（光学工程专业论文）红外和近红外分光法及其在蛋白分子研究中的应用.pdf

摘要 红外和近红外分光法及其在蛋白分子研究中的应用 摘要 红外和近红外分光法的优点在于，能够直观地获取分子振动的 光谱信息，并且对任何样品在任何状态下都能检测，它们作为无损、 快速的分析方法已经被广泛地应用于生物、医学等领域。为了更好 地利用红外和近红外光谱研究蛋白分子的结构和特性，人们不断地 提m 新的实验手段和光谱分析方法，但是仍然存在一些难题没有很 好地解决，特别是溶液中蛋白分子的二级结构、水合作用及其动力 学过程还有待进一步阐明。此外，虽然分子振动理论早已完善，但 是随着计算机技术的发展，利用分子振动理论与计算机辅助相结合 解析分子振动状态的研究工作也有必要进一步完善。 本论文利用红外和近红外光与分子相互作用的理论，通过对加 热导致的溶液中蛋白分子的变性过程的分析，对溶液中蛋白分子的 二二级结构、水合作用及其热动力学特性进行了详细的研究。在研究 中，采用了计算机辅助分子振动分析、光谱解析和光谱实验相结合 的手段。首先，利用分子振动理论与计算机辅助相结合，系统地研 究了分子的振动状态并总结了其规律；其次，在实验上通过对溶液 中蛋白分子的热动力学红外和近红外光谱的检测和解析，研究了蛋 白分子的二级结构、水合作用及其热动力学过程；再次，在参与分 光光度计项目研究的基础上，对红外和近红外光谱实验方法和实验 装置进行了研究。 l 在本论文中，所完成的研究工作和取得的研究结果概要如f ： ( 1 ) 分予振动理论方面：从经典和量子力学理论的角度对 分子振动理论进行了阐述。利用分子振动理论与计算机辅助相结 合研究了不同结构分子的振动状态，特别模拟了分子的内坐标力常 数对分子振动基频的影响，为分子光谱实验和光谱解析提供了指导。 ( 2 ) 在红外分光法对重水溶液中b s a 的研究中，主要利用酰 胺i 谱带解析了蛋白分子在重水溶液中的二级结构及其热动力学过 程，不同的分析方法所获得的结果为：二阶导数光谱和曲线拟合 用于分离来源于不同二级结构的谱带。在2 6o c 时，b s a 的二二级结 构含有6 2 5 4 的a 一螺旋、2 9 1 1 的口一链、7 7 6 的口一转角以及 不含一片层；在9 0 时，含有1 8 2 0 的a 一螵旋、3 i 5 3 的疗一 链、2 5 1 1 的卢一转角、1 9 7 0 的箩一片层和5 4 6 的无规卷曲。结 果表明，在升温过程中，二级结构的变化表现为：麒一螺旋的减少不 仅仅伴随着一片层的形成，而且还伴随着口一转角的增加和无规卷 曲的形成。相关性分析和渐进因子分析( e v o l v i n gf a c t o ra n a l y a i s ， e f a ) 用于解析重水溶液中蛋白分子二级结构变化的热动力学特性。 它们的结果均表明，在升温过程中，b s a 的显著结构变化发生在温 度区间7 0 - 8 2o c 。此外，三因子渐进因子分析的结果, n ) j i ，加热导 致的重水溶液中b s a 的结构变化发生在两个温度区域5 6 7 0o c 和7 0 - 8 2 ，其中5 6 7 0 0 c 的结构变化比较徽小，仅表现为一片层 的形成，而7 0 - 8 2 。c 附近的结构变化表现为声一片层和声一转角的增 加以及无规卷曲的形成。二维相关光谱用于解析不同二二级结构之 摘要 问在加热过程中的相关性变化。同步相关光谱的结果显示，在加热 过程中0 c 一螺旋与一片层和卢一转角之间有很强的协同变化，这表 明d 一螺旋的减少导致了卢一片层和声一转角的增加。异步相关光谱 的结果显示，在加热过程中，最早发生变化的是反一螺旋结构，口一 片层结构的变化要早于芦一转角、卢一链、无规卷曲的变化。 ( 3 ) 在近红外分光法列水溶液中b s a 的研究中，7 5 0 0 5 5 0 0 c m j 和4 9 0 0 4 2 0 0c m 1 两个光谱区域分别用于研究b s a 在溶液中的 水合作用和二级结构，所获得的结果为：水溶液中b s a 的温度 相关差光谱在光谱区问7 2 0 0 6 6 0 0c m l 的光谱强度变化显示了由于 加热引起的b s a 水合作用的变化。b s a 水溶液中的水分子可以分为 自由水和束缚水两类，自由水具有与纯水相近的结构，而束缚水在 加热过程中会从蛋白分子的表面移去而成为自由水。水溶液中b s a 的水合作用的热动力学过程变化表现为溶液中束缚水向自由水的转 化。水溶液中b s a 的温度相关差光谱在光谱区问4 6 5 0 4 5 0 0c m l 的光谱强度变化显示了由于加热引起的b s a 二级结构的变化。随着 温度的升高，4 6 0 0c m 。附近吸收峰的强度变小并且略向高波数移动， 表明b s a 二级结构中吐一螺旋的减少和氢键作用对n i t 键的影响减 小了；在高温时，一个新的肩峰在4 5 3 0c m j 附近出现，表明b s a 一二级结构中形成了声一片层，这证实了4 6 0 0c m - 1 附近的谱带可用于 蛋白分子二级结构检测的可能性。相关性分析和渐进因子分析用 于解析水溶液中b s a 的结构和水合作用的热动力学特性。在加热过 程中，b s a 水台作用的剧烈变化发生在7 3o c 附近，而b s a 结构 的剧烈变化发生在7 1 。