其强度远强于一般的聚氧乙烯型非离 子表面活性剂，同样是头基不带电的非离子表面活性剂二者与d n a 相互作用却有明显 的差异，考虑到a p g 其它一些独特性质以及其优良的生物降解性和无生理毒性等特点 我们决定采用相关的研究方法对其进行研究 2 ) 阳离子表面活性剂与d n a 之间的相互作用机理尚未得到圆满的解释，但已经知 道阳离子表面活性剂大多存在不可避免的细胞毒性及较高的水溶性导致其与d n a 形成 的复合物在转染过程中易于解离，本论文中，考虑使用c t a b a p g 混合体系，并以相行 为为基础对其与d n a 的相互作用进行研究，一方面可以考察混合体系是否比c t a b 具 有更高的转染效率，另一方面，对a b ，a p g 与单独c r a b 二体系进行对比研究可以获 得c t a b 乃至以其为代表的大多数阳离子表面活性剂与d n a 相互作用的规律性因素， 进而推出二者相互作用机理。 3 ) 用不同头基的阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵和十六烷基三乙基溴化 铵考察二者与d n a 相互作用的异同点，从而考察阳离子头基大小对其与d n a 相互作用 的影响。 4 ) 采用阳离子月 离子表面活性剂体系是我们的一个工作重点，但可以想象两种表面 活性剂的同时加入使得体系中组分增加，相应需要考察的因素也增多，这也无形中增加 了实验难度，并对实验设计的精度要求更高。比如在对不同比例阳离子非离子表面活性 剂体系研究时 彳艮难控制各比例条件下所配溶液其它条件保持一致，对考察复配比例对体 系内相互作用的影响存在干扰。为此，我们选用了另一优良的表面活性剂品种两性 表面活性剂对其与d n a 之间的相互作用进行研究。已经