c 附近，即水溶液中b s a 的结构变化发生在 水合作用之前，换旬话说，蛋白分子的显著水合作用的变化是由于 ：二级结构的改变引起的。 ( 4 ) 在红外和近红外光谱的实验方法和实验装置的研究方面： 对目前的红外和近红外分光光度计中所使用的光源、检测器、分 光系统进行了归纳和总结。针对光栅色散式的分光光度计中的光 谱级次重叠问题，提出了一种新的光谱纯净方法，根据该方法设计 的滤光片能够满足全谱并行测量的要求，适用于超快速光谱分析的 碰用。结合计算机和网络技术，提出了具有远程访问功能分光光 度计的设想，这一功能已在自主开发的分光光度计中得以应用，远 程功能在一定程度上扩大了分光光度计的使用空间范围。提出了 一种用于溶液样品和微量液体的近红外光谱测量的毛细管法，通过 孑采用常规的近红外样品池所获得的光谱进行比较，证实了毛细管 法的可靠性。毛细管法具有节省样品、便于取样、不需清洗样品池 等优点，这使得它能够适用于生物医学上的应用研究。 奉论文的研究工作，在计算机辅助研究分子振动状态方面进行 了有益的探索，对溶液中蛋白分子的二级结构、水合作用及其热动 力学特性进行了总结并获得了对它们的新的认识，提出了红外和近 红外光谱的实验方法和实验装置的新的设计。研究结果不仅对分子 振动的理论研究提供了新的思路，而且对于红外和近红外分光法对 蛋白分子的应用研究具有一定的参考价值。论文中所提出的观点以 及创新性归纳如下： 摘耍 首次将渐进因子分析引入到对蛋白分了的红外和近红外光 谱解析当中，并论证了它是解析动力学过程的有力工具。 在利用近红外分光法研究蛋白分子的水合作用中，论证了加 热导致的蛋白分子水合作用的变化机理实质上是溶液中自由水和束 缚水之间的转化。 利用二维相关光谱解析温度扰动的蛋白分子动态光谱，获得 了升温过程中蛋白分子2 2 级结构的变化次序为：。【一螺旋一口一片 层一声一转角、卢一链、无规卷曲。 关键词：红外，近红外，分光法，蛋白分子，二级结构，水合作用 摘要 i n f r a r e da n dn e a r - i n f r a r e d s p e c t r o s c o p ya n di t sa p p l i c a r r i o n i nt h es t u d y o fp r o t e i nm o l e c ul e a b s t r a c t t h e a d v a n t a g e s o fi n f r a r e d f i r ) a n dn e a r - i n f r a r e d ( ：n 破) s p e c l r o s c o p ya r et h a tt h ei n f o r m a t i o no nm o l e c u l a rv i b r a t i o n sc a nb e o b t a i n e dd i r e c t l ya n dv i r t u a u ya n ys a m p l ei nv i r t u a l l ya n ys t a t ec a l lb e s t u d i e d a sar a p i da n dn o n - d e s t r u c t i v ea n a l y t i cm e t h o d ，i ra n dn q _ r s p e c 仃o s c o p yh a sb e e nw i d e l ya p p l i e di nt h ef i l e d so fb i o l g y , m e d i c i n e a n ds oo n i no r d e rt oe m p l o yi ra n dn q rs p e c t r o s c o p y t os t u d yt h e s t r u c t u r ea n dc h a r a c t e ro fp r o t e i nm o r ee f f e c t i v e l y , n e w e x p e r i m e n t a l m e t h o d sa n dn e w s p e c t r a la n a l y s i sm e t h o d sa r ep r o p o s e dc o n s t a n t l y b u t t h e r es t i l le x i s t ss o m eu n s o l v e d q u e s t i o n si nt h i s f i e l d e s p e c i a l l y , s e c o n d a r ys t r u c t u r e ，h y d r a t i o na n dt h e i rd y n a m i c so fp r o t e i ni nt h e s o l u t i o nn e e dt ob ei l l u m i n a t e dm o r ep r e c i s e l y a d d i t i o n a l l y , a l t h o u g h t h et h e o r yo fm o l e c u l a rv i b r a t i o nh a sb e e ni n t e g r a t e df o ra l o n gt i m e ，i t i ss t i l l n e c e s s a r yt oc a r r yo u tt h es t u d yo fm o l e c u l a rv i b r a t i o n sb v 6 摘要 c o m b i n a t i o no fm o l e c u l a rv i b r a t i o nt h e o r ya n d c o m p u t e r - a s s i t a n t a n a l y s i sw i t ht h ed e v e l o p m e n to fc o m p u t e rs c i e n c e b a s e do nt h et h e o r yo fi n t e r a c t i o n so fi ra n dn 1 rr a d i a t i o n sw i t h m o l e c u l e ，s e c o n d a r ys t r u c t u r e ，h y d r a t i o na n dt h e r m a ld y n a m i c so f p r o t e i n i nt h es o l u t i o nw e r es t u d i e di nd e t a i l b ya n a l y z i n gt h e h e a t i n d u c e dd e n a t u r a t i o no fp r o t e i ni nt h es o l u t i o ni nt h i sd i s s e r t a t i o n c o m p u t e r - a s s i s t a n ta n a l y s i so fm o l e c u l a rv i b r a t i o n s ，s p e c t r a la n a l y s i s a n ds p e c t r a l e x p e r i m e n tw e r ea l le m p l o y e di nt h e s t u d y f i r s t l y , m o l e c u l a rv i b r a t i o n a ls t a t e sw e r es t u d i e d s y s t e m a t i c a l l yb yu s i n gt h e m e t h o do f c o m b i n i n g m o l e c u l a rv i b r a t i o n t h e o r y w i t h c o m p u t e r - a s s i s t a n ta n a l y s i s s e c o n d l y , s e c o n d a r ys t r u c t u r e ，h y d r a t i o n a n dt h e r m a ld y n a m i c so fp r o t e i nm o l e c u l ew e r es t u d i e db ym e a s u r i n g a n da n a l y z i n gt h et e m p e r a t u r e d e p e n d e n ti ra n dn rs p e t r ao fp r o t e i n i nt h e s o l u t i o n s t h i r d l y , c o r r e s p o n d i n ge x p e r i m e n t a lm e t h o d sa n d e q u i p m e n t sw e r ei n v e s t i g a t e do nt h ep a r t i c i p a t i o ni nt h es t u d yi t e mo f s p e c t r o p h o t o m e t e r t h es t u d yw o r ka n dr e s u l t si nt h ed i s s e r t a t i o na r es u m m a r i z e da s f o l l o w i n g ： ( 1 ) i nt h et h e o r yo fm o l e c u l a rv i b r a t i o n ：t h ec l a s s i ca n d q u a n t u mt h e o r i e so fm o l e c u l a rv i b r a t i o nw e r e e x p a t i a t e df i r s t m o l e c u l a rv i b r a t i o nw a s s t u d i e di nt h ea s s i s t a n c eo f c o m p u t e r e m p h a t i c a l l y , t h ee f f e c t so ff o r c ec o n s t a n t so fi n t e r n a lc o o r d i i l a t e st o 7 摘要 v i b r a t i o n a lf u n d a m e n t a lf r e q u e n c yw e r ei n v e s t i g a t e d ，w h i c h i s i n s t r u c t i v et oi ra n dn i rs p e c t r a le x p e r i m e n ta n ds p e c t r a la n a l y s i s ( 2 ) i nt h ei rs p e c t r o s c o p i cs t u d yo fb s ai nd 2 0s o l u t i o n ，a m i d ei b a n dw a sm o s t l yu s e dt o a n a l y z e t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r ea n d t h e r m o d y n a m i c s o f p r o t e i n t h e r e s u l t so b t a i n e df r o md i f l b r e n t a n a l y t i c a lm e t h o d sa l e ：s e c o n d a r yd e r i v a t i v ea n dc u r v ef i t t i n gw e r e e m p l o y e d t o s e p a r a t e t h eb a n d s a r i s i n g f r o mv a r i o u s s e c o n d a r y s t r u c t u r e s s e c o n d a r y s t r u c t u r eo fb s ac o n t a i n s6 2 5 4 0 【一h e l i x 2 9 11 p s t r a n d ，7 7 6 p t u r na n dz e r op s h e e ta tt h et e m p e r a t u r e o f 2 6 。c ，w h i l e i tc o n t a i n s1 8 2 0 a h e l i x ，3 1 5 3 b s t r a n d ，2 5 1 1 p t u r n , 1 9 7 0 p s h e e ta n d5 4 6 r a n d o mc o i la tt h et e m p e r a t u r eo f 9 0 。c ，w h i c hi n d i c a t e st h a tt h ec h a n g eo fs e c o n d a r ys t r u t u r ei nt h e t e m p e r a t u r ee l e v a t i o ni st h ed r o po f a h e l i xn o to n l yw i t ht h e t b r m a t i o no fb s h e e tb u ta l s ow i t ht h em c r e a s eo f6 一t u r na n dt h e f o r m a t i o no fr a n d o mc o i l c o r r e l a t i o na n a l y s i sa n de v o l v i n gf a c t o r a n a l y s i s ( e f a ) w e r ee m p l o y e dt os t u d yt h e r m a ld y n a m i c so fv a r i a t i o n s o fs e c o n d a r ys t r u c t u r eo f p r o t e i ni nd 2 0s o l u t i o n t h er e s u l t sf r o mb o t h r e v e a lt h a tt h em a r k e dc h a n g e so fs t r u c t u r eo fb s ai nt h et e m p e r a t u r e e l e v a t i o no c c u rj u s ta tt h et e m p e r a t u r er a n g eo f7 0 8 2o c f u r t h e r m o r e ， t h er e s u l tf r o mt h r e e f a c t o re f ai n d i c a t e st h a th e a t i n d u c e d s t r u c t u r a l v a r i a t i o n so f b s ai nd 2 0s o l u t i o nt a k ep l a c ea tt w ot e m p e r a t u r er a n g e s ： 5 6 - 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r a p i ds p e c t r a la n a l y s i s c o m b i n e dw i t h c o m p u t e ra n dn e t w o r kt e d m u l o g i e s ，t h ei d e ao ft t l e s p e c t r o p h o t o m e t e rw i t ht h ef t m c t i o no fr e n i u c ca c c e s sw a sp r o p o s e da n d t h i sf m l c t i u l lh a sb e e nr e a l i z e di i l t h es p e c t r o p h o t o m e t e r , w h i c hw a s d e v e l o p e db yo u l - g r o u p h is o i i i ee x t e n t , t h ef u n c t i o no fr e m o t ea c c e s s e n l a r g e sf i l es p a c er a n g e ，i t lw l t t l ；1 t lt h es p e c t r o p h o t o m e t e rc 出lb cu s c d ac a p i l l a r yt u b em e t h o df o rm e a s u r i n gn i rs p e c t r ao fm i c r o i i t e r l i q u i da n ds o l u t i o ns a m p l e si sp r o p o s e u it i ec o m p a r i s o no ft h es p e c t r a o b t a i n e db yu s i n gc a p i l l a r yt u b ea n d q u a r t zc e l lp r o v e sr i t er e l i a b i l i t yu f t i 6 si i l e l 【, t u 1 “il i ec a p m m yt u b ei i l c i i l o dh a st i l e a d v 址l r a g e so fs a v h i g s a m p l e ，c o n v e n i e n t l ys a m p l i n ga n dn o tc l e m t h i gt l t ec c l l f l # 。c s s a r i i v ， w h i c hm a k e si ts u i t a b l et ob ea p p l i e di nt h eb i o l o g ya n d m e d i c i n e i nt i f f sd i s s e r t a t i o n , f i l eh e l p f u li n v e s t i g a t i o n sh a v cb e e t ld o n ct u l c u o m p u i e l 二- a s s i s i m t ts t u d yu f 埘i e c u i a rv i b r a t i o n ，i i e wi n s i g h t st l h v e ，b e e i l g i t h t e dh a os e c o n d a r y s t r u c t u r e ，h y d r a t i o nm l dt h e n n a ld y n m n i c su f p r o t e h li ai h es o l l u 4 t i o n ，m i dn o v e ld e s i g n sh a v cb e e n p r ) p u s c dt o1 1 l ci r a n dn q re x p e l i n i e n t a ln l e l u d sa i l d e q u i p n l c u b , - 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i n f r a r e d ，s p e c t r o s c o p y , p r o t e i n ，h y d f a t i o n ， s e c o n d a r ys t r u c t u r e i ：海交通人学乏! 一：位论文答辩决议扣 r p 清者l | 寝i 吱 i l f 诉在。? ： t0 、 i 7j l i t i j j # 1 i 群 h 定题| i红外和近引讣分觅法及j i 在筮 分；融究r ，照；” | 眷辩日1 i j g o ! i s0 1 旧| f躺地点 1 淌娴太毫嚣蚓鳓酶 答辩蚕昴会战爨 ； 任职务i i 娥名 职称所在丁作币豫 l 箍往签名 l 海理【人学) 乜披术 舷避 f主席| i 陈家壁 教授 儿 ；f 究橱i l 釜受| l 曾庄琪 救援上海交通大学物理r 系龙 湾傀谬 | 漤员l l 徐文尔 研究员 i 海龙机所 无 5 舻n 咤 i 委受l | 摸鲫鸟 教授上海交通大学物理系光学正 锄列i i r 程研究所 i 委员0 黄维寓